蛋白質(zhì)的分離純化和表征

蛋白質(zhì)的

分離純化和表征◆

一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)◆

二、蛋白質(zhì)分子的大小和空間結(jié)構(gòu)◆

三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀◆

四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則◆

五、蛋白質(zhì)的分離純化方法◆

六、蛋白質(zhì)的含量測(cè)定與純度鑒定蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁(yè)!一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁(yè)!蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁(yè)!蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁(yè)!蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁(yè)!三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與

蛋白質(zhì)的沉淀

（1）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

（2）蛋白質(zhì)的沉淀

分散相質(zhì)點(diǎn)在膠體系統(tǒng)中保持穩(wěn)定，需要具備3個(gè)條件：，分散相的質(zhì)點(diǎn)大小在1～100nm范圍內(nèi)，這樣大小的質(zhì)點(diǎn)在動(dòng)力學(xué)上是穩(wěn)定的，介質(zhì)分子對(duì)這種質(zhì)點(diǎn)碰撞的合力不等于零，使它能在介質(zhì)中作不斷的布朗運(yùn)動(dòng)(Brownmovement)；第二，分散相的質(zhì)點(diǎn)帶有同種凈電荷，互相排斥，不易聚集成大顆而沉淀；第三，分散相的質(zhì)點(diǎn)能與溶劑形成溶劑化層，例如與水形成水化層(hydrationmantle)，質(zhì)點(diǎn)有了水化層，相互間不易靠攏而聚集。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁(yè)!（2）蛋白質(zhì)的沉淀

蛋白質(zhì)在溶液中的穩(wěn)定性是有條件的、相對(duì)的。如果條件發(fā)生改變，破壞了蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中沉淀出來(lái)。蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性既然與質(zhì)點(diǎn)大小、電荷和水化作用有關(guān)，那么很自然，任何影響這些條件的因素都會(huì)影響蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性。

鹽析法

有機(jī)溶劑沉淀法

重金屬鹽沉淀法

生物堿試劑和某些酸類沉淀法

加熱變性沉淀法

蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁(yè)!有機(jī)溶劑沉淀法向蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的極性有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇或丙酮等），因引起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝集而沉淀。有機(jī)溶劑沉淀法，如果控制在低溫下操作并且盡量縮短處理的時(shí)間則可使變性速度減慢。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁(yè)!生物堿試劑和某些酸類沉淀法生物堿試劑是指能引起生物堿沉淀的一類試劑，如驟酸也稱單寧酸苦味酸即2，4，6-三硝基酚，鎢酸和碘化鉀等。某些酸類指的是三氯醋酸，磺基水楊酸和硝酸等。當(dāng)溶液pH小于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷，容易與生物堿試劑和酸類的酸根負(fù)離子發(fā)生反應(yīng)生成不溶性鹽而沉淀。這類沉淀反應(yīng)經(jīng)常被臨床檢驗(yàn)部門用來(lái)除去體液中干擾測(cè)定的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁(yè)!四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則

1.前處理

2.粗分級(jí)分離

3.細(xì)分級(jí)分離

動(dòng)物材料應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織；種子材料應(yīng)先去殼甚至去種皮以免受單寧等物質(zhì)的污染，油料種子最好先用低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑如乙醚等脫脂。然后根據(jù)不同的情況，選擇適當(dāng)?shù)姆椒?，將組織和細(xì)胞破碎。動(dòng)物組織和細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎。

蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁(yè)!2.粗分級(jí)分離當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)提取液（有時(shí)還雜有核酸、多糖之類）獲得后，選用一套適當(dāng)?shù)姆椒?，將所要的蛋白質(zhì)與其他雜蛋白分離開來(lái)。一般這一步的分級(jí)分離用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法。這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大．既能除去大量雜質(zhì)（包括脫鹽），又能濃縮蛋白質(zhì)溶液。有些蛋白質(zhì)提取液體積較大，又不適于用沉淀或鹽析法濃縮，則可采用超過(guò)濾、凝膠過(guò)濾、冷凍真空干燥或其他方法（如聚乙二醇濃縮法）進(jìn)行濃縮。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁(yè)!五、蛋白質(zhì)的分離純化方法

