細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)課件

細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)1（優(yōu)選）細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)（優(yōu)選）細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)2固液分析技術(shù)固液分析技術(shù)3過濾過濾就是利用多孔性介質(zhì)截留固液懸浮物中的固體顆粒，從而實現(xiàn)固液分離的方法。深層過濾濾餅過濾濾餅阻力主要由菌種和發(fā)酵條件決定過濾過濾就是利用多孔性介質(zhì)截留固液懸浮物中的固體顆粒，從而實4改善過濾性能的方法過濾操作的兩個目標(biāo)加快過濾速率、提高過濾質(zhì)量。絮凝助濾劑反應(yīng)劑酶解改善過濾性能的方法過濾操作的兩個目標(biāo)加快過濾速率、提高過濾質(zhì)5過濾設(shè)備及選擇依據(jù)推動力；常壓過濾機、加壓過濾機、真空過濾機依據(jù)設(shè)備構(gòu)造板框壓濾機、鼓式真空過濾機、加壓葉濾機過濾設(shè)備及選擇依據(jù)推動力；6微濾微濾是一種以多孔細(xì)小薄膜為過濾介質(zhì)，以壓差為推動力，使不溶物質(zhì)濃縮過濾的操作。微濾分離過程的三階段。影響分離速率的因素主要有操作形式、流速、壓力和料液濃度。微濾技術(shù)有著廣泛應(yīng)用和眾多的優(yōu)點。微濾微濾是一種以多孔細(xì)小薄膜為過濾介質(zhì)，以壓差為推動力，使不7微濾的操作模式無流動操作模式和錯流過濾操作模式微濾的操作模式無流動操作模式和錯流過濾操作模式8微濾設(shè)備板框式膜過濾器管式膜過濾器中空纖維式膜分離器螺旋卷式膜分離器微濾設(shè)備板框式膜過濾器9離心技術(shù)一、離心分離的基本原理二、離心機的類型三、離心方法四、離心條件的確定五、影響離心效果的主要因素與控制離心技術(shù)一、離心分離的基本原理10差速離心是指采用不同的離心速度和離心時間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法。而過濾可獲得的水分含量較低的濾餅。機理：高于20kHz的超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用，空穴由于超聲波的沖擊而產(chǎn)生和閉合，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。5×104rpm，相對離心力104～105g，用于細(xì)胞碎片、較大細(xì)胞器、大分子沉淀物等分離；適用于酵母和多數(shù)細(xì)胞的破碎濾餅阻力主要由菌種和發(fā)酵條件決定常壓過濾機、加壓過濾機、真空過濾機原理利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性一、離心分離的基本原理細(xì)胞破碎和雙水相萃取技術(shù)結(jié)合板框壓濾機、鼓式真空過濾機、加壓葉濾機細(xì)胞于高滲介質(zhì)中，脫水達到平衡后，迅速將其轉(zhuǎn)置于低滲透壓的水或緩沖液中，水進入細(xì)胞使胞壁和胞膜破裂上部兩側(cè)有重液相和輕液相出口(對液液分離而言)。然后再沿管壁滑向管底，一、離心分離的基本原理B、有效能量的利用率低；優(yōu)點：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好；缺點：與過濾設(shè)備相比，設(shè)備投資高、能耗大、離心產(chǎn)生的固體濃縮物和過濾產(chǎn)生的濃縮不同。通常情況下離心只能得到一種較為濃縮的懸浮液或漿體。而過濾可獲得的水分含量較低的濾餅。離心分離差速離心是指采用不同的離心速度和離心時間，使不同沉降速度的顆11離心的原理對于濃度較小，粒徑較大，硬度較強的不溶物，可以采用過濾分離。但當(dāng)固體顆粒細(xì)小而難以過濾時，發(fā)酵液不易被過濾純化，離心操作往顯得十分有效。離心分離是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。離心的原理對于濃度較小，粒徑較大，硬度較強的不溶物，可以采用12細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)課件13差速離心差速離心14離心機的類型據(jù)分離方式分沉降式離心機、過濾式離心機據(jù)操作方式分間歇式(分批)離心機、連續(xù)式離心機據(jù)轉(zhuǎn)速分常速離心機（低速離心機）、高速離心機、超速離心機據(jù)設(shè)備結(jié)構(gòu)特點分管式、蝶式、螺旋式……離心機的類型據(jù)分離方式分沉降式離心機、過濾式離心機15按速度和離心力：1、常速離心機最大轉(zhuǎn)速8000rpm(r/min)，相對離心力(RCF)104g以下，用于細(xì)胞、菌體和培養(yǎng)基殘渣等分離；2、高速（冷凍）離心機1×104～2.5×104rpm，相對離心力104～105g，用于細(xì)胞碎片、較大細(xì)胞器、大分子沉淀物等分離；3、超速離心機轉(zhuǎn)速2.5～8×104rpm，相對離心力5×105g；用于DNA、RNA蛋白質(zhì)、細(xì)胞器、病毒分離純化；檢測純度；沉降系數(shù)和相對分子量測定等。離心機的種類與用途按速度和離心力：離心機的種類與用途16G-的酶溶更受到了限制沉降系數(shù)和相對分子量測定等。層析柱對形成穩(wěn)定的膨脹床有很大影響，其底部和上部分別有一個液體分布器和床層調(diào)節(jié)器。這是近年來開發(fā)的機型，它和相同直徑的活塞機相似，其速度可增加23%~30%,可用于酶制劑，疫苗和胰島素等生產(chǎn)中分離物的澄清。過濾就是利用多孔性介質(zhì)截留固液懸浮物中的固體顆粒，從而實現(xiàn)固液分離的方法。是生物工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的一種離心機（2）離心時間和K因子轉(zhuǎn)子活動管套內(nèi)的離心管，靜止時垂直掛在轉(zhuǎn)頭上，旋轉(zhuǎn)時隨著轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動，從垂直懸吊上升到水平位置（約200—800rpm）。噴嘴排渣的碟片離心機當(dāng)固體顆粒含量較多時，可采用具有噴嘴排渣的碟式離心沉降機。是生物工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的一種離心機微濾技術(shù)有著廣泛應(yīng)用和眾多的優(yōu)點?！魧τ诔Ｋ匐x心機和高速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和離心時間，就能達到分離效果；這種溶質(zhì)稱為梯度介質(zhì)。D、不易放大，僅應(yīng)用于實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎。◆而對于超速離心，則可以根據(jù)需要采用差速離心、密度梯度離心或等密梯度離心等方法。細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)適用于酵母和多數(shù)細(xì)胞的破碎沉降系數(shù)和相對分子量測定等。受振動和變速攪亂后對流現(xiàn)象小，離心方法◆對于常速離心機和高速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和離心時間，就能達到分離效果；◆如果希望從樣品液中分離出2種以上大小和密度不同的顆粒，需要采用差速離心方法?！舳鴮τ诔匐x心，則可以根據(jù)需要采用差速離心、密度梯度離心或等密梯度離心等方法。G-的酶溶更受到了限制離心方法◆對于常速離心機和高速離心機，17大容量冷凍離心機大容量冷凍離心機18據(jù)設(shè)備結(jié)構(gòu)特點分1斜角式2平拋式3管式4蝶片式5螺旋式6多室式據(jù)設(shè)備結(jié)構(gòu)特點分1斜角式19斜角式離心機是一類結(jié)構(gòu)最簡單的實驗室常用離心機，指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)子；角度越大，沉降越結(jié)實，分離效果越好，角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離效果差。顆粒在角轉(zhuǎn)子中沉降時，先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)會出現(xiàn)顆粒沉積。斜角式離心機20細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)課件21

