RNA的生物合成課件

11RNA的生物合成Chapter11RNABiosynthesis,Transcription11RNA的生物合成1本章重點與難點重點：掌握RNA生物合成方式、酶類及合成后加工，RNA合成后加工的意義，RNA合成的起始與終止、RNA的復制、核酶。難點：RNA合成的起始與終止；真核生物RNA轉錄后加工；核酶。本章重點與難點2一、轉錄(transcription)生物體以DNA為模板合成RNA的過程。

轉錄RNADNA

一、轉錄(transcription)轉錄RNADNA3復制和轉錄的區(qū)別復制和轉錄的區(qū)別4參與轉錄的物質原料:

NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:

DNA酶:

RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)其他蛋白質因子參與轉錄的物質原料:NTP(ATP,UTP,GTP5（一）轉錄模板DNA上為一種或幾種蛋白質的全部氨基酸編碼的核苷酸順序稱為基因。DNA分子上編碼蛋白質的基因片段，稱為結構基因(structuralgene)。DNA上有重復基因、重疊基因和不連續(xù)基因。DNA上插入而不編碼的序列稱為內含子被間隔的編碼蛋白質的基因部分稱為外顯子。（一）轉錄模板DNA上為一種或幾種蛋白質的全部氨基酸編碼的65′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C編碼鏈模板鏈mRNA蛋白質轉錄翻譯DNA雙鏈中按堿基配對規(guī)律能指導轉錄生成RNA的一股單鏈，稱為模板鏈(templatestrand)，也稱作有意義鏈或Watson鏈。相對的另一股單鏈是編碼鏈(codingstrand)，也稱為反義鏈或Crick鏈。5′···GCAGTACATGTC···3′3′···c75335模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈結構基因轉錄方向轉錄方向53模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈結構基因轉錄方向轉錄方向8不對稱轉錄(asymmetrictranscription)

在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用作模板指引轉錄，另一股鏈不轉錄；模板鏈并非永遠在同一條單鏈上。不對稱轉錄(asymmetrictranscription9（二)RNA聚合酶1、原核生物的RNA聚合酶（二)RNA聚合酶1、原核生物的RNA聚合酶10核心酶(coreenzyme)全酶(holoenzyme)核心酶(coreenzyme)全酶(holoenzym11RNA聚合酶全酶在轉錄起始區(qū)的結合RNA聚合酶全酶在轉錄起始區(qū)的結合122、真核生物的RNA聚合酶2、真核生物的RNA聚合酶13（三）模板上酶的辨認、結合原核生物一個轉錄區(qū)段可視為一個轉錄單位，稱為操縱子(operon)，包括若干個結構基因及其上游(upstream)的調控序列。

5335結構基因調控序列RNA-polRNA聚合酶結合模板DNA的部位，稱為啟動子(promoter)。（三）模板上酶的辨認、結合原核生物一個轉錄區(qū)段可視為一個轉錄14開始轉錄TTGACAAACTGT-35區(qū)(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205335原核生物啟動子保守序列RNA-pol辨認位點(recognitionsite)55RNA聚合酶保護區(qū)結構基因33開始轉錄TTGACA-35區(qū)(Pribnowb15TATA盒CAAT盒GC盒

增強子

順式作用元件結構基因-GCGC---CAAT---TATA轉錄起始真核生物啟動子保守序列TATA盒CAAT盒GC盒增強子順式作用元件結161）轉錄起始轉錄起始需解決兩個問題：RNA聚合酶必須準確地結合在轉錄模板的起始區(qū)域。DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉錄的模板。（四）原核生物的轉錄過程1）轉錄起始轉錄起始需解決兩個問題：（四）原核生物的轉錄過程172.DNA雙鏈解開1.RNA聚合酶全酶(2)與模板結合3.在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應，形成轉錄起始復合物RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3轉錄起始復合物:5-pppG-OH+

NTP5-pppGpN

-OH3+ppi轉錄起始過程2.DNA雙鏈解開1.RNA聚合酶全酶(2)與182）轉錄延長1.亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構，與模板結合松弛，沿著DNA模板前移；