（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法

（二）利用溶解度差別的純化方法

（三）根據(jù)電荷不同的純化方法

（四）利用選擇性吸附的純化方法

（五）利用配體的特異性親和力的純化方法蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁(yè)!1.透析和超濾半透膜袋蛋白質(zhì)溶液透析液磁棒磁力攪拌器

透析是利用蛋白質(zhì)等大分子不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)如無(wú)機(jī)鹽單糖等分開。常用的半透膜：

玻璃紙（賽璐玢紙，cellophanepaper）

火綿紙（賽璐玎紙,celloidinpaper）

其他改型纖維素材料蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁(yè)!2.密度梯度離心法（densitygradient）

生物大分子及顆粒的沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒沉降的快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨(dú)立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底刺一個(gè)小孔逐滴放出，分步收集。常用的介質(zhì)有蔗糖、氯化銫等。滴加樣品離心管蔗糖密度梯度蔗糖濃度蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁(yè)!分子篩層析原理示意圖蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁(yè)!蛋白質(zhì)Mr=49,000洗出液中的蛋白質(zhì)濃度洗脫體積（mL）未知logMr洗脫體積與相對(duì)分子質(zhì)量的關(guān)系

Andrews的經(jīng)驗(yàn)公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白Mr“選擇性曲線”G-200G-100logMrKav蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁(yè)!1.等電沉淀和PH控制蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒(méi)有靜電斥力而趨于聚集沉淀。因此在其他條件相同時(shí)，它的溶解度達(dá)到最低點(diǎn)。在等電點(diǎn)以上或以下的pH時(shí)，蛋白質(zhì)分子攜帶同種符號(hào)的凈電荷而相互排斥，阻止了單個(gè)分子聚集成沉淀，因此溶解度較大。在其等電點(diǎn)(pH5.2-5.3)時(shí)達(dá)到最低值，在等電點(diǎn)兩側(cè)的pH下，其溶解度迅速上升；不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的原理，可以把蛋白質(zhì)混合物分開。當(dāng)pH被調(diào)至蛋白質(zhì)混合物中某種成分的等電點(diǎn)pH時(shí)，這種蛋白質(zhì)的大部分或全部將沉淀下來(lái)，那些等電點(diǎn)高于或低于該pH的蛋白質(zhì)則仍留在溶液中這樣沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)保持著天然構(gòu)象，能重新溶解于適當(dāng)?shù)膒H和一定濃度的鹽溶液中。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁(yè)!3.有機(jī)溶劑分級(jí)分離（1）有機(jī)溶劑可以使蛋白質(zhì)沉淀主要有乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。（2）有機(jī)溶劑可以破壞水化膜、造成一個(gè)低介電區(qū)。（3）有分級(jí)分離現(xiàn)象（4）要求對(duì)有機(jī)溶劑低溫預(yù)冷。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁(yè)!（三）根據(jù)電荷不同的純化方法

1.電泳

2.聚丙烯酰胺凝膠電泳

3.毛細(xì)管電泳

4.等電聚焦

5.層析聚焦

6.離子交換層析蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁(yè)!電泳技術(shù)分類垂直板電泳毛細(xì)管電泳水平板電泳電泳支持物濾紙凝膠薄膜圓盤電泳蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁(yè)!PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺(N，N-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化劑的作用下聚合而成，聚合反應(yīng)的催化系統(tǒng)有兩種。化學(xué)聚合:催化劑過(guò)硫酸銨(AP)，加速劑TEMED光聚合:催化劑核黃素，加速劑TEMED不連續(xù)PAGE三種效應(yīng)：電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁(yè)!高效毛細(xì)管電泳儀

highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁(yè)!二、儀器流程與主要部件

processandmainassembly

電壓：0～30kV；分離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器；（可檢測(cè)到：10-19～10-21mol/L）蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁(yè)!