平拋式離心機平拋式離心機一類結(jié)構(gòu)簡單的實驗室常用的低中速離心機，轉(zhuǎn)速一般在3000-6000rpm。轉(zhuǎn)子活動管套內(nèi)的離心管，靜止時垂直掛在轉(zhuǎn)頭上，旋轉(zhuǎn)時隨著轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動，從垂直懸吊上升到水平位置（約200—800rpm）。顆粒在水平轉(zhuǎn)子中的沉降是沿管子軸向移動。樣品便于收集受振動和變速攪亂后對流現(xiàn)象小，但轉(zhuǎn)頭結(jié)構(gòu)復(fù)雜，最高轉(zhuǎn)速相對要低容量也小一些。

平拋式離心機22平拋式離心機轉(zhuǎn)子平拋式離心機轉(zhuǎn)子23管式離心機具有一個細(xì)長而高速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)鼓，轉(zhuǎn)鼓內(nèi)裝有縱向平板，其下部有進料口。上部兩側(cè)有重液相和輕液相出口(對液液分離而言)。分為液液分離的連續(xù)式管式離心機和液固分離的間歇式管式離心機。管式離心機管式離心機具有一個細(xì)長而高速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)鼓，管式離心機241）滲透壓沖擊法（osmoticshock）碟片間的距離一般為0.常用的梯度介質(zhì)有蔗糖、甘油等。增加裝珠量、延長破碎時間、提高轉(zhuǎn)速等手段可提高破碎率是在管式離心機的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，在轉(zhuǎn)鼓中加入了許多重迭的碟片，縮短了顆粒的沉降距離，提高了分離效率。這種溶質(zhì)稱為梯度介質(zhì)。過濾操作的兩個目標(biāo)加快過濾速率、提高過濾質(zhì)量?！魧τ诔Ｋ匐x心機和高速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和離心時間，就能達到分離效果；對于間歇操作式，須定時拆卸、清洗◆對于常速離心機和高速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和離心時間，就能達到分離效果；靠擋板分布于鼓的四周，并使料液迅速達到與轉(zhuǎn)鼓相同的角速度。一、離心分離的基本原理增加裝珠量、延長破碎時間、提高轉(zhuǎn)速等手段可提高破碎率而過濾可獲得的水分含量較低的濾餅。受振動和變速攪亂后對流現(xiàn)象小，優(yōu)點減少操作步驟、提高產(chǎn)品收率、降低純化費用和資本投入。然后再沿管壁滑向管底，利用超臨界CO2做介質(zhì)，高壓CO2易于滲透到細(xì)胞內(nèi)。適用于酵母和多數(shù)細(xì)胞的破碎通常情況下離心只能得到一種較為濃縮的懸浮液或漿體。因此管的一側(cè)會出現(xiàn)顆粒沉積。液液分離管式離心機液固分離管式離心機1）滲透壓沖擊法（osmoticshock）液液分離管式離25液固分離管式離心機待處理的物料在一定壓力（3×104Pa左右）下由進料管經(jīng)底部空心軸進入鼓內(nèi)，靠擋板分布于鼓的四周，并使料液迅速達到與轉(zhuǎn)鼓相同的角速度。轉(zhuǎn)鼓帶動物料高速旋轉(zhuǎn)，在離心力下，懸浮液沿轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁向上流動的，料液在離心力場的作用下因其密度差的存在而分離。澄清后的液相流動到轉(zhuǎn)鼓上部的排液口排出。比重大的固體微粒逐漸沉積在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁形成沉渣層，達到一定數(shù)量后，停機人工清除。液固分離管式離心機待處理的物料在一定壓力（3×104Pa左26管式離心機特點結(jié)構(gòu)簡單，可提供較大離心力，轉(zhuǎn)速高，效果好。管狀離心機可以冷卻，有利蛋白質(zhì)分離對于間歇操作式，須定時拆卸、清洗適用于分離乳濁液及含細(xì)顆粒的稀懸浮液，適用于固體含量低于1%，顆粒度小于5微米，黏度大的懸浮液澄清或固液兩相密度差較小的分離。管式離心機特點27碟片式離心機是在管式離心機的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，在轉(zhuǎn)鼓中加入了許多重迭的碟片，縮短了顆粒的沉降距離，提高了分離效率。是生物工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的一種離心機有一個密封的轉(zhuǎn)鼓，內(nèi)裝十至上百個錐頂角為60100゜錐形碟片。碟片間的距離一般為0.52.5mm。碟片式離心機是在管式離心機的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，在轉(zhuǎn)鼓中加入了28細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)課件29碟片式離心機工作原理當(dāng)懸浮液在動壓頭的作用下，經(jīng)中心管流入高速旋轉(zhuǎn)的碟片之間的間隙時，便產(chǎn)生了慣性離心力，其中密度較大的固體顆粒在離心力作用下向上層碟片的下表面運動，而后在離心力作用下被向外甩出，沿碟片下表面向轉(zhuǎn)子外圍下滑，而液體則由于密度小，在后續(xù)液體的推動下沿著碟片的隙道向轉(zhuǎn)子中心流動，然后沿中心軸上升，從套管中排出，達到分離的目的碟片式離心機工作原理當(dāng)懸浮液在動壓頭的作用下，經(jīng)中心管流入高30碟片式離心機類型人工排渣的碟片離心機碟片上不開孔，只有一個清液排出口。沉積在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁上的沉渣，間歇排出。只適用于固體顆粒含量很少的懸浮液。噴嘴排渣的碟片離心機當(dāng)固體顆粒含量較多時，可采用具有噴嘴排渣的碟式離心沉降機。在有特殊形狀內(nèi)壁的轉(zhuǎn)鼓壁上開設(shè)若干噴嘴活門（活塞）排渣的碟片離心機這是近年來開發(fā)的機型，它和相同直徑的活塞機相似，其速度可增加23%~30%,可用于酶制劑，疫苗和胰島素等生產(chǎn)中分離物的澄清。碟片式離心機類型人工排渣的碟片離心機31螺旋卸料沉降離心機有立式和臥式兩種臥螺機是一種全速旋轉(zhuǎn)，連續(xù)進料，分離和卸料的離心機。最大離心力強度可達6000rpm操作溫度可達300℃操作壓力一般為常壓常用于胰島素，細(xì)胞色素，胰酶等的分離。螺旋式離心機螺旋卸料沉降離心機螺旋式離心機32螺旋式離心機工作原理轉(zhuǎn)鼓與螺旋輸送器以一定差速同向高速旋轉(zhuǎn)(后者慢)，懸浮液通過螺旋輸送器的空心軸進入機內(nèi)中部，由進料管連續(xù)引入螺旋內(nèi)筒，加速后進入轉(zhuǎn)鼓。在離心力場作用下，固相物沉積在轉(zhuǎn)鼓壁上形成沉渣層。輸料螺旋將沉積的固相物連續(xù)不斷定推至轉(zhuǎn)鼓錐端，經(jīng)排渣口排出機外，較輕的液相物則形成內(nèi)層液環(huán)，由轉(zhuǎn)鼓大端溢流口連續(xù)溢出轉(zhuǎn)鼓，經(jīng)排液口排出機外。螺旋式離心機工作原理轉(zhuǎn)鼓與螺旋輸送器以一定差速同向高速旋轉(zhuǎn)(331、差速離心2、密度梯度離心3、等密梯度離心離心方法離心方法341、差速離心