2.在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。(NMP)n

+

NTP(NMP)n+1

+PPi2）轉錄延長1.亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構19轉錄空泡(transcriptionbubble)：RNA-pol（核心酶）

····DNA

····RNA轉錄空泡(transcriptionbubble)：RNA20RNA的生物合成課件2153DNA原核生物轉錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象核糖體RNARNA聚合酶53DNA原核生物轉錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象核糖體RNARN22依賴Rho(ρ)因子的轉錄終止非依賴Rho因子的轉錄終止3）轉錄終止指RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進，轉錄產物RNA鏈從轉錄復合物上脫落下來。分類依賴Rho(ρ)因子的轉錄終止3）轉錄終止指RNA聚合酶在23ATP1.依賴Rho因子的轉錄終止ATP1.依賴Rho因子的轉錄終止242.非依賴Rho因子的轉錄終止DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉錄出RNA后，RNA產物形成特殊的結構來終止轉錄。2.非依賴Rho因子的轉錄終止DNA模板上靠近終止處，有255`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`

RNA5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT...3DNAUUUU...…UUUU...…5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`莖環(huán)(stem-loop)/發(fā)夾(hairpin)結構5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGC26莖環(huán)結構使轉錄終止的機理使RNA聚合酶變構，轉錄停頓；使轉錄復合物趨于解離，RNA產物釋放。5′pppG5335RNA-pol莖環(huán)結構使轉錄終止的機理使RNA聚合酶變構，轉錄停頓；5′27（五）真核生物的轉錄起始1）轉錄起始真核生物的轉錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化，轉錄起始時，RNA-pol不直接結合模板，其起始過程比原核生物復雜。（五）真核生物的轉錄起始1）轉錄起始真核生物的轉錄起始上游區(qū)28轉錄起始點TATA盒CAAT盒GC盒增強子順式作用元件(cis-actingelement)1.轉錄起始前的上游區(qū)段AATAAA切離加尾轉錄終止點修飾點外顯子翻譯起始點內含子OCT-1OCT-1：ATTTGCAT八聚體轉錄起始點TATA盒CAAT盒GC盒增強子順式作用元件(292.轉錄因子能直接、間接辨認和結合轉錄上游區(qū)段DNA的蛋白質，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種，統(tǒng)稱為反式作用因子(trans-actingfactors)。反式作用因子中，直接或間接結合RNA聚合酶的，則稱為轉錄因子(transcriptionalfactors,TF)。2.轉錄因子能直接、間接辨認和結合轉錄上游區(qū)段DNA的蛋30參與RNA-polⅡ轉錄的TFⅡ

參與RNA-polⅡ轉錄的TFⅡ313.轉錄起始前復合物(pre-initiationcomplex,PIC)

真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結合，而需依靠眾多的轉錄因子。3.轉錄起始前復合物真核生物RNA-pol不與DNA分子直32POL-ⅡTFⅡFⅡAⅡB由RNA-PolⅡ催化轉錄的PICPOL-ⅡTFⅡFⅡHⅡETBPTAFTFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA復合物TATAⅡAⅡBTBPTAFTATAⅡHⅡECTD-PPIC組裝完成，TFⅡH使CTD磷酸化POL-ⅡTFⅡFⅡAⅡB由RNA-PolⅡ催化轉錄的PI332）轉錄延長真核生物轉錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉錄與翻譯同步的現(xiàn)象。RNA-pol前移處處都遇上核小體。轉錄延長過程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。2）轉錄延長真核生物轉錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核34RNA-PolRNA-PolRNA-Pol核小體轉錄延長中的核小體移位轉錄方向RNA-PolRNA-PolRNA-Pol核小體轉錄延長中的355------AAUAAA-5------AAUAAA--核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAAGTGTGTG轉錄終止的修飾點55333加尾AAAAAAA······3mRNA3）轉錄終止——和轉錄后修飾密切相關。5------AAUAAA-5------AAUAAA36幾種主要的修飾方式1.剪接(splicing)2.剪切(cleavage)3.修飾(modification)4.添加(addition)二、RNA轉錄后的修飾Post-transcriptionalModification幾種主要的修飾方式1.剪接(splicing)2.剪切(37（一）真核生物mRNA的轉錄后加工1、首、尾的修飾5端形成帽子結構(m7GpppGp—)3端加上多聚腺苷酸尾巴(polyAtail)（一）真核生物mRNA的轉錄后加工1、首、尾的修飾5端38帽子結構帽子結構395pppGp…5GpppGp…pppGppi鳥苷酸轉移酶5

