共振光散射技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用

共振光散射技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用【內(nèi)容摘要】對共振光散射技術(shù)在藥物與生物大分子分析測定中的應(yīng)用狀態(tài)及其進(jìn)展進(jìn)行了綜述。重點(diǎn)介紹了該方法在生物體液中藥物的分析和中藥成分的分析應(yīng)用前景。為體內(nèi)大分子藥物及其他藥物成分的檢測方法研究提供了新途徑。【本文關(guān)鍵詞語】共振光散射技術(shù);藥物分析abstract:theapplicationandthedevelopmentoftheresonancelightscattering(rls)methodusedindrugdeterminationandthebiomacromoleculedeterminationwasreviewed.theapplicationofrlsinpharmaceuticalquantificationinbiologicalfluids,andtheapplicationofrlsinquantificationofchinesemedicinewerereviewed.thismethodmightbeanovelwayforthedeterminationmacromoleculardrugsandothermedicinalingredientsinvivo.keywords:resonancelightscattering;pharmaceuticalquantification共振光散射(resonancelightscattering，rls)是利用普通熒光分光光度法對散射光進(jìn)行測量的一種散射光分析技術(shù)[1]。該技術(shù)由于其簡單、快速、靈敏的分析特點(diǎn)，吸引了生命科學(xué)、分析化學(xué)、環(huán)境科學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域的分析工作者對其理論和應(yīng)用進(jìn)行了深切進(jìn)入的研究，促進(jìn)了分析學(xué)科內(nèi)部各個(gè)分支之間的聯(lián)絡(luò)，尤其是在生化領(lǐng)域已經(jīng)獲得一定的研究結(jié)果[2]。光散射現(xiàn)象廣泛存在于光與粒子互相作用的經(jīng)過中，當(dāng)介質(zhì)中粒子的直徑(d)與入射光波長(λ0)存在d≤0.05λ0時(shí)，產(chǎn)生的是以瑞利(rayleigh)散射為主的分子散射光[3]。根據(jù)rls理論能夠得到散射光強(qiáng)度與散射粒子的濃度c成正比的關(guān)系，即irls=kcb。據(jù)此能夠用于大分子物質(zhì)溶液的分析測定[1]。rls分析法靈敏度高，操作簡單方便，可通過普通熒光分光光度計(jì)同步掃描得到完好的rls特征光譜和相應(yīng)rls峰。由于rls法源于rayleigh散射光吸收光譜，它對分子構(gòu)造大小和形狀(如球形、鏈形、無規(guī)則線團(tuán)等)、電荷分布、鍵合性質(zhì)等研究還能提供新的、更豐富的信息。近年來的研究證明，rls法還可用于痕量金屬、外表活性劑以及納米材料[4,5]等方面的研究測定。該方法一般不需要對樣品進(jìn)行復(fù)雜的化學(xué)預(yù)處理，避免了一系列煩瑣的操作程序，而直接將處理好的樣品溶液置于普通的熒光分光光度計(jì)中進(jìn)行測定即可。1體液中生物大分子的測定1.1蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的功能許多，與生命的起源和生物的進(jìn)化、細(xì)胞構(gòu)造、病毒、免疫、酶、激素、物質(zhì)的遺傳等有親密的聯(lián)絡(luò)，它是生命現(xiàn)象的物質(zhì)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)定量測定是生物化學(xué)和生命學(xué)科中經(jīng)常牽涉的分析內(nèi)容，在臨床醫(yī)學(xué)中也有主要應(yīng)用。當(dāng)前，蛋白質(zhì)測定方法重要有l(wèi)owry法[6]，bradford法[7]，biuret法[8]，bromoeersolgreen法[9]與bormophenolblue法[10]等。pasetmack[1]將rls技術(shù)用于測定微量蛋白質(zhì)以來，rls法分析技術(shù)以其方法簡單、快速、靈敏度高，在生物大分子分析測定研究中的報(bào)道日益增加，靈敏度可達(dá)納克級[11]。黃承志等研究了陰離子外表活性劑羅丹明b(rhodamineb，rhb)與十二烷基硫酸鈉(sds)蛋白質(zhì)體系的rls光譜特征。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，sds與hsa(humanserumalbumin，hsa)結(jié)合后再與rhb作用，其散射光強(qiáng)度加強(qiáng)。