差速離心是指采用不同的離心速度和離心時間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法。

※1、差速離心352、密度梯度離心（1）定義密度梯度離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)分離的一種區(qū)帶分離方法。（2）梯度介質(zhì)為了使沉降系數(shù)比較接近的顆粒得以分離，必須配制好適宜的密度梯度系統(tǒng)。密度梯度系統(tǒng)是在溶劑中加入一定的溶質(zhì)制成的。這種溶質(zhì)稱為梯度介質(zhì)。常用的梯度介質(zhì)有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系統(tǒng)，其適用范圍是蔗糖濃度5～60%，密度范圍1.02～1.30g/cm3?！?、密度梯度離心36（3）不同密度梯度條件下物質(zhì)的分離離心后形成不同大小不同形狀、具有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度溶液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。（3）不同密度梯度條件下物質(zhì)的分離離心后形成不同大小不同形狀37密度梯度離心法密度梯度離心法38（4）密度梯度的制備密度梯度一般采用密度梯度混合器進行制備?！裘芏忍荻然旌掀饔少A液室、混合室、電磁攪拌器和閥門等組成，如圖。（4）密度梯度的制備密度梯度一般采用密度梯度混合器進行制備。39※密度梯度混合器密度梯度混合器40（4）所形成密度梯度的類型制備得到的密度梯度可以分為線性梯度、凹形梯度和凸形梯度等?！?）所形成密度梯度的類型制備得到的密度梯度可以分為線性梯度41（5）密度梯度的形成

兩種不同濃度的溶液（蔗糖溶液）以不同比例混合形成?！?）密度梯度的形成423、等密度梯度離心

當(dāng)欲分離的不同顆粒的密度范圍處于離心介質(zhì)的密度范圍內(nèi)時，在離心力的作用下，不同浮力密度的顆?；蛳蛳鲁两?，或向上飄浮，只要時間足夠長，就可以一直移動到與它們各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度點），形成區(qū)帶。這種方法稱為等密梯度離心，或稱為平衡等密度離心。

※3、等密度梯度離心43五、影響離心效果的主要因素與控制1、樣品的理化性質(zhì)2、離心分離設(shè)備3、離心條件的選擇（1）離心力和相對離心力（2）離心時間和K因子（3）離心操作溫度五、影響離心效果的主要因素與控制44泡沫是氣體分散在液體中的多相非均勻體。是生物工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的一種離心機一、離心分離的基本原理G-的酶溶更受到了限制機理：高于20kHz的超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用，空穴由于超聲波的沖擊而產(chǎn)生和閉合，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。微濾技術(shù)有著廣泛應(yīng)用和眾多的優(yōu)點。2）凍結(jié)－融化法（FreezingandThawing）據(jù)轉(zhuǎn)速分常速離心機（低速離心機）、高速離心機、超速離心機澄清后的液相流動到轉(zhuǎn)鼓上部的排液口排出。細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)原理利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性◆對于常速離心機和高速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和離心時間，就能達到分離效果；在有特殊形狀內(nèi)壁的轉(zhuǎn)鼓壁上開設(shè)若干噴嘴體系中吸附劑與細(xì)胞、細(xì)胞碎片等組分可能存在相互作用。細(xì)胞破碎和雙水相萃取技術(shù)結(jié)合（1）定義密度梯度離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)分離的一種區(qū)帶分離方法。D、不易放大，僅應(yīng)用于實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎。常用的梯度介質(zhì)有蔗糖、甘油等。機理：高于20kHz的超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用，空穴由于超聲波的沖擊而產(chǎn)生和閉合，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。據(jù)轉(zhuǎn)速分常速離心機（低速離心機）、高速離心機、超速離心機細(xì)胞破碎技術(shù)細(xì)胞破碎的目的使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到不同程度的破壞（增大通透性）或破碎，釋放其中的目標(biāo)產(chǎn)物。機械法非機械法珠磨法、壓榨法高壓勻漿、超聲破碎、撞擊法固體剪切作用液體剪切作用1）酶溶法2）化學(xué)法3）物理法干燥處理溶胞作用超臨界細(xì)胞破碎泡沫是氣體分散在液體中的多相非均勻體。細(xì)胞破碎技術(shù)細(xì)胞破碎的45機械方法破碎1）珠磨法（beadmilling）細(xì)胞懸浮液與極小的研磨劑如玻璃小珠、石英砂等一起高速攪拌，細(xì)胞與研磨劑之間相互碰撞、剪切，使細(xì)胞達到某種程度破碎，釋放內(nèi)含物可采用間歇式或連續(xù)操作珠磨機增加裝珠量、延長破碎時間、提高轉(zhuǎn)速等手段可提高破碎率→總能耗增加且須注意換熱適用于多數(shù)微生物細(xì)胞，esp.有大量菌絲體的微生物（藻類和真菌菌絲）和質(zhì)地堅硬（亞細(xì)胞器）的微生物細(xì)胞機械方法破碎1）珠磨法（beadmilling）細(xì)胞懸浮46高壓勻漿法

破碎原理利用高壓使懸浮液通過針形閥，從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊后，急劇釋放到低壓環(huán)境破碎作用力突然減壓和高速沖撞閥座閥撞擊環(huán)操作參數(shù)少且易于確定，實驗室及工業(yè)生產(chǎn)中均可適用于酵母和多數(shù)細(xì)胞的破碎對易造成堵塞的團狀或絲狀真菌及一些易損傷勻漿閥、質(zhì)地堅硬的亞細(xì)胞器一般不適用高壓勻漿法