m7GpppGp…甲基轉移酶SAM帽子結構的生成5ppGp…磷酸酶Pi5pppGp…5GpppGp…pppGppi鳥苷酸402）mRNA的剪接1.

hnRNA和snRNA核內的初級mRNA稱為雜化核RNA(hetero-nuclearRNA,hnRNA)snRNA(smallnuclearRNA)核內的蛋白質小分子核糖核酸蛋白體（并接體,splicesome）snRNA2）mRNA的剪接1.hnRNA和snRNA核內的初41真核生物結構基因，由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質，這些基因稱為斷裂基因。斷裂基因(splitegene)CABD編碼區(qū)A、B、C、D非編碼區(qū)真核生物結構基因，由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)422.外顯子(exon)和內含子(intron)外顯子在斷裂基因及其初級轉錄產物上出現(xiàn)，并表達為成熟RNA的核酸序列。內含子隔斷基因的線性表達而在剪接過程中被除去的核酸序列。2.外顯子(exon)和內含子(intron)外顯子43雞卵清蛋白基因hnRNA首、尾修飾hnRNA剪接成熟的mRNA雞卵清蛋白基因及其轉錄、轉錄后修飾雞卵清蛋白基因hnRNA首、尾修飾hnRNA剪接成熟的mRN44雞卵清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖DNAmRNA雞卵清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖DNAmRNA453.內含子的分類根據(jù)基因的類型和剪接的方式，通常把內含子分為4類。I：主要存在于線粒體、葉綠體及某些低等真核生物的rRNA基因；II：也發(fā)現(xiàn)于線粒體、葉綠體，轉錄產物是mRNA；III：是常見的形成套索結構后剪接，大多數(shù)mRNA基因有此類內含子；IV：是tRNA基因及其初級轉錄產物中的內含子，剪接過程需酶及ATP。3.內含子的分類根據(jù)基因的類型和剪接的方式，通常把內含子464.mRNA的剪接——除去hnRNA中的內含子，將外顯子連接。snRNP與hnRNA結合成為并接體①4.mRNA的剪接——除去hnRNA中的內含子，將外顯子47②③UACUACA-AGUGU4U5U6E1E2U1U2UACUACA-AGUGU6E1E2U1、U4、U5②③UACUACA-AGUGU4U5U6E1E2U1U248pG-OH(ppG-OH,pppG-OH)U-OHGpUpGpA第一次轉酯反應第二次轉酯反應UpAGpU外顯子1內含子外顯子2G-OHUpUpGpApG-OHU-OHGpUpGpA第一次轉酯反應第二次轉酯反應49?RNA編輯作用說明，基因的編碼序列經過轉錄后加工，是可有多用途分化的，因此也稱為分化加工(differentialRNAprocessing)。5.mRNA的編輯(mRNAediting)人類apoB基因mRNA（14500個核苷酸）肝臟apoB100（分子量為500000）腸道細胞apoB48（分子量為240000）mRNA編輯?RNA編輯作用說明，基因的編碼序列經過轉錄后加工，是可有50（二）tRNA的轉錄后加工tRNA前體RNApolⅢTGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNA（二）tRNA的轉錄后加工tRNA前體RNApolⅢTG51RNAaseP、內切酶RNAaseP、內切酶52tRNA核苷酸轉移酶、連接酶ATPADPtRNA核苷酸轉移酶、連接酶ATPADP53堿基修飾（2）還原反應如：UDHU（3）核苷內的轉位反應如：Uψ（4）脫氨反應如：AI如：AAm（1）甲基化（1）（1）（3）（2）（4）堿基修飾（2）還原反應如：UDHU（3）核苷內的54（三）rRNA的轉錄后加工轉錄45S-rRNA剪接18S-rRNA5.8S和28S-rRNArDNA內含子內含子28S5.8S18S（三）rRNA的轉錄后加工轉錄45S-rRNA剪接18S55三、真核生物與原核生物轉錄的異同點P212－213相同點：不同點：四點三、真核生物與原核生物轉錄的異同點P212－21356四、核酶具有酶促活性的RNA稱為核酶。核酶(ribozyme)四、核酶具有酶促活性的RNA稱為核酶。核酶(riboz57四膜蟲rRNA內含子的二級結構四膜蟲rRNA的剪接采用自我剪接方式5′-端核苷酸序列四膜蟲rRNA內含子的二級結構四膜蟲rRNA的剪接采用自我剪58最簡單的核酶二級結構——槌頭狀結構(hammerheadstructure)底物部分通常為60個核苷酸左右同一分子上包括有催化部份和底物部份催化部份和底物部份組成錘頭結構除rRNA外，tRNA、mRNA的加工也可采用自我剪接方式。最簡單的核酶二級結構——槌頭狀結構底物部分通常為60個核苷酸59GOH3′G5′OH5′3′GOH414G3995′3′3955′3′E1E2I四膜蟲RNA的自我剪接5′3′L19RNA具有催化活性的片段GOH3′G5′OH5′3′GOH414G3995′3′360核酶研究的意義核酶的發(fā)現(xiàn)，對中心法則作了重要補充；核酶的發(fā)現(xiàn)是對傳統(tǒng)酶學的挑戰(zhàn)；利用核酶的結構設計合成人工核酶。核酶研究的意義核酶的發(fā)現(xiàn)，對中心法則作了重要補充；61人工設計的核酶粗線表示合成的核酸分子細線表示天然的核酸分子X表示一致性序列箭頭表示切斷點人工設計的核酶粗線表示合成的核酸分子623B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNG4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYnVjSgOdL6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdI6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$6311RNA的生物合成Chapter11RNABiosynthesis,Transcription11RNA的生物合成64本章重點與難點重點：掌握RNA生物合成方式、酶類及合成后加工，RNA合成后加工的意義，RNA合成的起始與終止、RNA的復制、核酶。難點：RNA合成的起始與終止；真核生物RNA轉錄后加工；核酶。本章重點與難點65一、轉錄(transcription)生物體以DNA為模板合成RNA的過程。