且rls加強(qiáng)的水平與蛋白的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。據(jù)此，建立了一種測定人血清中總蛋白質(zhì)的新方法[12]。胡之德等基于在ph2.11的酸性溶液中，聚乙二醇辛基苯基醚(op)對亮麗春紅5r蛋白質(zhì)體系的rls信號有強(qiáng)烈的增敏現(xiàn)象，建立了op蛋白質(zhì)亮麗春紅5r三元體系測定人血清中蛋白質(zhì)濃度的新方法。該體系對人血清白蛋白檢測的線性范圍在0.0～10.0pg·ml-1之間，檢測限為5.0ng·ml-1，檢測實(shí)際樣品的回收率在97.80%～109.62%之間，方法令人滿意[13]。王錫寧等利用rls技術(shù)測定白蛋白、紅蛋白。研究了間苯二酚黃op蛋白質(zhì)體系rls光譜特性，確定了在340.0nm處，ph2.40，間苯二酚黃濃度為2.3×10-5mol·l-1，op的濃度為3.0×10-5mol·l-1時(shí)為最佳反應(yīng)條件，據(jù)此建立了一種靈敏度高的測定蛋白質(zhì)的新方法[14]。薛蓓等研究了流動(dòng)打針(fia)rls技術(shù)聯(lián)用在線測定人血清中蛋白質(zhì)含量。以sds為熒光探針，利用未曾報(bào)道過的rls與fia聯(lián)用檢測人血清樣品中蛋白質(zhì)含量。與單純用rls法測定比較，分析時(shí)間由40min縮短至1min，rls信號的重現(xiàn)性得到了顯著改善，提升了實(shí)驗(yàn)的靈敏度和重現(xiàn)性[15]。梁宏等在普通熒光分光光度計(jì)上選擇適宜的激發(fā)光和發(fā)射光通帶寬度，利用rls技術(shù)，研究了生理ph值(7.43±0.02)，25℃下，金(ⅲ)與血清白蛋白的互相作用。初次觀測到金(ⅲ)對血清白蛋白的rls強(qiáng)度隨著金(ⅲ)濃度增長而降低。結(jié)果表示清楚，金(ⅲ)與血清白蛋白的結(jié)合會(huì)毀壞血清白蛋白分子聚集，使血清白蛋白中的二硫橋鍵斷裂，導(dǎo)致白蛋白分子趨于松懈，散射截面積減小，表現(xiàn)為rls強(qiáng)度降低[16]。1.2核酸核酸是遺傳信息的載體和基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)，在生物的生長、發(fā)育等活動(dòng)中具有特別主要的作用。當(dāng)前核酸分析測定的方法重要有分光光度法、熒光光度法、化學(xué)發(fā)光法、探針技術(shù)法、免疫分析法等，其中分光光度法[17]和熒光光度法[18]使用較多。紫外分光光度法操作簡單，但由于靈敏度低，測定的干擾因素多，使其在應(yīng)用上遭到了限制;熒光分析法具有選擇性好和靈敏度高，但熒光試劑價(jià)格昂貴，而且部分熒光試劑有致癌活性。針對上述情況，rls法因操作簡便快速，靈敏度高，試劑無毒性等優(yōu)勢，在核酸分析中也得到了廣泛的應(yīng)用。黃承志等利用溴化十六烷基三甲銨(cetyltrimethylammonsiumbromide,ctmab)是陽離子外表活性劑，核酸因帶有大量的磷酸根而帶負(fù)電荷的特性，證明了ctmab和核酸通過靜電引力共吸附到液/液界面上構(gòu)成兩性復(fù)合物，導(dǎo)致強(qiáng)烈增長的全內(nèi)反射共振光散射(totalinternalreflectedresonancelightscattering，tirrls)信號，tirrls信號強(qiáng)度與核酸的濃度呈線性[19]。劉紹璞等研究了5種陽離子外表活性劑與核酸反應(yīng)的rls光譜[20]。陳展光等初次利用諾氟沙星做為rls光譜探針，測定了葉綠體脫氧核糖核酸(ctdna)。在ph5.87的br(brittonrobinson)緩沖溶液中，波長405.5nm處出現(xiàn)最大rls峰，ctdna的線性響應(yīng)范圍為0.02～2.30μg·ml-1，檢測限為1.2ng·ml-1。還合成了希夫堿試劑三(2(鄰羥基苯基亞甲氨基)乙基)胺，而且研究了其與核酸在鹽酸介質(zhì)中的反應(yīng)。對希夫堿劑三(2(鄰羥基苯基亞甲氨基)乙基)胺dna體系的研究發(fā)現(xiàn)，在393.0nm處增長的rls強(qiáng)度與核酸的濃度成線性關(guān)系(ctdna，0.01～4.50μg·ml-1;fsdna，0.01～5.00μg·ml-1)。ctdna的檢測限是1.4ng·ml-1，fsdna的檢測限是2.1ng·ml-1。結(jié)果與紫外可見分光光度法測得結(jié)果一致[21]。林楓等研究在ph4.0介質(zhì)中參加dna和陽離子外表活性劑可使二甲酚橙的rls加強(qiáng)，據(jù)此建立了以二甲酚橙為分子探針測定dna的分析方法，適用于合成樣品中的dna測定[22]。2在化學(xué)藥分析中的應(yīng)用黃承志等利用具有雙親性的rhbctmab全內(nèi)反射共振光散射法測定肝素，肝素通過與rhb和ctmab互相作用構(gòu)成三元雙親性的復(fù)合物rhb肝素ctmab，而被rhb和ctmab協(xié)同吸附在水/四氯化碳(h2o/ccl4)界面上，引起強(qiáng)烈的tirrls加強(qiáng)信號用于肝素的測定[19]。