破碎原理利用高壓使懸浮液通過針形閥，從閥座與閥之47超聲波破碎機理：高于20kHz的超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用，空穴由于超聲波的沖擊而產(chǎn)生和閉合，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。缺點：A、影響因素多，細(xì)胞種類、濃度和處理時間、探頭材料和形狀；B、有效能量的利用率低；C、產(chǎn)熱大，需控溫；D、不易放大，僅應(yīng)用于實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎。超聲波破碎機理：高于20kHz的超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用，48機械破碎法總結(jié)以上幾種機械破碎法的作用機理不盡相同，有各自的適用范圍（包括菌體細(xì)胞、細(xì)胞發(fā)酵液的特性）和處理規(guī)模（實驗室或工業(yè)用）方法珠磨高壓勻漿超聲破碎使用規(guī)模實驗室、工業(yè)用實驗室、工業(yè)用實驗室適用對象酵母、藻類及絲狀真菌酵母菌、細(xì)菌細(xì)菌機械破碎法總結(jié)以上幾種機械破碎法的作用機理不盡相同，有各自的49細(xì)胞物理破碎方法1）滲透壓沖擊法（osmoticshock）最為溫和的一類細(xì)胞破碎方法，適用于易于破碎的細(xì)胞，eg.動物細(xì)胞和革蘭氏陰性菌。細(xì)胞于高滲介質(zhì)中，脫水達到平衡后，迅速將其轉(zhuǎn)置于低滲透壓的水或緩沖液中，水進入細(xì)胞使胞壁和胞膜破裂2）凍結(jié)－融化法（FreezingandThawing）細(xì)胞急劇凍結(jié)后在室溫緩慢融化，反復(fù)操作多次使細(xì)胞破壞，對于存在于細(xì)胞質(zhì)周圍靠近細(xì)胞膜的胞內(nèi)產(chǎn)物釋放較為有效細(xì)胞物理破碎方法1）滲透壓沖擊法（osmoticshock50化學(xué)法破碎用某些化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分酸堿、某些表面活性劑及脂溶性有機溶劑都可改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇性地滲透出來→化學(xué)滲透法利用酸堿調(diào)pH；有機溶劑甲苯；表面活性劑十二烷基磺酸鈉、TritonX-100；螯合劑乙二胺四乙酸EDTA等優(yōu)點：細(xì)胞外型完整、碎片少、粘度低，料液易澄清A、價格昂貴，引起新的污染；B、一般只有有限的破碎，比機械破碎速度低、效率差，常需與機械法連用?；瘜W(xué)法破碎用某些化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分利用酸51生物法破碎原理利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性溶菌酶lysozyme適用于G＋的細(xì)胞壁，若配合EDTA、TritonX-100則可有效作用于G－的胞壁；真核細(xì)胞需用不同的酶：酵母細(xì)胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖酶；破壞植物細(xì)胞壁需用纖維素酶優(yōu)點：產(chǎn)品釋放的選擇性高、產(chǎn)品破壞少、對溫度及pH等外界條件要求低，不殘留細(xì)胞碎片等，不同的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)決定了需要不同的酶生物法破碎原理利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部52生物法破碎自溶通過調(diào)節(jié)溫度、pH或添加有機溶劑等激活劑，誘使細(xì)胞產(chǎn)生溶解自身酶的方法溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法但其高成本和有限的適用性使該法不可能實現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用，esp.G-的酶溶更受到了限制生物法破碎自溶通過調(diào)節(jié)溫度、pH或添加有機溶劑等激活劑，誘使53超臨界細(xì)胞破碎技術(shù)超臨界流體：溫度和壓力處于臨界條件之上的流體，具有類似于氣體的性質(zhì)（低黏度）和類似于液體的高密度，具有較好的流動性能、傳質(zhì)性能和溶解性能利用超臨界CO2做介質(zhì)，高壓CO2易于滲透到細(xì)胞內(nèi)。突然降壓后，因細(xì)胞內(nèi)外較大的壓差使細(xì)胞急劇膨脹而發(fā)生破裂可破碎細(xì)胞壁較厚的細(xì)胞如酵母甚至對粘稠的酵母漿都有很好的破碎效果超臨界細(xì)胞破碎技術(shù)超臨界流體：溫度和壓力處于臨界條件之上的流54細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)課件55破碎方法的選擇選擇的一般原則A、提取產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，用機械法破碎B、提取產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，用化學(xué)法C、提取產(chǎn)物與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機械法結(jié)合的方法破碎過程中應(yīng)注意的問題A、多種破碎方法相結(jié)合可產(chǎn)生很大優(yōu)勢B、對下游分離技術(shù)的影響：破碎顆粒清除，產(chǎn)物分離純化C、在上游發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過程和環(huán)境對破碎難易程度影響D、菌種的培育及改造，胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物破碎方法的選擇選擇的一般原則破碎過程中應(yīng)注意的問題56胞內(nèi)產(chǎn)物的選擇性釋放細(xì)胞破碎和雙水相萃取技術(shù)結(jié)合利用噬菌體裂解細(xì)胞電脈沖提取法分步、分級提取法胞內(nèi)產(chǎn)物的選擇性釋放細(xì)胞破碎和雙水相萃取技術(shù)結(jié)合57原理利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性這是近年來開發(fā)的機型，它和相同直徑的活塞機相似，其速度可增加23%~30%,可用于酶制劑，疫苗和胰島素等生產(chǎn)中分離物的澄清。（1）定義密度梯度離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)分離的一種區(qū)帶分離方法。層析柱對形成穩(wěn)定的膨脹床有很大影響，其底部和上部分別有一個液體分布器和床層調(diào)節(jié)器。C、提取產(chǎn)物與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機械法結(jié)合的方法沉積在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁上的沉渣，間歇排出。板框壓濾機、鼓式真空過濾機、加壓葉濾機較輕的液相物則形成內(nèi)層液環(huán)，由轉(zhuǎn)鼓大端溢流口連續(xù)溢出轉(zhuǎn)鼓，經(jīng)排液口排出機外。據(jù)轉(zhuǎn)速分常速離心機（低速離心機）、高速離心機、超速離心機但當(dāng)固體顆粒細(xì)小而難以過濾時，發(fā)酵液不易被過濾純化，離心操作往顯得十分有效。管式離心機具有一個細(xì)長而高速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)鼓，通常情況下離心只能得到一種較為濃縮的懸浮液或漿體。層析柱對形成穩(wěn)定的膨脹床有很大影響，其底部和上部分別有一個液體分布器和床層調(diào)節(jié)器?！魧τ诔Ｋ匐x心機和高速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和離心時間，就能達到分離效果；◆如果希望從樣品液中分離出2種以上大小和密度不同的顆粒，需要采用差速離心方法。微濾技術(shù)有著廣泛應(yīng)用和眾多的優(yōu)點?；铋T（活塞）排渣的碟片離心機臥螺機是一種全速旋轉(zhuǎn)，連續(xù)進料，分離和卸料的離心機。體系中吸附劑與細(xì)胞、細(xì)胞碎片等組分可能存在相互作用。一、離心分離的基本原理D、不易放大，僅應(yīng)用于實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎。雙水相分離技術(shù)雙水相萃取可以同時完成細(xì)胞碎片去除和產(chǎn)品純化任務(wù)。雙水相萃取技術(shù)設(shè)備簡單、容易放大，但需要較多的原料。原理利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破58膨脹床吸附技術(shù)通過改進吸附劑本身的物理性質(zhì)和通過對色譜柱進行精心設(shè)計，得到了穩(wěn)定、無返混的流化床，讓固體顆粒通過填料層，同時以填充床的模式吸附目標(biāo)產(chǎn)物。優(yōu)點減少操作步驟、提高產(chǎn)品收率、降低純化費用和資本投入。膨脹床吸附技術(shù)通過改進吸附劑本身的物理性質(zhì)和通過對色譜柱進行59層析柱對形成穩(wěn)定的膨脹床有很大影響，其底部和上部分別有一個液體分布器和床層調(diào)節(jié)器。選擇合適的吸附劑對產(chǎn)物吸附和維持合適膨脹度十分重要，選擇時應(yīng)注意1、吸附劑應(yīng)具有良好的吸附性能和流態(tài)化性能。2、在粒度和密度上要有差異。層析柱對形成穩(wěn)定的膨脹床有很大影響，其底部和上部分別有一個液60膨脹床的操作五個步驟膨脹床的操作五個步驟61膨脹床的特點膨脹床的軸向分散程度很小，流體近似于平推流狀態(tài)。床層膨脹率和液體混合程度是主要參數(shù)，流體流速、物性和溫度可以影響床層膨脹率。吸附性能是研究關(guān)注的焦點，床層高度、流速、流體粘度和溫度等是影響膨脹床吸附性能的主要因素。體系中吸附劑與細(xì)胞、細(xì)胞碎片等組分可能存在相互作用。膨脹床的特點膨脹床的軸向分散程度很小，流體近似于平推流狀態(tài)。62膨脹床的應(yīng)用膨脹床的應(yīng)用63泡沫分離技術(shù)利用物質(zhì)在氣泡表面上吸附性質(zhì)的差異進行分離的技術(shù)，依據(jù)的是表面吸附原理。泡沫分離是以泡沫作為分離介質(zhì),以組分之間的表面活性差異作為分離依據(jù),利用氣體在溶液中的鼓泡來達到濃集物質(zhì)的一種新型分離技術(shù)。泡沫分離技術(shù)利用物質(zhì)在氣泡表面上吸附性質(zhì)的差異進行分離的技術(shù)64泡沫是氣體分散在液體中的多相非均勻體。液體中泡沫的形成有兩種方法:第一種是將氣體通過連續(xù)相－液體時采用攪拌或通過細(xì)孔鼓泡的方法被分散而形成泡沫,第二方法是先將氣體以分子或離子的形式溶解于液體中,然后設(shè)法使這些溶解的氣體從液體中析出而形成大量的泡沫。用氣體向水鼓泡時,能產(chǎn)生很多泡沫,但這此泡沫處于一種不穩(wěn)定狀態(tài),會很快消失,當(dāng)水中存在有表面活性劑時,形成的泡沫就比較穩(wěn)定。氣體分散在溶液內(nèi)部形成被液體包裹住的氣泡,表面活性劑在氣泡表面作定向排列:泡沫是氣體分散在液體中的多相非均勻體。