毛細(xì)管結(jié)構(gòu)

毛細(xì)管是CE分離的心臟。理想的毛細(xì)管必須是電絕緣、紫外/可見(jiàn)光透明且富有彈性的，目前可以使用的有玻璃、熔融石英或聚四氟乙烯塑料等。毛細(xì)管內(nèi)徑一般為10～100μm，其截面結(jié)構(gòu)圖標(biāo)意圖如左圖所示。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁(yè)!3.緩沖液池

化學(xué)惰性，機(jī)械穩(wěn)定性好；4.檢測(cè)器

要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測(cè)；檢測(cè)器、數(shù)據(jù)采集與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理一體化；

類型檢測(cè)限/mol特點(diǎn)紫外-可見(jiàn)10-13～10-15加二極管陣列，光譜信息熒光10-15～10-17靈敏度高，樣品需衍生激光誘導(dǎo)熒光10-18～10-20靈敏度極高，樣品需衍生電導(dǎo)10-18～10-19離子靈敏，需專用的裝置；蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁(yè)!5.聚焦層析（Chromatofocusing）該法是在等電點(diǎn)聚焦方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，其分離純化蛋白質(zhì)的依據(jù)是等電點(diǎn)的差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過(guò)程叫做聚焦效應(yīng)。pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應(yīng)的先決條件，如果一種蛋白質(zhì)加到已形成pH梯度的層析柱上時(shí),由于洗脫液的連續(xù)流動(dòng)，蛋白質(zhì)將迅速地遷移到與它等電點(diǎn)相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電點(diǎn)pH時(shí)被洗出。在聚焦層析過(guò)程中,一種樣品分次加入時(shí)，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的時(shí)間進(jìn)行聚焦,剩余樣品還可以加到柱上,其聚焦過(guò)程都能順利完成。pH梯度溶液的形成示意圖蛋白質(zhì)1（pI=7）蛋白質(zhì)2（pI=8）流速移動(dòng)速率層析時(shí)的聚焦效應(yīng)示意圖蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁(yè)!離子交換層析原理示意圖

蛋白質(zhì)濃度洗脫體積帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)收集樣品的管收集樣品的管帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)混合物玻璃柱帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)收集樣品的管NaClNaCl梯度蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁(yè)!常用的陽(yáng)離子交換劑

離子交換劑可電離基團(tuán)可電離基團(tuán)結(jié)構(gòu)CM-纖維素（弱酸型）羧甲基P-纖維素（中強(qiáng)弱酸型）磷酸基SE-纖維素（強(qiáng)弱酸型）磺乙基SP-纖維素（強(qiáng)弱酸型）磺丙基蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁(yè)!（四）利用選擇性吸附的純化方法

1.羥磷灰石層析

2.疏水作用層析

某些稱為吸附劑的固體物質(zhì)具有吸附能力，能夠?qū)⑵渌N類的分子吸附在自己的表面，吸附力的強(qiáng)弱因被吸物質(zhì)的性質(zhì)而異。吸附過(guò)程涉及范德華相互作用和氫鍵這些非離子吸引力。吸附層析就是利用待純化的分子和雜質(zhì)分子與吸附劑之間的吸附能力和解吸性質(zhì)不同而達(dá)到分離目的的。典型的吸附劑有硅膠、氧化鋁和活性炭等。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁(yè)!2.疏水作用層析疏水作用層析就是根據(jù)蛋白質(zhì)表面的疏水性差別發(fā)展起來(lái)的一種純化技術(shù)。在疏水作用層析中，不是暴露的疏水基團(tuán)促進(jìn)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，而是連接在支持介質(zhì)（如瓊脂糖）上的疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)表面上暴露的疏水基團(tuán)結(jié)合。市售的疏水吸附劑有苯基瓊脂糖、辛基瓊脂糖等。為使吸附達(dá)到最大，可將蛋白質(zhì)樣品的pH調(diào)至等電點(diǎn)附近。一旦蛋白質(zhì)吸附于固定相，則可利用多種方式進(jìn)行選擇洗脫，包括使用逐漸降低離子強(qiáng)度或增加pH的洗脫液（增加蛋白質(zhì)的親水性），或使用對(duì)固定相的親和力比對(duì)蛋白質(zhì)更強(qiáng)的置換劑進(jìn)行置換洗脫。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁(yè)!親和層析（affiuitychromatography）