陳展光等在氧氟沙星茜素紫3b體系中發(fā)現(xiàn)，ph5.09的br緩沖溶液中，在439.5nm處，0.10～2.50μg·ml-1范圍內(nèi)的氧氟沙星與增長的rls強(qiáng)度成線性關(guān)系。與此同時(shí)，在ph6.90，405.0nm處，0.05～3.00μg·ml-1范圍內(nèi)的氧氟沙星與rls強(qiáng)度成線性關(guān)系，檢測限分別為0.013μg·ml-1，0.021μg·ml-1[21]。氧氟沙星茜素紫3b體系可用于人體的氧氟沙星血藥濃度測定。還建立了人血清中抗菌類四季銨化合物的rls技術(shù)檢測方法[23]。陳展光等，建立的二溴羥基苯基熒光酮(dbhpf)曲通(triton)x100鉬的共振光散射光譜新體系，分析測定了中藥、頭發(fā)以及水中的微量鉬[21]。劉云富等研究發(fā)如今硫酸介質(zhì)中，砷鉬雜多酸與堿性染料rhb締合導(dǎo)致rhb體系的rls強(qiáng)度減弱，在一定濃度范圍內(nèi)，砷(ⅴ)的含量與體系減弱的rls強(qiáng)度成線性關(guān)系，據(jù)此建立了rls技術(shù)測定砷(ⅴ)的新方法[24]。3在中藥分析中的應(yīng)用黃承志等，研究了熒光素(flu)小檗堿(be)全內(nèi)反射共振光散射法測定小檗堿。采取tirrls技術(shù)通過flu與be在水/1,2,二氯乙烷(h2o/dce)界面反應(yīng)研究了be在界面上的特性。flu與be構(gòu)成雙親性的復(fù)合物，在h2o/dce界面富集，并引起強(qiáng)烈增長的tirrls信號，最大吸收波長位于373.0nm，所得信號強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與be濃度成正比關(guān)系，檢測限為1.3ng·ml-1。本方法與藥典使用的hplc方法對照靈敏度有所提升[19]。張憶華等，在ph為10.0的tris緩沖溶液中建立了綠原酸ctmabctdna體系，實(shí)驗(yàn)表示清楚，440.0nm處加強(qiáng)的rls光強(qiáng)度(δirls)穩(wěn)定，在0.002～0.10μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)，體系δirls與ctdna的濃度具有良好的線性關(guān)系，檢測限為0.6ng·ml-1。在厚樸酚ctmabctdna體系中，選擇ph值為10.0的tris緩沖溶液來控制反應(yīng)體系的酸度，356.0nm作為定量分析的波長。在0.02～1.00μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)，δirls與ctdna的濃度具有良好的線性關(guān)系。在最佳反應(yīng)條件，320.0nm處，ph10.0時(shí)，兒茶素ctmabctdna體系在0.02～1.00μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)，δirls與ctdna的濃度成線性關(guān)系。類似的實(shí)驗(yàn)還有山柰酚ctmabctdna體系。除此之外，張憶華還研究了三價(jià)稀土離子與槲皮素、山柰酚所構(gòu)成的絡(luò)合物的rls光譜，研究了ctdna對它的淬滅作用。建立了tb3+/eu3+槲皮素ctdna體系以及tb3+/eu3+山柰酚ctdna體系，結(jié)果表示清楚，槲皮素與山柰酚通過配位作用與tb3+/eu3+結(jié)合，引起體系rls光強(qiáng)度的增長，而當(dāng)參加ctdna后，體系的rls光強(qiáng)度降低，原因是ctdna構(gòu)造中的磷酸骨架能夠與tb3+和eu3+發(fā)生螯合作用，導(dǎo)致溶液中ctdna和山柰酚與tb3+/eu3+的競爭配位。該方法獲得了明顯的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[25]。4結(jié)束語由于rls技術(shù)是建立在普通光譜法基礎(chǔ)上，分析結(jié)果固然是物質(zhì)的散射光譜信息，但物質(zhì)形態(tài)特征等卻不能被獲取?；诖藛栴}，一種結(jié)合顯微成像技術(shù)的共振光散射成像技術(shù)被建立起來，對生物大分子的聚集形態(tài)進(jìn)行了深切進(jìn)入的研究和討論[26]，儀器的性能和工作條件對所獲信號影響大。由于rls光譜在較大光譜通帶下獲得，因此晦氣于光譜精細(xì)構(gòu)造的研究。固然我們知道散射光強(qiáng)度與散射粒子濃度有關(guān)，但出發(fā)點(diǎn)是從同步光譜開始的，顯然其測定公式推導(dǎo)并未牽涉rls的散射實(shí)質(zhì)。因而，用于分析化學(xué)的rls技術(shù)原理與定量基礎(chǔ)尚未有定論。固然rls技術(shù)作為一種新興的分析測定技術(shù)存在一些不足，但隨著rls技術(shù)理論和應(yīng)用上研