第二十一章細(xì)胞凋亡及其調(diào)控分子機(jī)制-2014級(jí)

第二十一 細(xì)胞凋亡及其調(diào)控的分子機(jī)凋亡是種自然現(xiàn)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞凋亡（)-形態(tài)學(xué)概念或程序性細(xì)胞 （medcelldeath,PCD）---功能性名第一細(xì)胞凋亡的特征及生物學(xué)意一、細(xì)胞凋亡的基本特(一)形態(tài)學(xué)特點(diǎn)(多階段細(xì)胞體積： 為碎片（核碎片形成）細(xì)胞胞質(zhì)：出現(xiàn)空泡，脫水濃縮，體積減少約細(xì)胞器：光鏡下的形態(tài)學(xué)特

凋亡細(xì)胞與鄰近細(xì)胞分光鏡下結(jié) 熒光顯微鏡下結(jié)

呈新月形的凋亡細(xì)凋亡小體(apoptoticbody)的形含有細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞器及核碎片的膜包被小體形成細(xì)胞表面突起形成------ 膜融合、根部縮→脫分隔機(jī) 在凋亡細(xì)胞內(nèi)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分隔成小不等的分隔區(qū)，靠近細(xì)胞膜端的分隔膜與細(xì)胞膜融合并脫落形成凋亡小體。(3)自噬體形成機(jī) 凋亡細(xì)胞內(nèi)線粒體質(zhì)網(wǎng)膜形成自噬體，自噬體在與凋亡稱凋亡小體。在性肝炎中見(jiàn)到的嗜酸空泡 固

出 邊 凋亡時(shí)細(xì)胞的

凋亡小透射電鏡下的凋亡小

（二）細(xì)胞凋亡的生化特 段化（主機(jī)制DNA 其它胞漿Ca2和H+水凋亡的發(fā)生伴隨胞漿Ca2+和H+水平的升高細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸(PS)外膜磷脂的不對(duì)稱性分布改變,凋亡PS由質(zhì)膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)（早期特征線粒transmembranepotential,Δψm)下降；膜通4）大分子合成：（三）細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別-細(xì)胞凋細(xì)胞壞誘導(dǎo)因生理性、弱刺激強(qiáng)烈刺細(xì)胞數(shù)單個(gè)細(xì)胞丟成群細(xì)膜完整保持至晚早期即喪細(xì)胞早期固縮、斷晚期破細(xì)胞無(wú)明顯變腫胞內(nèi)容無(wú)釋釋細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別-細(xì)胞凋細(xì)胞壞核片組大分子合一般需不需調(diào)有無(wú)不引起炎癥反引起炎癥反意生理病理二、細(xì)胞凋亡對(duì)于多細(xì) 發(fā)育至關(guān)重與DNA第二細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)一、細(xì)胞凋亡的酶學(xué)基秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis凋亡活 ：ced-3ced-凋亡抑 ：ced-Ced-4--凋亡活化因子1(apoptosis-factor-1,Apaf-（一 與細(xì)胞凋CaspaseCaspase(Cysteinylaspartate-specific是一類與白介素-1?轉(zhuǎn)化酶/Ced(ICE/Ced)同源的一類半胱氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)含有保守的aa序列(QACXG,X為以無(wú)活性的 式合成并存在于細(xì)胞中可以被上游或自身切割保守的活化；已在哺乳類中發(fā)現(xiàn)18種，分為3 ，Caspase-2 （-3、-6、-7、-8、-9、-亦可根據(jù)前體分子(procaspaseN端的原構(gòu)域(pro )分為類:啟始分子(initiator)：具“Long- 如-8、-9、-10等，為蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟始者，其活化后再切割和活化下游spase；效應(yīng)分子(efftor)：具“t-pro ，如-3、-6、-7等，作為上游酶的底物被切割活化，再作用于多種蛋白質(zhì)或酶，促使細(xì)胞凋亡。根據(jù)在級(jí)聯(lián)反應(yīng)上、下游的位置及功能的不同，可分為三大類①凋亡始動(dòng)子，位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)上游，包括、、、等，能在其他蛋白參與下發(fā)生自我活化并激活下游的。③包括、、-pas、、，主要參與細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)并在 受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中起輔助作用。 的蛋白酶系統(tǒng)，在細(xì)胞凋亡機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中居Caspase原結(jié)構(gòu) 大亞 小亞N D175異二聚體異四聚體蛋白酶活CaspaseActivationby

