液相色譜實(shí)驗(yàn)具體方案

實(shí)驗(yàn)安排一、流動(dòng)相pH對(duì)分離度影響的實(shí)驗(yàn)1.概況1)實(shí)驗(yàn)?zāi)康目疾炝鲃?dòng)相pH值對(duì)目標(biāo)化合物保留時(shí)間的影響。2)分析對(duì)象苯酚（phenol），苯甲酸（benzoicacid），對(duì)甲基苯甲酸（4-methylbenzoicacid）3)分析條件色譜柱：InertsilODS-SP,4.6mmI.D.×150mmL.,5μm保護(hù)柱：ODS-SPGuardColumn,4.0mmI.D.流動(dòng)相：三種不同的流動(dòng)相(a)水/甲醇=4/6(v/v)(b)[10mM磷酸鹽緩沖液（pH7.0）]/甲醇=4/6(v/v)(c)[10mM磷酸鹽緩沖液(pH2.6)]/甲醇=4/6(v/v)流速：0.8mL/min柱溫：40℃波長(zhǎng)：260nm進(jìn)樣體積：10μL4)樣品Phenol(A1):100mg/LBenzoicacid(A2):100mg/L4-methylbenzoicacid:100mg/L以上3種化合物混標(biāo)(A3)：各100mg/L5)目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)式2.實(shí)驗(yàn)方案1)完整過程?使用流動(dòng)相(a),進(jìn)10μL(A3)樣品。?將流動(dòng)相依次換成（b）和（c），重復(fù)以上步驟。?得到以上3個(gè)色譜圖后，進(jìn)10μL單標(biāo)（A1）和（A2），確認(rèn)各個(gè)峰所對(duì)應(yīng)的化合物。?比較不同條件下得到的色譜圖的區(qū)別。2)緩沖液制備?制備10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)二水磷酸二氫鈉（分子量156.01）：5mmol（0.78g）十二水磷酸氫二鈉（分子量358.14）：5mmol（1.79g）稱取以上兩種試劑，用水定容到1L。?制備10mM磷酸鹽緩沖液(pH2.6)磷酸(85%,14.8mol/L)：5mmol(0.34mL)二水磷酸二氫鈉（分子量156.01）：5mmol(0.78g)稱?。咳。┮陨蟽煞N試劑，用水定容到1L。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果流動(dòng)相條件色譜圖(a)水/甲醇=4/6(b)[10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)]/甲醇=4/6(c)[10mM磷酸鹽緩沖液4.知識(shí)點(diǎn)1)流動(dòng)相中用到的緩沖液的制備?酸解離平衡常數(shù)?pH緩沖液的制備?為什么在HPLC中經(jīng)常用到磷酸緩沖液？2)反相色譜中分析酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)時(shí)所使用的流動(dòng)相?分析酸性物質(zhì)用到的流動(dòng)相?分析堿性物質(zhì)用到的流動(dòng)相?如何解決分析堿性物質(zhì)時(shí)經(jīng)常碰到的問題?什么是“反相離子對(duì)色譜”3)除了反相色譜外還有哪些分離模式?正相色譜?離子交換色譜?體積排阻色譜二、柱溫對(duì)分離度影響的實(shí)驗(yàn)1.概況1)實(shí)驗(yàn)?zāi)康目疾熘鶞貙?duì)目標(biāo)化合物保留時(shí)間的影響。2)分析對(duì)象苯甲酸(benzoicacid)，山梨酸(sorbicacid)和對(duì)羥基苯甲酸甲酯(methylparaben)3)分析條件色譜柱：InertsilODS-SP,4.6mmI.D.×150mmL.,5μm保護(hù)柱：ODS-SPGuardColumn,4.0mmI.D.流動(dòng)相：[10mM磷酸鈉緩沖液(pH2.6)]/乙腈=75/25(v/v)流速：1.0mL/min柱溫：40℃和20℃波長(zhǎng)：240nm進(jìn)樣體積：10μL4)樣品Benzoicacid(B1):100mg/LSorbicacid(B2):100mg/Lmethylparaben:100mg/L以上3種化合物混標(biāo)(B3)：各100mg/L5)目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)式2.實(shí)驗(yàn)方案1)完整過程?在柱溫40℃和20℃的條件下，分別進(jìn)10μL(B3)樣品。?得到以上2個(gè)色譜圖后，進(jìn)10μL單標(biāo)(B1)和(B2)，確認(rèn)各個(gè)峰所對(duì)應(yīng)的化合物。?