65吸附效率方程式中，:表示單位表面上吸附溶質(zhì)的摩爾數(shù)與主體溶液濃度之差,單位為mol/cm2C:溶質(zhì)在主體溶液中的平衡濃度,又叫吸附平衡濃度,mol/L/C:相當(dāng)于分配因子,r:表面張力(dyn/cm),R:氣體常數(shù),T:絕對溫度.吸附效率方程式中，:表示單位表面上吸附溶質(zhì)的摩爾數(shù)與主66濃度低時為線性關(guān)系b點吸附量幾乎不再變化，為臨界濃度。濃度低時為線性關(guān)系67因此管的一側(cè)會出現(xiàn)顆粒沉積。角度越大，沉降越結(jié)實，分離效果越好，◆對于常速離心機和高速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和離心時間，就能達到分離效果；細(xì)胞破碎的目的使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到不同程度的破壞（增大通透性）或破碎，釋放其中的目標(biāo)產(chǎn)物。G-的酶溶更受到了限制據(jù)轉(zhuǎn)速分常速離心機（低速離心機）、高速離心機、超速離心機據(jù)轉(zhuǎn)速分常速離心機（低速離心機）、高速離心機、超速離心機通過改進吸附劑本身的物理性質(zhì)和通過對色譜柱進行精心設(shè)計，得到了穩(wěn)定、無返混的流化床，讓固體顆粒通過填料層，同時以填充床的模式吸附目標(biāo)產(chǎn)物。離心后形成不同大小不同形狀、具有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度溶液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。微濾是一種以多孔細(xì)小薄膜為過濾介質(zhì)，以壓差為推動力，使不溶物質(zhì)濃縮過濾的操作。動物細(xì)胞和革蘭氏陰性菌。一、離心分離的基本原理這是近年來開發(fā)的機型，它和相同直徑的活塞機相似，其速度可增加23%~30%,可用于酶制劑，疫苗和胰島素等生產(chǎn)中分離物的澄清。原理利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性1）滲透壓沖擊法（osmoticshock）是在管式離心機的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，在轉(zhuǎn)鼓中加入了許多重迭的碟片，縮短了顆粒的沉降距離，提高了分離效率。泡沫分離是以泡沫作為分離介質(zhì),以組分之間的表面活性差異作為分離依據(jù),利用氣體在溶液中的鼓泡來達到濃集物質(zhì)的一種新型分離技術(shù)。據(jù)分離方式分沉降式離心機、過濾式離心機C、在上游發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過程和環(huán)境對破碎難易程度影響泡沫分離的影響因素因此管的一側(cè)會出現(xiàn)顆粒沉積。泡沫分離的影響因素68細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)69（優(yōu)選）細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)（優(yōu)選）細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)70固液分析技術(shù)固液分析技術(shù)71過濾過濾就是利用多孔性介質(zhì)截留固液懸浮物中的固體顆粒，從而實現(xiàn)固液分離的方法。深層過濾濾餅過濾濾餅阻力主要由菌種和發(fā)酵條件決定過濾過濾就是利用多孔性介質(zhì)截留固液懸浮物中的固體顆粒，從而實72改善過濾性能的方法過濾操作的兩個目標(biāo)加快過濾速率、提高過濾質(zhì)量。絮凝助濾劑反應(yīng)劑酶解改善過濾性能的方法過濾操作的兩個目標(biāo)加快過濾速率、提高過濾質(zhì)73過濾設(shè)備及選擇依據(jù)推動力；常壓過濾機、加壓過濾機、真空過濾機依據(jù)設(shè)備構(gòu)造板框壓濾機、鼓式真空過濾機、加壓葉濾機過濾設(shè)備及選擇依據(jù)推動力；74微濾微濾是一種以多孔細(xì)小薄膜為過濾介質(zhì)，以壓差為推動力，使不溶物質(zhì)濃縮過濾的操作。微濾分離過程的三階段。影響分離速率的因素主要有操作形式、流速、壓力和料液濃度。微濾技術(shù)有著廣泛應(yīng)用和眾多的優(yōu)點。微濾微濾是一種以多孔細(xì)小薄膜為過濾介質(zhì)，以壓差為推動力，使不75微濾的操作模式無流動操作模式和錯流過濾操作模式微濾的操作模式無流動操作模式和錯流過濾操作模式76微濾設(shè)備板框式膜過濾器管式膜過濾器中空纖維式膜分離器螺旋卷式膜分離器微濾設(shè)備板框式膜過濾器77離心技術(shù)一、離心分離的基本原理二、離心機的類型三、離心方法四、離心條件的確定五、影響離心效果的主要因素與控制離心技術(shù)一、離心分離的基本原理78差速離心是指采用不同的離心速度和離心時間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法。而過濾可獲得的水分含量較低的濾餅。機理：高于20kHz的超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用，空穴由于超聲波的沖擊而產(chǎn)生和閉合，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。5×104rpm，相對離心力104～105g，用于細(xì)胞碎片、較大細(xì)胞器、大分子沉淀物等分離；適用于酵母和多數(shù)細(xì)胞的破碎濾餅阻力主要由菌種和發(fā)酵條件決定常壓過濾機、加壓過濾機、真空過濾機原理利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性一、離心分離的基本原理細(xì)胞破碎和雙水相萃取技術(shù)結(jié)合板框壓濾機、鼓式真空過濾機、加壓葉濾機細(xì)胞于高滲介質(zhì)中，脫水達到平衡后，迅速將其轉(zhuǎn)置于低滲透壓的水或緩沖液中，水進入細(xì)胞使胞壁和胞膜破裂上部兩側(cè)有重液相和輕液相出口(對液液分離而言)。然后再沿管壁滑向管底，一、離心分離的基本原理B、有效能量的利用率低；優(yōu)點：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好；缺點：與過濾設(shè)備相比，設(shè)備投資高、能耗大、離心產(chǎn)生的固體濃縮物和過濾產(chǎn)生的濃縮不同。通常情況下離心只能得到一種較為濃縮的懸浮液或漿體。而過濾可獲得的水分含量較低的濾餅。離心分離差速離心是指采用不同的離心速度和離心時間，使不同沉降速度的顆79離心的原理對于濃度較小，粒徑較大，硬度較強的不溶物，可以采用過濾分離。但當(dāng)固體顆粒細(xì)小而難以過濾時，發(fā)酵液不易被過濾純化，離心操作往顯得十分有效。離心分離是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。離心的原理對于濃度較小，粒徑較大，硬度較強的不溶物，可以采用80細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)課件81差速離心差速離心82離心機的類型據(jù)分離方式分沉降式離心機、過濾式離心機據(jù)操作方式分間歇式(分批)離心機、連續(xù)式離心機據(jù)轉(zhuǎn)速分常速離心機（低速離心機）、高速離心機、超速離心機據(jù)設(shè)備結(jié)構(gòu)特點分管式、蝶式、螺旋式……離心機的類型據(jù)分離方式分沉降式離心機、過濾式離心機83按速度和離心力：1、常速離心機最大轉(zhuǎn)速8000rpm(r/min)，相對離心力(RCF)104g以下，用于細(xì)胞、菌體和培養(yǎng)基殘渣等分離；2、高速（冷凍）離心機1×104～2.5×104rpm，相對離心力104～105g，用于細(xì)胞碎片、較大細(xì)胞器、大分子沉淀物等分離；3、超速離心機轉(zhuǎn)速2.5～8×104rpm，相對離心力5×105g；用于DNA、RNA蛋白質(zhì)、細(xì)胞器、病毒分離純化；檢測純度；沉降系數(shù)和相對分子量測定等。離心機的種類與用途按速度和離心力：離心機的種類與用途84G-的酶溶更受到了限制沉降系數(shù)和相對分子量測定等。層析柱對形成穩(wěn)定的膨脹床有很大影響，其底部和上部分別有一個液體分布器和床層調(diào)節(jié)器。這是近年來開發(fā)的機型，它和相同直徑的活塞機相似，其速度可增加23%~30%,可用于酶制劑，疫苗和胰島素等生產(chǎn)中分離物的澄清。過濾就是利用多孔性介質(zhì)截留固液懸浮物中的固體顆粒，從而實現(xiàn)固液分離的方法。是生物工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的一種離心機（2）離心時間和K因子轉(zhuǎn)子活動管套內(nèi)的離心管，靜止時垂直掛在轉(zhuǎn)頭上，旋轉(zhuǎn)時隨著轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動，從垂直懸吊上升到水平位置（約200—800rpm）。噴嘴排渣的碟片離心機當(dāng)固體顆粒含量較多時，可采用具有噴嘴排渣的碟式離心沉降機。是生物工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的一種離心機微濾技術(shù)有著廣泛應(yīng)用和眾多的優(yōu)點?！魧τ诔Ｋ匐x心機和高速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和離心時間，就能達到分離效果；這種溶質(zhì)稱為梯度介質(zhì)。D、不易放大，僅應(yīng)用于實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎。◆而對于超速離心，則可以根據(jù)需要采用差速離心、密度梯度離心或等密梯度離心等方法。細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)適用于酵母和多數(shù)細(xì)胞的破碎沉降系數(shù)和相對分子量測定等。受振動和變速攪亂后對流現(xiàn)象小，離心方法◆對于常速離心機和高速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和離心時間，就能達到分離效果；◆如果希望從樣品液中分離出2種以上大小和密度不同的顆粒，需要采用差速離心方法?！舳鴮τ诔匐x心，則可以根據(jù)需要采用差速離心、密度梯度離心或等密梯度離心等方法。G-的酶溶更受到了限制離心方法◆對于常速離心機和高速離心機，85大容量冷凍離心機大容量冷凍離心機86據(jù)設(shè)備結(jié)構(gòu)特點分1斜角式2平拋式3管式4蝶片式5螺旋式6多室式據(jù)設(shè)備結(jié)構(gòu)特點分1斜角式87斜角式離心機是一類結(jié)構(gòu)最簡單的實驗室常用離心機，指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)子；角度越大，沉降越結(jié)實，分離效果越好，角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離效果差。顆粒在角轉(zhuǎn)子中沉降時，先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)會出現(xiàn)顆粒沉積。斜角式離心機88細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)課件89