ActiveCaspase轉(zhuǎn)活化（transacti-非Caspase蛋白酶活化（activationbynoncaspaseproteinases）自活化：酶原具有很低的蛋白水解活性，表明它在某種條件下有自活化的潛力。野生型的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致酶原的加工與激活。轉(zhuǎn)活化：一旦被激活，起始能轉(zhuǎn)活化其他的酶原，包括效應(yīng)和起始。非蛋白酶活化酶原的另一激活機(jī)制是直接被其他非蛋白酶所活化。如，細(xì)胞毒性T細(xì)胞的顆粒酶B是一種天冬氨酸特異的絲氨酸蛋白酶，是酶原和的高效激活劑。效應(yīng)caspase非凋亡細(xì)胞中,caspase活化的DNase與其抑制蛋白(ICAD)結(jié)合凋亡細(xì)胞中,caspase剪切在凋亡過(guò)程中caspase在單一位點(diǎn)剪切核纖層蛋白(lamin),導(dǎo)致核板塌陷,染色質(zhì)濃縮.聚（腺苷二磷酸-核糖）多[Poly(ADP-ribose)polymerase,Caspase8,10,pathway:9Caspase3,and

Poly(ADP-ribose)(二)介導(dǎo)細(xì)胞凋核酸內(nèi)切酶主要是DNase包括DNaseDNase 二、細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳遞途細(xì)胞凋亡的影響信號(hào)分為2類一類為凋亡的負(fù)調(diào)控信號(hào)（抑制凋亡另一類為凋亡的正調(diào)控信號(hào)（誘導(dǎo)凋亡）細(xì)胞各種因素引起的凋亡的形態(tài)與生化改變均相同 細(xì)胞為結(jié)束，從而使細(xì)胞凋亡得以完（一 受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋 受體(deathreceptors,DR)：定義：指細(xì)胞表面存在的一類能結(jié)合凋亡剌激分子并將信號(hào)傳遞至胞內(nèi)引起細(xì)胞凋亡的受體。組成：胞外區(qū)（富含Cys結(jié)構(gòu)域、保守結(jié)構(gòu)域(death ,DD)分類：目前已發(fā)現(xiàn)近十CD95(Fas/Apo1)、TNFR1、TNFR2DR3(Apol3/Esl1)等 結(jié)構(gòu)域” ,概念：是凋亡信號(hào)受體共有的、存在于胞內(nèi)的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所必需的一段高度同源的aa序列。種類Fas相關(guān) 結(jié)構(gòu)域(Fas-associatedFADD包含DD 效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（death, 結(jié)構(gòu)域(TNFreceptor-associateddeath 受體相互作用蛋白(receptorinteractingprotein, 功能：DD的活化或過(guò)表達(dá)都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡死體死體信形成合

DDD

DD活活活活活NF-?B,AP- 活促進(jìn)炎癥免疫反應(yīng)