比較不同柱溫下得到的色譜圖的區(qū)別。2)緩沖液制備?同實(shí)驗(yàn)一3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果柱溫條件色譜圖(a)柱溫40℃(b)柱溫20℃4.知識(shí)點(diǎn)1)升高柱溫可能帶來的影響?峰的保留時(shí)間變短?流動(dòng)相粘度降低?柱壓降低?峰的理論塔板數(shù)升高2)何種情況下可以考慮改變柱溫?化合物的分子量顯著不同時(shí)?組分洗脫慢時(shí)?適用離子交換色譜和離子對(duì)色譜時(shí)三、進(jìn)樣條件對(duì)峰形影響的實(shí)驗(yàn)1.概況1)實(shí)驗(yàn)?zāi)康目疾鞓悠啡軇┖瓦M(jìn)樣體積對(duì)峰形的影響。2)分析對(duì)象咖啡因(caffein)3)分析條件色譜柱：InertsilODS-SP,4.6mmI.D.×150mmL.,5μm保護(hù)柱：ODS-SPGuardColumn,4.0mmI.D.流動(dòng)相：[10mM磷酸鈉緩沖液(pH2.6)]/甲醇=7/3(v/v)流速：0.8mL/min柱溫：40℃波長(zhǎng)：272nm進(jìn)樣體積：10μL4)樣品咖啡因的乙醇溶液(C1):100mg/L咖啡因的水溶液(C2):100mg/L5)目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)式2.實(shí)驗(yàn)方案1)完整過程?進(jìn)C1和C2樣品各20μL。如果峰形不正常，思考原因。?進(jìn)樣體積減少到5μL，觀察峰形變化情況。2)緩沖液制備?同實(shí)驗(yàn)一3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)樣條件色譜圖(a)C1樣品20μL(b)C2樣品20μL4.知識(shí)點(diǎn)1)如何選擇溶解樣品的溶劑？為什么？四、定量分析實(shí)驗(yàn)1.概況1)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握如何使用校準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析的方法。?掌握對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行最基本的前處理操作。?掌握LCSolution軟件定量操作2)分析對(duì)象目標(biāo)化合物：咖啡因(caffein)未知樣品：綠茶，紅茶和咖啡3)分析條件色譜柱：InertsilODS-SP,4.6mmI.D.×150mmL.,5μm保護(hù)柱：ODS-SPGuardColumn,4.0mmI.D.流動(dòng)相：[10mM磷酸鈉緩沖液(pH2.6)]/甲醇=7/3(v/v)流速：0.8mL/min柱溫：40℃波長(zhǎng)：272nm進(jìn)樣體積：10μL4)標(biāo)樣咖啡因溶液(D1)：5mg/L咖啡因溶液(D2)：10mg/L咖啡因溶液(D3)：20mg/L咖啡因溶液(D4)：40mg/L咖啡因溶液(D5)：80mg/L5)未知樣品處理取綠茶，紅茶和咖啡，各稀釋10倍后，用0.45μm一次性過濾頭過濾后裝入樣品瓶中。6)目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)式見實(shí)驗(yàn)三2.實(shí)驗(yàn)方案1)完整過程?D1到D5共5個(gè)標(biāo)樣各進(jìn)10μL。在坐標(biāo)紙上繪制出校準(zhǔn)曲線。?使用LCSolution建立校準(zhǔn)曲線。?對(duì)樣品進(jìn)行前處理后，各進(jìn)10μL。?用軟件和坐標(biāo)紙上的校準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出樣品的濃度。2)緩沖液制備?同實(shí)驗(yàn)一3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品名稱坐標(biāo)紙綠茶峰面積(μV.S)定量結(jié)果(以原始樣品溶液計(jì)，mg/L)LCSolution紅茶咖啡4.知識(shí)點(diǎn)1)如何選擇檢測(cè)器和設(shè)置檢測(cè)器參數(shù)？?檢測(cè)器的選擇性、靈敏度和操作性?理解每個(gè)檢測(cè)器的特點(diǎn)?檢測(cè)波長(zhǎng)應(yīng)如何選擇？2)用校準(zhǔn)曲線來定量時(shí)的事項(xiàng)?建立校準(zhǔn)曲線的方法?