平拋式離心機平拋式離心機一類結(jié)構(gòu)簡單的實驗室常用的低中速離心機，轉(zhuǎn)速一般在3000-6000rpm。轉(zhuǎn)子活動管套內(nèi)的離心管，靜止時垂直掛在轉(zhuǎn)頭上，旋轉(zhuǎn)時隨著轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動，從垂直懸吊上升到水平位置（約200—800rpm）。顆粒在水平轉(zhuǎn)子中的沉降是沿管子軸向移動。樣品便于收集受振動和變速攪亂后對流現(xiàn)象小，但轉(zhuǎn)頭結(jié)構(gòu)復(fù)雜，最高轉(zhuǎn)速相對要低容量也小一些。

平拋式離心機90平拋式離心機轉(zhuǎn)子平拋式離心機轉(zhuǎn)子91管式離心機具有一個細(xì)長而高速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)鼓，轉(zhuǎn)鼓內(nèi)裝有縱向平板，其下部有進料口。上部兩側(cè)有重液相和輕液相出口(對液液分離而言)。分為液液分離的連續(xù)式管式離心機和液固分離的間歇式管式離心機。管式離心機管式離心機具有一個細(xì)長而高速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)鼓，管式離心機921）滲透壓沖擊法（osmoticshock）碟片間的距離一般為0.常用的梯度介質(zhì)有蔗糖、甘油等。增加裝珠量、延長破碎時間、提高轉(zhuǎn)速等手段可提高破碎率是在管式離心機的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，在轉(zhuǎn)鼓中加入了許多重迭的碟片，縮短了顆粒的沉降距離，提高了分離效率。這種溶質(zhì)稱為梯度介質(zhì)。過濾操作的兩個目標(biāo)加快過濾速率、提高過濾質(zhì)量?！魧τ诔Ｋ匐x心機和高速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和離心時間，就能達到分離效果；對于間歇操作式，須定時拆卸、清洗◆對于常速離心機和高速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和離心時間，就能達到分離效果；靠擋板分布于鼓的四周，并使料液迅速達到與轉(zhuǎn)鼓相同的角速度。一、離心分離的基本原理增加裝珠量、延長破碎時間、提高轉(zhuǎn)速等手段可提高破碎率而過濾可獲得的水分含量較低的濾餅。受振動和變速攪亂后對流現(xiàn)象小，優(yōu)點減少操作步驟、提高產(chǎn)品收率、降低純化費用和資本投入。然后再沿管壁滑向管底，利用超臨界CO2做介質(zhì)，高壓CO2易于滲透到細(xì)胞內(nèi)。適用于酵母和多數(shù)細(xì)胞的破碎通常情況下離心只能得到一種較為濃縮的懸浮液或漿體。因此管的一側(cè)會出現(xiàn)顆粒沉積。液液分離管式離心機液固分離管式離心機1）滲透壓沖擊法（osmoticshock）液液分離管式離93液固分離管式離心機待處理的物料在一定壓力（3×104Pa左右）下由進料管經(jīng)底部空心軸進入鼓內(nèi)，靠擋板分布于鼓的四周，并使料液迅速達到與轉(zhuǎn)鼓相同的角速度。轉(zhuǎn)鼓帶動物料高速旋轉(zhuǎn)，在離心力下，懸浮液沿轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁向上流動的，料液在離心力場的作用下因其密度差的存在而分離。澄清后的液相流動到轉(zhuǎn)鼓上部的排液口排出。比重大的固體微粒逐漸沉積在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁形成沉渣層，達到一定數(shù)量后，停機人工清除。液固分離管式離心機待處理的物料在一定壓力（3×104Pa左94管式離心機特點結(jié)構(gòu)簡單，可提供較大離心力，轉(zhuǎn)速高，效果好。管狀離心機可以冷卻，有利蛋白質(zhì)分離對于間歇操作式，須定時拆卸、清洗適用于分離乳濁液及含細(xì)顆粒的稀懸浮液，適用于固體含量低于1%，顆粒度小于5微米，黏度大的懸浮液澄清或固液兩相密度差較小的分離。管式離心機特點95碟片式離心機是在管式離心機的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，在轉(zhuǎn)鼓中加入了許多重迭的碟片，縮短了顆粒的沉降距離，提高了分離效率。是生物工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的一種離心機有一個密封的轉(zhuǎn)鼓，內(nèi)裝十至上百個錐頂角為60100゜錐形碟片。碟片間的距離一般為0.52.5mm。碟片式離心機是在管式離心機的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，在轉(zhuǎn)鼓中加入了96細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)課件97碟片式離心機工作原理當(dāng)懸浮液在動壓頭的作用下，經(jīng)中心管流入高速旋轉(zhuǎn)的碟片之間的間隙時，便產(chǎn)生了慣性離心力，其中密度較大的固體顆粒在離心力作用下向上層碟片的下表面運動，而后在離心力作用下被向外甩出，沿碟片下表面向轉(zhuǎn)子外圍下滑，而液體則由于密度小，在后續(xù)液體的推動下沿著碟片的隙道向轉(zhuǎn)子中心流動，然后沿中心軸上升，從套管中排出，達到分離的目的碟片式離心機工作原理當(dāng)懸浮液在動壓頭的作用下，經(jīng)中心管流入高98碟片式離心機類型人工排渣的碟片離心機碟片上不開孔，只有一個清液排出口。沉積在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁上的沉渣，間歇排出。只適用于固體顆粒含量很少的懸浮液。噴嘴排渣的碟片離心機當(dāng)固體顆粒含量較多時，可采用具有噴嘴排渣的碟式離心沉降機。在有特殊形狀內(nèi)壁的轉(zhuǎn)鼓壁上開設(shè)若干噴嘴活門（活塞）排渣的碟片離心機這是近年來開發(fā)的機型，它和相同直徑的活塞機相似，其速度可增加23%~30%,可用于酶制劑，疫苗和胰島素等生產(chǎn)中分離物的澄清。碟片式離心機類型人工排渣的碟片離心機99螺旋卸料沉降離心機有立式和臥式兩種臥螺機是一種全速旋轉(zhuǎn)，連續(xù)進料，分離和卸料的離心機。最大離心力強度可達6000rpm操作溫度可達300℃操作壓力一般為常壓常用于胰島素，細(xì)胞色素，胰酶等的分離。螺旋式離心機螺旋卸料沉降離心機螺旋式離心機100螺旋式離心機工作原理轉(zhuǎn)鼓與螺旋輸送器以一定差速同向高速旋轉(zhuǎn)(后者慢)，懸浮液通過螺旋輸送器的空心軸進入機內(nèi)中部，由進料管連續(xù)引入螺旋內(nèi)筒，加速后進入轉(zhuǎn)鼓。在離心力場作用下，固相物沉積在轉(zhuǎn)鼓壁上形成沉渣層。輸料螺旋將沉積的固相物連續(xù)不斷定推至轉(zhuǎn)鼓錐端，經(jīng)排渣口排出機外，較輕的液相物則形成內(nèi)層液環(huán)，由轉(zhuǎn)鼓大端溢流口連續(xù)溢出轉(zhuǎn)鼓，經(jīng)排液口排出機外。螺旋式離心機工作原理轉(zhuǎn)鼓與螺旋輸送器以一定差速同向高速旋轉(zhuǎn)(1011、差速離心2、密度梯度離心3、等密梯度離心離心方法離心方法1021、差速離心