效應(yīng)Caspase活化級(jí)聯(lián)放大反 細(xì)胞凋（二）線粒體相關(guān)蛋白的凋亡Δψm的維持，與（mitochondrialpermeabilitytransitionpore,幾乎所有誘導(dǎo)劑引起的細(xì)胞凋亡都伴線粒體跨膜電位(ψm的下降;幾乎所有的凋亡誘導(dǎo)因素導(dǎo)致MPT破壞或開(kāi)放 ：Δψm下降、氧化磷酸化脫偶聯(lián)、GSH耗竭、活性氧簇（reactiveoxygenspecies，線粒體釋放的凋亡誘導(dǎo)分子在多種誘導(dǎo)因子（如UV照射）作用下，MPT開(kāi)放(cytochromeCCytC)SmacAIF、EndoGCytC釋放到胞質(zhì)中的CytC，可特異性地結(jié)合接頭蛋白Apaf-1借助N-端caspase（CARD）,直接募集多個(gè)caspase-9并使之活化 凋亡（三）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)蛋白的合成、修飾和折疊，導(dǎo)致下游CaspaseCaspase-12存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子內(nèi)環(huán)境紊亂）誘導(dǎo)的凋亡所必需的。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子動(dòng)態(tài)平衡破壞或過(guò)多蛋白積聚于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時(shí)，可直接激活位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的。同時(shí)也導(dǎo)致胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，進(jìn)一步激活，激活的可進(jìn)一步剪切pas，而 細(xì)胞凋亡。此過(guò)程由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)失常引起，與以膜或線粒體為靶位點(diǎn)的凋亡信號(hào)觸發(fā)無(wú)關(guān)。（四）粒酶B介導(dǎo)的細(xì)胞凋細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicT 粒酶（Granzyme,Gr）是CTL和NK細(xì)胞 先以 式合成，受刺激后激活已發(fā)現(xiàn)5種：GrA、B、H、M和類胰蛋白酶-其中以GrBGrB誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑 在體外，proe 中，除1外其余的都可被GrB切割活化，0和7是GrB的最適底物； 參與，與線粒體膜通透性及Δψm有關(guān)胞胞粒酶B

受

凋亡主要途激激活

Cyt起始

效應(yīng)

底底PARP、Lamin、PK、DNA-細(xì)胞凋DNA斷裂、細(xì)胞細(xì)胞凋第三細(xì)胞凋亡的調(diào)（一）P53蛋白的調(diào)控作P53的結(jié)構(gòu)C-端的26aa構(gòu)成一個(gè)開(kāi)放的結(jié)構(gòu)域P53正常胞漿P53胞內(nèi)P5被嚴(yán)格 :受tofMdm2)（主要）和的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，通過(guò)泛素降解途徑調(diào)節(jié)P53水平。異常情況下：當(dāng)細(xì)胞A損傷、紡錘體絲斷裂、癌 異常表達(dá)等細(xì)胞生存 時(shí)P53水平迅速升高和活化。P53野生型P53蛋白 如果損傷不能修復(fù)，P53就激活那些誘導(dǎo)凋亡 突變型P53蛋白喪失抑制細(xì)胞惡性增殖功能 突變50%以上腫瘤逃逸凋亡的重要原因本身具有 功能P53蛋白— 衛(wèi)DNA損

因子P53P53P53P53蛋細(xì)胞停滯于G細(xì)胞停滯于G1

P53蛋白 制解鏈(二)Bcl- 蛋白的調(diào)控作成 可能存在的聚合體形 bcl- Bcl-2/Bcl- Bax/Bcl-凋 bcl- Bcl-xL/bcl-xLBcl-2/Bcl-凋 Bax/Bcl-凋 bcl- Bcl-xS/Bcl- Bcl-xS/Bcl-凋 Bad/Bcl- Bad/Bcl-Bcl- region,TM)——Bcl-2定位內(nèi)膜所必需Bcl-2同源結(jié)構(gòu)(Bcl-2homology據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分為三個(gè) ：Bcl-2、bcl-xL等，促進(jìn)細(xì)胞存至少含BH1、2或全部四種 ：Bax、Bak含BH1、23，促進(jìn)凋 ：Bik、Bad、Bid僅含BH3 Bcl-2、Bax和Bcl-x組成一個(gè)凋亡調(diào)控當(dāng)同源二聚體形成時(shí)，便誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；隨表達(dá)量增加，漸多的解聚，形成更穩(wěn)定的2異源二聚體，從而中和了“x”誘導(dǎo)凋亡的作用。即和2比值調(diào)節(jié)凋亡；當(dāng)Bcl-xS存在時(shí)，優(yōu)先形成Bcl-xS/Bcl-2，PossibleModeofbcl-2s（白藜蘆醇）誘導(dǎo)鼻咽癌E2Z細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制 sveratolBcl-2的蛋白水釋放CytC入胞漿