轉錄RNADNA

一、轉錄(transcription)轉錄RNADNA66復制和轉錄的區(qū)別復制和轉錄的區(qū)別67參與轉錄的物質原料:

NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:

DNA酶:

RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)其他蛋白質因子參與轉錄的物質原料:NTP(ATP,UTP,GTP68（一）轉錄模板DNA上為一種或幾種蛋白質的全部氨基酸編碼的核苷酸順序稱為基因。DNA分子上編碼蛋白質的基因片段，稱為結構基因(structuralgene)。DNA上有重復基因、重疊基因和不連續(xù)基因。DNA上插入而不編碼的序列稱為內含子被間隔的編碼蛋白質的基因部分稱為外顯子。（一）轉錄模板DNA上為一種或幾種蛋白質的全部氨基酸編碼的695′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C編碼鏈模板鏈mRNA蛋白質轉錄翻譯DNA雙鏈中按堿基配對規(guī)律能指導轉錄生成RNA的一股單鏈，稱為模板鏈(templatestrand)，也稱作有意義鏈或Watson鏈。相對的另一股單鏈是編碼鏈(codingstrand)，也稱為反義鏈或Crick鏈。5′···GCAGTACATGTC···3′3′···c705335模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈結構基因轉錄方向轉錄方向53模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈結構基因轉錄方向轉錄方向71不對稱轉錄(asymmetrictranscription)