應(yīng)用分離純化酶、抗原、抗體分離純化核酸研究酶的結(jié)構(gòu)與功能+待純化分子配體a.理論依據(jù)：待純化分子和配體間具有親和性+基質(zhì)b.活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑++雜質(zhì)c.待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離+d.偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后，得到純的待純化分子原理：基質(zhì)纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、sepharose、sephadex蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁(yè)!六、蛋白質(zhì)的含量測(cè)定與純度鑒定1.蛋白質(zhì)的含量測(cè)定的方法凱氏定氮法雙縮脈法Folin一酚試劑法（Lowry法）紫外吸收法染料結(jié)合法（Bradford法）膠體金測(cè)定法

蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁(yè)!二、蛋白質(zhì)分子的大小和空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子量很大，相對(duì)分子量變化范圍在6000-1000000或更大一些。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法：1.根據(jù)蛋白質(zhì)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子量2.滲透壓法測(cè)定相對(duì)分子量3.蛋白質(zhì)的擴(kuò)散和擴(kuò)散系數(shù)4.沉降分析法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量5.凝膠過(guò)濾法測(cè)定相對(duì)分子量6.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定相對(duì)分子量蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁(yè)!蛋白質(zhì)有四級(jí)結(jié)構(gòu)肽鏈中各種氨基酸相互聯(lián)接的順序是蛋白質(zhì)的初級(jí)結(jié)構(gòu)，也叫一級(jí)結(jié)構(gòu)。

多肽鏈主鏈骨架中的若干肽段，通過(guò)氫鍵，形成有規(guī)則的構(gòu)象，這稱為二級(jí)結(jié)構(gòu)。 α-螺旋 β-折疊無(wú)規(guī)線團(tuán)

在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多肽鏈間通過(guò)氨基酸殘基側(cè)鏈的相互作用而進(jìn)行盤旋和折疊，因而產(chǎn)生的特定的三維空間結(jié)構(gòu)，這稱為三級(jí)結(jié)構(gòu)，也稱為蛋白質(zhì)的亞基。

各個(gè)亞基在低聚蛋白中的空間排布及相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的生理活性是由二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)決定的。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁(yè)!蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁(yè)!（1）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)的分子大小屬于膠體質(zhì)點(diǎn)的范圍。蛋白質(zhì)溶液是一種親水膠體，蛋白質(zhì)分子表面的親水基團(tuán)，如一NH2，-COOH,-OH以及–CO-NH-等，在水溶液中能與水分子起水化作用，使蛋白質(zhì)分子表面形成一個(gè)水化層，每克蛋白質(zhì)分子能結(jié)合0.3～0.5克水。蛋白質(zhì)分子表面上的可解離基團(tuán)，在適當(dāng)?shù)膒H條下．都帶有相同的凈電荷，與其周圍的反離子構(gòu)成穩(wěn)定的雙電層。蛋白質(zhì)溶液由于具有水化層——雙電層兩方面的穩(wěn)定因素，所以作為膠體系統(tǒng)是相當(dāng)穩(wěn)定的，如無(wú)外界因素的影響，就不致互相凝集而沉淀。蛋白質(zhì)溶液也和一般的膠體系統(tǒng)一樣具有丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運(yùn)動(dòng)以及不能通過(guò)半透膜。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁(yè)!鹽析法鹽析法向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽（硫酸胺、硫酸鈉或氯化鈉等），使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。鹽析沉淀一般不引起蛋白質(zhì)變性。當(dāng)除去鹽后，復(fù)可溶解。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁(yè)!重金屬鹽沉淀法當(dāng)溶液pH大于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，這樣它就容易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。誤服重金屬鹽的病人可口服大量牛乳或豆?jié){等蛋白質(zhì)進(jìn)行解救就是因?yàn)樗芎椭亟饘匐x子形成不溶性鹽，然后再服用催吐劑排出體外。重金屬鹽常能使蛋白質(zhì)變性，這可能是因?yàn)橹亟饘冫}水解生成酸或堿的緣故。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁(yè)!加熱變性沉淀法幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。少量鹽類促進(jìn)蛋白質(zhì)加熱凝固。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，加熱凝固最完全和最迅速。加熱變性引起蛋白質(zhì)凝固沉淀的原因可能是由于熱變性是蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，因而破壞了水化層，同時(shí)由于蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)也破壞了帶電狀態(tài)。我國(guó)很早就創(chuàng)造了將大豆蛋白質(zhì)的濃溶液加熱并點(diǎn)入少量鹽鹵（含MgCl2)的制豆腐的方法，這是成功的應(yīng)用加熱變性沉淀蛋白質(zhì)的一個(gè)例子。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁(yè)!1.前處理