Caspase-9酶 活化的Caspase-Caspase-3、-6細(xì)胞凋第四檢測(cè)細(xì)胞凋亡的常一、凋亡的形態(tài)學(xué)檢查（光鏡、電鏡蘇木素 （HE）染色法甲基綠—派諾寧染色法Giemsa染色法瑞氏(Wright)染色AO-EB染色法（吖啶橙–溴化乙啶透射電子顯微鏡觀察HE染色嗜酸性變及嗜酸性小肝細(xì)胞體積縮小，胞漿濃縮紅染，呈嗜酸性變；或胞漿進(jìn)一步濃縮，細(xì)胞變圓，核碎裂、溶解 ，呈嗜酸性小體狀甲基綠-派諾寧染色AO-染色Humanlymphomacellstreatedwiththechemotherapyagentcamptothecin（喜樹(shù)堿正常細(xì)二、熒光顯微鏡觀察吖啶橙染色法Hoechst染色染色

三、凋亡細(xì)胞的生化特征的檢（一）瓊脂糖凝膠電泳 axel axel BCap37BCap37MCF7(二)原位末端標(biāo)記技(insituend–labeling,原理:凋亡時(shí)斷裂，利用末端A轉(zhuǎn)移酶（TdT）或A聚合酶將帶有生物素（或熒光素）標(biāo)記的核苷酸（biotin-16-）摻入到斷裂的A的3’端，再使其與帶有的親和素蛋白結(jié)合，經(jīng)顯色后，可觀察到細(xì)胞內(nèi)是否存在N 段。主要方法有3種原位缺口平移法（ISNT）：DNA聚合酶I介原位末端標(biāo)記法：klenow大片段介T(mén)dT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)：該法特異性和敏感性較高，可檢出早期的凋亡細(xì)胞ISNTandTUNELTUNEL鑒定的原理基于細(xì)胞凋亡時(shí)產(chǎn)生DNA斷鏈，所介導(dǎo)的酶是TdT，該酶能將外源性的生物素或地高辛標(biāo)記的dUTP無(wú)需DNA模板連接到凋亡細(xì)胞核的DNA斷鏈的3-羥基(3'-0H〉末端，DNA斷鏈可是單股斷鏈也可是雙股斷鏈，兩種斷鏈都有游離的3'-羥基末端，因此，TUNEL鑒定可以檢測(cè)凋亡細(xì)胞核中的單股和雙股DNA斷鏈。蘇木素染色-四、凋亡細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢基本操作步驟離心收集細(xì)胞---重懸于70%乙醇20℃固定24小時(shí)離心后重懸細(xì)胞PBS緩沖液---加碘化丙啶（imiodide,P）染色(含aA),37保溫30mi流式細(xì)胞術(shù)分析亦可用PI/Hoechst雙染通過(guò)亞二倍體峰（亞G1峰）---（apoptoticpeak,AP)的有無(wú)及面積積分來(lái)流式細(xì)胞術(shù) ysisofapoptoticpeak(Ap)byflowcytometryaftertreatmeatwithHHTfor8h B：1μg/mlHHT流式細(xì)胞術(shù)

五、磷脂酰絲氨酸（PS）外翻分析（Annexin法nV是一種分子量為D的C2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將nnV進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的nV作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種酸，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將nV與P匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。六、線粒體膜勢(shì)能的檢 如Rhodamine123、DiOC6、TMRM等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，七、Caspase-3活性的檢在凋亡的早期階段，Caspase-3被激活， 例如：Westernblot分析Procaspase-第六細(xì)胞凋亡與疾細(xì)胞凋亡與疾病發(fā)與細(xì)胞凋亡不足有 與細(xì)胞凋亡過(guò)度有 淋巴P53突變依賴于激素引起的2自身免疫性疾病免疫介導(dǎo)的腎小管腎

老年癡再生 貧缺血性損肝免疫排斥反 （一）細(xì)胞凋亡不足引起的疾自身免疫性疾正常異常巴細(xì)胞被激活，產(chǎn)生大量的效應(yīng)細(xì)胞靶發(fā)病的分子機(jī)制淋巴細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一個(gè)關(guān)鍵分子是細(xì)胞表受體Fas（又稱APO或CD95）Fas受體與Fa