在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用作模板指引轉錄，另一股鏈不轉錄；模板鏈并非永遠在同一條單鏈上。不對稱轉錄(asymmetrictranscription72（二)RNA聚合酶1、原核生物的RNA聚合酶（二)RNA聚合酶1、原核生物的RNA聚合酶73核心酶(coreenzyme)全酶(holoenzyme)核心酶(coreenzyme)全酶(holoenzym74RNA聚合酶全酶在轉錄起始區(qū)的結合RNA聚合酶全酶在轉錄起始區(qū)的結合752、真核生物的RNA聚合酶2、真核生物的RNA聚合酶76（三）模板上酶的辨認、結合原核生物一個轉錄區(qū)段可視為一個轉錄單位，稱為操縱子(operon)，包括若干個結構基因及其上游(upstream)的調控序列。

5335結構基因調控序列RNA-polRNA聚合酶結合模板DNA的部位，稱為啟動子(promoter)。（三）模板上酶的辨認、結合原核生物一個轉錄區(qū)段可視為一個轉錄77開始轉錄TTGACAAACTGT-35區(qū)(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205335原核生物啟動子保守序列RNA-pol辨認位點(recognitionsite)55RNA聚合酶保護區(qū)結構基因33開始轉錄TTGACA-35區(qū)(Pribnowb78TATA盒CAAT盒GC盒

增強子

順式作用元件結構基因-GCGC---CAAT---TATA轉錄起始真核生物啟動子保守序列TATA盒CAAT盒GC盒增強子順式作用元件結791）轉錄起始轉錄起始需解決兩個問題：RNA聚合酶必須準確地結合在轉錄模板的起始區(qū)域。DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉錄的模板。（四）原核生物的轉錄過程1）轉錄起始轉錄起始需解決兩個問題：（四）原核生物的轉錄過程802.DNA雙鏈解開1.RNA聚合酶全酶(2)與模板結合3.在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應，形成轉錄起始復合物RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3轉錄起始復合物:5-pppG-OH+

NTP5-pppGpN

-OH3+ppi轉錄起始過程2.DNA雙鏈解開1.RNA聚合酶全酶(2)與812）轉錄延長1.亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構，與模板結合松弛，沿著DNA模板前移；

2.在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。(NMP)n

+

NTP(NMP)n+1

+PPi2）轉錄延長1.亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構82轉錄空泡(transcriptionbubble)：RNA-pol（核心酶）

····DNA

····RNA轉錄空泡(transcriptionbubble)：RNA83RNA的生物合成課件8453DNA原核生物轉錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象核糖體RNARNA聚合酶53DNA原核生物轉錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象核糖體RNARN85依賴Rho(ρ)因子的轉錄終止非依賴Rho因子的轉錄終止3）轉錄終止指RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進，轉錄產物RNA鏈從轉錄復合物上脫落下來。分類依賴Rho(ρ)因子的轉錄終止3）轉錄終止指RNA聚合酶在86ATP1.依賴Rho因子的轉錄終止ATP1.依賴Rho因子的轉錄終止872.非依賴Rho因子的轉錄終止DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉錄出RNA后，RNA產物形成特殊的結構來終止轉錄。2.非依賴Rho因子的轉錄終止DNA模板上靠近終止處，有885`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`

RNA5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT...3DNAUUUU...…UUUU...…5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`莖環(huán)(stem-loop)/發(fā)夾(hairpin)結構5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGC89莖環(huán)結構使轉錄終止的機理使RNA聚合酶變構，轉錄停頓；使轉錄復合物趨于解離，RNA產物釋放。5′pppG5335RNA-pol莖環(huán)結構使轉錄終止的機理使RNA聚合酶變構，轉錄停頓；5′90（五）真核生物的轉錄起始1）轉錄起始真核生物的轉錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化，轉錄起始時，RNA-pol不直接結合模板，其起始過程比原核生物復雜。（五）真核生物的轉錄起始1）轉錄起始真核生物的轉錄起始上游區(qū)91轉錄起始點TATA盒CAAT盒GC盒增強子順式作用元件(cis-actingelement)1.轉錄起始前的上游區(qū)段AATAAA切離加尾轉錄終止點修飾點外顯子翻譯起始點內含子OCT-1OCT-1：ATTTGCAT八聚體轉錄起始點TATA盒CAAT盒GC盒增強子順式作用元件(922.轉錄因子能直接、間接辨認和結合轉錄上游區(qū)段DNA的蛋白質，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種，統(tǒng)稱為反式作用因子(trans-actingfactors)。反式作用因子中，直接或間接結合RNA聚合酶的，則稱為轉錄因子(transcriptionalfactors,TF)。2.轉錄因子能直接、間接辨認和結合轉錄上游區(qū)段DNA的蛋93參與RNA-polⅡ轉錄的TFⅡ