差速離心是指采用不同的離心速度和離心時間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法。

※1、差速離心1032、密度梯度離心（1）定義密度梯度離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)分離的一種區(qū)帶分離方法。（2）梯度介質(zhì)為了使沉降系數(shù)比較接近的顆粒得以分離，必須配制好適宜的密度梯度系統(tǒng)。密度梯度系統(tǒng)是在溶劑中加入一定的溶質(zhì)制成的。這種溶質(zhì)稱為梯度介質(zhì)。常用的梯度介質(zhì)有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系統(tǒng)，其適用范圍是蔗糖濃度5～60%，密度范圍1.02～1.30g/cm3?！?、密度梯度離心104（3）不同密度梯度條件下物質(zhì)的分離離心后形成不同大小不同形狀、具有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度溶液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。（3）不同密度梯度條件下物質(zhì)的分離離心后形成不同大小不同形狀105密度梯度離心法密度梯度離心法106（4）密度梯度的制備密度梯度一般采用密度梯度混合器進行制備。◆密度梯度混合器由貯液室、混合室、電磁攪拌器和閥門等組成，如圖。（4）密度梯度的制備密度梯度一般采用密度梯度混合器進行制備。107※密度梯度混合器密度梯度混合器108（4）所形成密度梯度的類型制備得到的密度梯度可以分為線性梯度、凹形梯度和凸形梯度等。※（4）所形成密度梯度的類型制備得到的密度梯度可以分為線性梯度109（5）密度梯度的形成

兩種不同濃度的溶液（蔗糖溶液）以不同比例混合形成?！?）密度梯度的形成1103、等密度梯度離心

當(dāng)欲分離的不同顆粒的密度范圍處于離心介質(zhì)的密度范圍內(nèi)時，在離心力的作用下，不同浮力密度的顆?；蛳蛳鲁两担蛳蛏巷h浮，只要時間足夠長，就可以一直移動到與它們各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度點），形成區(qū)帶。這種方法稱為等密梯度離心，或稱為平衡等密度離心。

※3、等密度梯度離心111五、影響離心效果的主要因素與控制1、樣品的理化性質(zhì)2、離心分離設(shè)備3、離心條件的選擇（1）離心力和相對離心力（2）離心時間和K因子（3）離心操作溫度五、影響離心效果的主要因素與控制112泡沫是氣體分散在液體中的多相非均勻體。是生物工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的一種離心機一、離心分離的基本原理G-的酶溶更受到了限制機理：高于20kHz的超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用，空穴由于超聲波的沖擊而產(chǎn)生和閉合，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。微濾技術(shù)有著廣泛應(yīng)用和眾多的優(yōu)點。2）凍結(jié)－融化法（FreezingandThawing）據(jù)轉(zhuǎn)速分常速離心機（低速離心機）、高速離心機、超速離心機澄清后的液相流動到轉(zhuǎn)鼓上部的排液口排出。細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)原理利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性◆對于常速離心機和高速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和離心時間，就能達到分離效果；在有特殊形狀內(nèi)壁的轉(zhuǎn)鼓壁上開設(shè)若干噴嘴體系中吸附劑與細(xì)胞、細(xì)胞碎片等組分可能存在相互作用。細(xì)胞破碎和雙水相萃取技術(shù)結(jié)合（1）定義密度梯度離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)分離的一種區(qū)帶分離方法。D、不易放大，僅應(yīng)用于實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎。常用的梯度介質(zhì)有蔗糖、甘油等。機理：高于20kHz的超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用，空穴由于超聲波的沖擊而產(chǎn)生和閉合，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。據(jù)轉(zhuǎn)速分常速離心機（低速離心機）、高速離心機、超速離心機細(xì)胞破碎技術(shù)細(xì)胞破碎的目的使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到不同程度的破壞（增大通透性）或破碎，釋放其中的目標(biāo)產(chǎn)物。機械法非機械法珠磨法、壓榨法高壓勻漿、超聲破碎、撞擊法固體剪切作用液體剪切作用1）酶溶法2）化學(xué)法3）物理法干燥處理溶胞作用超臨界細(xì)胞破碎泡沫是氣體分散在液體中的多相非均勻體。細(xì)胞破碎技術(shù)細(xì)胞破碎的113機械方法破碎1）珠磨法（beadmilling）細(xì)胞懸浮液與極小的研磨劑如玻璃小珠、石英砂等一起高速攪拌，細(xì)胞與研磨劑之間相互碰撞、剪切，使細(xì)胞達到某種程度破碎，釋放內(nèi)含物可采用間歇式或連續(xù)操作珠磨機增加裝珠量、延長破碎時間、提高轉(zhuǎn)速等手段可提高破碎率→總能耗增加且須注意換熱適用于多數(shù)微生物細(xì)胞，esp.有大量菌絲體的微生物（藻類和真菌菌絲）和質(zhì)地堅硬（亞細(xì)胞器）的微生物細(xì)胞機械方法破碎1）珠磨法（beadmilling）細(xì)胞懸浮114高壓勻漿法