植物組織和細(xì)胞，由于具有由纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁，一般需要用與石英砂或玻璃粉和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處理也能達(dá)到目的。細(xì)菌整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞壁的骨架實(shí)際上是一個(gè)借共價(jià)鍵連接而成的肽肽聚糖囊狀大分子，非常堅(jiān)韌。破碎細(xì)菌細(xì)胞壁的常用方法有超聲波震蕩，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）等。組織和細(xì)胞破碎以后，選擇適當(dāng)?shù)木彌_液把所要的蛋白質(zhì)提取出來(lái)。細(xì)胞碎片等不溶物用離心或過(guò)濾等方法除去。如果所要的蛋白質(zhì)主要集中在某一細(xì)胞組分，如細(xì)胞核、染色體、核糖體或可溶性的細(xì)胞質(zhì)等，則可利用差速離心方法將它們分開，收集該細(xì)胞組分作為下步純化的材料。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁(yè)!3.細(xì)分級(jí)分離

結(jié)晶是蛋白質(zhì)分離純化的最后步驟。盡管結(jié)晶并不能保證蛋白質(zhì)一定是均一的，但只有某種蛋白質(zhì)在溶液中數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)時(shí)才能形成結(jié)晶。結(jié)晶過(guò)程本身也伴隨著一定程度的純化，而重結(jié)晶又可除去少量夾雜的蛋白質(zhì)。由于結(jié)晶中從未發(fā)現(xiàn)過(guò)變性蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的結(jié)晶不僅是純度的一個(gè)標(biāo)志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標(biāo)。

一般使用層析法包括凝膠過(guò)濾，離子交換層析，吸附層析以及親和層析等。必要時(shí)還可選擇電泳法，包括區(qū)帶電泳、等電聚焦等作為最后的純化步驟。用于細(xì)分級(jí)分離的方法一般規(guī)模較小，但分辨率很高。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁(yè)!（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法

1.透析和超濾

2.密度梯度離心

3.凝膠過(guò)濾蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁(yè)!超過(guò)濾（ultrafiltration）

利用壓力、抽濾（A）或離心力（B）等多種形式，強(qiáng)行使水和其它小分子溶質(zhì)通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽目的。濾膜有多種規(guī)格，可選擇性的截留相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)。為了避免被膜截留的蛋白質(zhì)在膜表面上堆積，現(xiàn)常用截向流過(guò)濾的方法，即液體在泵驅(qū)動(dòng)下沿著與膜表面相切方向流動(dòng)，在膜上形成壓力，使部分液體透過(guò)膜，而另一部分液體切向地流過(guò)表面將被膜截留的蛋白質(zhì)分子沖走。濾膜抽氣濾膜離心AB蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁(yè)!3.凝膠過(guò)濾

原理：凝膠層析也稱為排阻凝膠層析、凝膠過(guò)濾和分子篩層析。它是60年代發(fā)展起來(lái)的，利用凝膠把物質(zhì)按分子大小不同進(jìn)行分離的一種方法。由于被分離物質(zhì)的分子大小（直徑）和形狀不同，洗脫時(shí)，大分子物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨溶劑向下移動(dòng)，因此流程短，首先流出層析柱，而小分子物質(zhì)，由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，能自由進(jìn)出膠粒網(wǎng)孔，使之洗脫時(shí)流程增長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢而后流出層析柱。應(yīng)用測(cè)定分子量蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁(yè)!分子篩層析與洗脫曲線

凝膠顆粒收集蛋白質(zhì)管蛋白質(zhì)混合物大分子從柱上面加緩沖溶液小分子洗脫體積（Ve）凝膠柱大分子小分子Ve1Ve2V0蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁(yè)!（二）利用溶解度差別的