參與RNA-polⅡ轉錄的TFⅡ943.轉錄起始前復合物(pre-initiationcomplex,PIC)

真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結合，而需依靠眾多的轉錄因子。3.轉錄起始前復合物真核生物RNA-pol不與DNA分子直95POL-ⅡTFⅡFⅡAⅡB由RNA-PolⅡ催化轉錄的PICPOL-ⅡTFⅡFⅡHⅡETBPTAFTFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA復合物TATAⅡAⅡBTBPTAFTATAⅡHⅡECTD-PPIC組裝完成，TFⅡH使CTD磷酸化POL-ⅡTFⅡFⅡAⅡB由RNA-PolⅡ催化轉錄的PI962）轉錄延長真核生物轉錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉錄與翻譯同步的現(xiàn)象。RNA-pol前移處處都遇上核小體。轉錄延長過程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。2）轉錄延長真核生物轉錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核97RNA-PolRNA-PolRNA-Pol核小體轉錄延長中的核小體移位轉錄方向RNA-PolRNA-PolRNA-Pol核小體轉錄延長中的985------AAUAAA-5------AAUAAA--核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAAGTGTGTG轉錄終止的修飾點55333加尾AAAAAAA······3mRNA3）轉錄終止——和轉錄后修飾密切相關。5------AAUAAA-5------AAUAAA99幾種主要的修飾方式1.剪接(splicing)2.剪切(cleavage)3.修飾(modification)4.添加(addition)二、RNA轉錄后的修飾Post-transcriptionalModification幾種主要的修飾方式1.剪接(splicing)2.剪切(100（一）真核生物mRNA的轉錄后加工1、首、尾的修飾5端形成帽子結構(m7GpppGp—)3端加上多聚腺苷酸尾巴(polyAtail)（一）真核生物mRNA的轉錄后加工1、首、尾的修飾5端101帽子結構帽子結構1025pppGp…5GpppGp…pppGppi鳥苷酸轉移酶5

m7GpppGp…甲基轉移酶SAM帽子結構的生成5ppGp…磷酸酶Pi5pppGp…5GpppGp…pppGppi鳥苷酸1032）mRNA的剪接1.