破碎原理利用高壓使懸浮液通過針形閥，從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊后，急劇釋放到低壓環(huán)境破碎作用力突然減壓和高速沖撞閥座閥撞擊環(huán)操作參數(shù)少且易于確定，實驗室及工業(yè)生產(chǎn)中均可適用于酵母和多數(shù)細(xì)胞的破碎對易造成堵塞的團狀或絲狀真菌及一些易損傷勻漿閥、質(zhì)地堅硬的亞細(xì)胞器一般不適用高壓勻漿法

破碎原理利用高壓使懸浮液通過針形閥，從閥座與閥之115超聲波破碎機理：高于20kHz的超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用，空穴由于超聲波的沖擊而產(chǎn)生和閉合，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。缺點：A、影響因素多，細(xì)胞種類、濃度和處理時間、探頭材料和形狀；B、有效能量的利用率低；C、產(chǎn)熱大，需控溫；D、不易放大，僅應(yīng)用于實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎。超聲波破碎機理：高于20kHz的超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用，116機械破碎法總結(jié)以上幾種機械破碎法的作用機理不盡相同，有各自的適用范圍（包括菌體細(xì)胞、細(xì)胞發(fā)酵液的特性）和處理規(guī)模（實驗室或工業(yè)用）方法珠磨高壓勻漿超聲破碎使用規(guī)模實驗室、工業(yè)用實驗室、工業(yè)用實驗室適用對象酵母、藻類及絲狀真菌酵母菌、細(xì)菌細(xì)菌機械破碎法總結(jié)以上幾種機械破碎法的作用機理不盡相同，有各自的117細(xì)胞物理破碎方法1）滲透壓沖擊法（osmoticshock）最為溫和的一類細(xì)胞破碎方法，適用于易于破碎的細(xì)胞，eg.動物細(xì)胞和革蘭氏陰性菌。細(xì)胞于高滲介質(zhì)中，脫水達到平衡后，迅速將其轉(zhuǎn)置于低滲透壓的水或緩沖液中，水進入細(xì)胞使胞壁和胞膜破裂2）凍結(jié)－融化法（FreezingandThawing）細(xì)胞急劇凍結(jié)后在室溫緩慢融化，反復(fù)操作多次使細(xì)胞破壞，對于存在于細(xì)胞質(zhì)周圍靠近細(xì)胞膜的胞內(nèi)產(chǎn)物釋放較為有效細(xì)胞物理破碎方法1）滲透壓沖擊法（osmoticshock118化學(xué)法破碎用某些化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分酸堿、某些表面活性劑及脂溶性有機溶劑都可改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇性地滲透出來→化學(xué)滲透法利用酸堿調(diào)pH；有機溶劑甲苯；表面活性劑十二烷基磺酸鈉、TritonX-100；螯合劑乙二胺四乙酸EDTA等優(yōu)點：細(xì)胞外型完整、碎片少、粘度低，料液易澄清A、價格昂貴，引起新的污染；B、一般只有有限的破碎，比機械破碎速度低、效率差，常需與機械法連用。化學(xué)法破碎用某些化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分利用酸119生物法破碎原理利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性溶菌酶lysozyme適用于G＋的細(xì)胞壁，若配合EDTA、TritonX-100則可有效作用于G－的胞壁；真核細(xì)胞需用不同的酶：酵母細(xì)胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖酶；破壞植物細(xì)胞壁需用纖維素酶優(yōu)點：產(chǎn)品釋放的選擇性高、產(chǎn)品破壞少、對溫度及pH等外界條件要求低，不殘留細(xì)胞碎片等，不同的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)決定了需要不同的酶生物法破碎原理利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部120生物法破碎自溶通過調(diào)節(jié)溫度、pH或添加有機溶劑等激活劑，誘使細(xì)胞產(chǎn)生溶解自身酶的方法溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法但其高成本和有限的適用性使該法不可能實現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用，esp.G-的酶溶更受到了限制生物法破碎自溶通過調(diào)節(jié)溫度、pH或添加有機溶劑等激活劑，誘使121超臨界細(xì)胞破碎技術(shù)超臨界流體：溫度和壓力處于臨界條件之上的流體，具有類似于氣體的性質(zhì)（低黏度）和類似于液體的高密度，具有較好的流動性能、傳質(zhì)性能和溶解性能利用超臨界CO2做介質(zhì)，高壓CO2易于滲透到細(xì)胞內(nèi)。突然降壓后，因細(xì)胞內(nèi)外較大的壓差使細(xì)胞急劇膨脹而發(fā)生破裂可破碎細(xì)胞壁較厚的細(xì)胞如酵母甚至對粘稠的酵母漿都有很好的破碎效果超臨界細(xì)胞破碎技術(shù)超臨界流體：溫度和壓力處于臨界條件之上的流122細(xì)胞破碎和生化分離技術(shù)課件123破碎方法的選擇選擇的一般原則A、提取產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，用機械法破碎B、提取產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，用化學(xué)法C、提取產(chǎn)物與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機械法結(jié)合的方法破碎過程中應(yīng)注意的問題A、多種破碎方法相結(jié)合可產(chǎn)生很大優(yōu)勢B、對下游分離技術(shù)的影響：破碎顆粒清除，產(chǎn)物分離純化C、在上游發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過程和環(huán)境對破碎難易程度影響D、菌種的培育及改造，胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物破碎方法的選擇選擇的一般原則破碎過程中應(yīng)注意的問題124胞內(nèi)產(chǎn)物的選擇性釋放細(xì)胞破碎和雙水相萃取技術(shù)結(jié)合利用噬菌體裂解細(xì)胞電脈沖提取法分步、分級提取法胞內(nèi)產(chǎn)物的選擇性釋放細(xì)胞破碎和雙水相萃取技術(shù)結(jié)合125原理利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性這是近年來開發(fā)的機型，它和相同直徑的活塞機相似，其速度可增加23%~30%,可用于酶制劑，疫苗和胰島素等生產(chǎn)中分離物的澄清。（1）定義密度梯度離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)分離的一種區(qū)帶分離方法。層析柱對形成穩(wěn)定的膨脹床有很大影響，其底部和上部分別有一個液體分布器和床層調(diào)節(jié)器。C、提取產(chǎn)物與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機械法結(jié)合的方法沉積在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁上的沉渣，間歇排出。板框壓濾機、鼓式真空過濾機、加壓葉濾機較輕的液相物則形成內(nèi)層液環(huán)，由轉(zhuǎn)鼓大端溢流口連續(xù)溢出轉(zhuǎn)鼓，經(jīng)排液口排出機外。據(jù)轉(zhuǎn)