外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法的區(qū)別3)樣品前處理?樣品前處理的目的是什么？?進(jìn)樣前，應(yīng)該將所有不能進(jìn)入HPLC系統(tǒng)中的物質(zhì)去除掉。4)如何對(duì)分析方法進(jìn)行驗(yàn)證？?什么是方法驗(yàn)證？?方法驗(yàn)證的項(xiàng)目有哪些？5)使用緩沖液流動(dòng)相時(shí)，分析結(jié)束后應(yīng)該如何清洗系統(tǒng)？五、樣品前處理操作實(shí)驗(yàn)1.概況1)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解樣品前處理操作的基本步驟?掌握固相萃取操作?了解樣品前處理操作中的注意事項(xiàng)2)分析對(duì)象目標(biāo)化合物：三聚氰胺未知樣品：奶粉和牛奶3)分析條件陽離子固相萃取?。夯旌闲完栯x子交換固相萃取住，基質(zhì)為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60mg，3ml或相當(dāng)者。色譜柱：GLScienceInertsilC8,4.6mmI.D.×250mmL.,5μm保護(hù)柱：C8GuardColumn,4.0mmI.D.流動(dòng)相：[10mM檸檬酸和10mM辛烷磺酸鈉緩沖液(pH3.0)]/甲醇=7/3(v/v)流速：1mL/min柱溫：40℃波長(zhǎng)：240nm進(jìn)樣體積：20μL4)標(biāo)樣三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：CAS108-78-01，純度大于99.0%。5)未知樣品牛奶和奶粉樣品若干，添加已知濃度三聚氰胺的牛奶和奶粉加標(biāo)樣品。6)目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)式2.實(shí)驗(yàn)方案1)完整過程?配置緩沖液和標(biāo)樣，進(jìn)樣分析?使用LCSolution建立校準(zhǔn)曲線?對(duì)樣品進(jìn)行前處理后，各進(jìn)20μL?計(jì)算分析結(jié)果和回收率2)緩沖液、標(biāo)樣和樣品制備?離子對(duì)試劑緩沖液制備準(zhǔn)確稱取2.10g檸檬酸和2.16g辛烷磺酸鈉，加入約980mL水溶解，調(diào)節(jié)pH至3.0后，定容至1L備用。?三氯乙酸溶液（1%）準(zhǔn)確稱取10g三氯乙酸于1L的容量瓶中，用水溶解并定容到刻度，混勻后備用。?氨化甲醇溶液制備（5%）準(zhǔn)確量取5mL氨水和95mL甲醇，混勻后備用。?三聚氰胺標(biāo)樣制備準(zhǔn)確稱取100mg（精確到0.1mg）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶中，用甲醇水溶液(甲醇/水=50:50,v/v)溶解并定容至刻度，配制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃避光保存。取濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋成濃度為0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。?樣品制備稱取2g（精確至0.01g）試樣于50mL具塞塑料離心管中，加入15mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超聲提取10min，再振蕩提取10min后，以不低于4000r/min離心10min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤(rùn)濕的濾紙過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL濾液，加入5mL水混勻后做待凈化液，將待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，依次用3mL水和5mL甲醇洗滌，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液洗脫。整個(gè)固相萃取過程流速不超過1mL/min。洗脫液于50℃下用氮?dú)獯蹈?，殘留物（相?dāng)于0.4g樣品）用1mL流動(dòng)相定容，渦旋混合1min，過微孔濾膜后，供HPLC測(cè)定。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品名稱峰面積(μV.S)定量結(jié)果以原始樣品計(jì)