hnRNA和snRNA核內的初級mRNA稱為雜化核RNA(hetero-nuclearRNA,hnRNA)snRNA(smallnuclearRNA)核內的蛋白質小分子核糖核酸蛋白體（并接體,splicesome）snRNA2）mRNA的剪接1.hnRNA和snRNA核內的初104真核生物結構基因，由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質，這些基因稱為斷裂基因。斷裂基因(splitegene)CABD編碼區(qū)A、B、C、D非編碼區(qū)真核生物結構基因，由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)1052.外顯子(exon)和內含子(intron)外顯子在斷裂基因及其初級轉錄產物上出現(xiàn)，并表達為成熟RNA的核酸序列。內含子隔斷基因的線性表達而在剪接過程中被除去的核酸序列。2.外顯子(exon)和內含子(intron)外顯子106雞卵清蛋白基因hnRNA首、尾修飾hnRNA剪接成熟的mRNA雞卵清蛋白基因及其轉錄、轉錄后修飾雞卵清蛋白基因hnRNA首、尾修飾hnRNA剪接成熟的mRN107雞卵清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖DNAmRNA雞卵清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖DNAmRNA1083.內含子的分類根據(jù)基因的類型和剪接的方式，通常把內含子分為4類。I：主要存在于線粒體、葉綠體及某些低等真核生物的rRNA基因；II：也發(fā)現(xiàn)于線粒體、葉綠體，轉錄產物是mRNA；III：是常見的形成套索結構后剪接，大多數(shù)mRNA基因有此類內含子；IV：是tRNA基因及其初級轉錄產物中的內含子，剪接過程需酶及ATP。3.內含子的分類根據(jù)基因的類型和剪接的方式，通常把內含子1094.mRNA的剪接——除去hnRNA中的內含子，將外顯子連接。snRNP與hnRNA結合成為并接體①4.mRNA的剪接——除去hnRNA中的內含子，將外顯子110②③UACUACA-AGUGU4U5U6E1E2U1U2UACUACA-AGUGU6E1E2U1、U4、U5②③UACUACA-AGUGU4U5U6E1E2U1U2111pG-OH(ppG-OH,pppG-OH)U-OHGpUpGpA第一次轉酯反應第二次轉酯反應UpAGpU外顯子1內含子外顯子2G-OHUpUpGpApG-OHU-OHGpUpGpA第一次轉酯反應第二次轉酯反應112?RNA編輯作用說明，基因的編碼序列經過轉錄后加工，是可有多用途分化的，因此也稱為分化加工(differentialRNAprocessing)。5.mRNA的編輯(mRNAediting)人類apoB基因mRNA（14500個核苷酸）肝臟apoB100（分子量為500000）腸道細胞apoB48（分子量為240000）mRNA編輯?RNA編輯作用說明，基因的編碼序列經過轉錄后加工，是可有113（二）tRNA的轉錄后加工tRNA前體RNApolⅢTGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNA（二）tRNA的轉錄后加工tRNA前體RNApolⅢTG114RNAaseP、內切酶RNAaseP、內切酶115tRNA核苷酸轉移酶、連接酶ATPADPtRNA核苷酸轉移酶、連接酶ATPADP116堿基修飾（2）還原反應如：UDHU（3）核苷內的轉位反應如：Uψ（4）脫氨反應如：AI如：AAm（1）甲基化（1）（1）（3）（2）（4）堿基修飾（2）還原反應如：UDHU（3）核苷內的117（三）rRNA的轉錄后加工轉錄45S-rRNA剪接18S-rRNA5.8S和28S-rRNArDNA內含子內含子28S5.8S18S（三）rRNA的轉錄后加工轉錄45S-rRNA剪接18S118三、真核生物與原核生物轉錄的異同點P212－213相同點：不同點：四點三、真核生物與原核生物轉錄的異同點P212－213119四、核酶具有酶促活性的RNA稱為核酶。核酶(ribozyme)四、核酶具有酶促活性的RNA稱為核酶。核酶(riboz120四膜蟲rRNA內含子的二級結構四膜蟲rRNA的剪接采用自我剪接方式5′-端核苷酸序列四膜蟲rRNA內含子的二級結構四膜蟲rRNA的剪接采用自我剪121最簡單的核酶二級結構——槌頭狀結構(hammerheadstructure)底物部分通常為60個核苷酸左右同一分子上包括有催化部份和底物部份催化部份和底物部份組成錘頭結構除rRNA外，tRNA、mRNA的加工也可采用自我剪接方式。最簡單的核酶二級結構——槌頭狀結構底物部分通常為60個核苷酸122GOH3′G5′OH5′3′GOH414G3995′3′3955′3′E1E2I四膜蟲RNA的自我剪接5′3′L19RNA具有催化活性的片段GOH3′G5′OH5′3′GOH414G3995′3′3123核酶研究的意義核酶的發(fā)現(xiàn)，對中心法則作了重要補充；核酶的發(fā)現(xiàn)是對傳統(tǒng)酶學的挑戰(zhàn)；利用核酶的結構設計合成人工核酶。核酶研究的意義核酶的發(fā)現(xiàn)，對中心法則作了重要補充；124人工設計的核酶粗線表示合成的核酸分子細線表示天然的核酸分子X表示一致性序列箭頭表示切斷點人工設計的核酶粗線表示合成的核酸分子1253B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNG4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D