純化方法

1.等電沉淀和PH控制

2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析

3.有機(jī)溶劑分級(jí)分離

4.溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁(yè)!2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析低濃度的中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象稱為鹽溶(saltingin),鹽溶作用主要是由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用卻加強(qiáng)，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析過(guò)程中往往沉淀析出，這就是因?yàn)橥肝龀チ他}類離子，使蛋白質(zhì)分子間的相互吸引增加，引起蛋白質(zhì)分子的凝集并沉淀。表明中性鹽對(duì)球狀蛋白質(zhì)的溶解度有顯著的影響。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第47頁(yè)!4.溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響在一定溫度范圍內(nèi)，約0-40℃之間，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加，但也有例外，例如人的血紅蛋白從0到25℃，溶解度隨溫度上升而降低。在40-50℃以上開始變性，一般在中性pH介質(zhì)中即失去溶解力。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級(jí)分離操作一般都在0℃或更低的溫度下進(jìn)行。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第48頁(yè)!1.電泳電泳分離蛋白質(zhì)是根據(jù)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的遷移的差別達(dá)到分離目的的。蛋白質(zhì)樣品加到一塊預(yù)先制好的凝膠介質(zhì)上，只要在凝膠的兩端加上電場(chǎng)，就可以達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的，這樣的電泳稱之凝膠電泳（gelelectrophoresis）。凝膠可以是淀粉凝膠（starchgel）、瓊脂糖凝膠（agarosegel）和聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel）。一般凝膠介質(zhì)中的pH被維持在堿性區(qū)，目的是使大多數(shù)蛋白質(zhì)都帶有負(fù)電荷，這樣它們可以向陽(yáng)極遷移。蛋白質(zhì)的遷移與蛋白質(zhì)的質(zhì)量和帶電荷的多少有關(guān)。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第49頁(yè)!2.聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,簡(jiǎn)稱PAGE)，也稱圓盤凝膠電泳或圓盤電泳(discgelelectrophoresis)，它是在區(qū)帶電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。它以聚丙烯Ift胺凝膠為支持物，一般制成凝膠柱或凝膠板，凝膠是由相連的二部分組成（小的部分是濃縮膠，大的部分是分離膠），這二部分凝膠的濃度（孔徑大?。⒕彌_液組分和離子強(qiáng)度,pH以及電場(chǎng)強(qiáng)度都是不同的，即不連續(xù)的。這樣,電泳時(shí)樣品首先在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮而成很薄的起始區(qū)帶（厚度約為0.1mm），然后再進(jìn)行電泳分離。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第50頁(yè)!3.毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳又稱毛細(xì)管區(qū)帶電泳，它是在毛細(xì)管（2-75μm）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細(xì)管兩端加高壓直流電實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分離，分離后的樣品依次通過(guò)設(shè)在毛細(xì)管一端的檢測(cè)器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴(kuò)散和樣品擴(kuò)散的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了快速和高效分離。毛細(xì)管電泳是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，被認(rèn)為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測(cè)定及PCR產(chǎn)物的分析鑒定等。蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第51頁(yè)!儀器蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第52頁(yè)!1.高壓電源（1）0～30kV穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場(chǎng)強(qiáng)度程序控制系統(tǒng)；（4）電壓穩(wěn)定性：0.1%；（5）電源極性易轉(zhuǎn)換；2.毛細(xì)管柱

（1）材料：石英：各項(xiàng)性能好；玻璃：光學(xué)、機(jī)械性能差；（2）規(guī)格：內(nèi)徑20～75μm，外徑350～400μm；長(zhǎng)度<=1m蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第53頁(yè)!紫外吸收

蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第54頁(yè)!4.等電聚焦（isoelectricfocusing）原理:

在一定抗對(duì)流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當(dāng)直流電通過(guò)時(shí)，便形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過(guò)程中，就被濃集在與其pI相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點(diǎn)得到分離。應(yīng)用：

高效率分離純化蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì)分子量pH10pH3pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-+線性梯度蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第55頁(yè)!6.離子交換層析

（ion-changechromatography）

原理基質(zhì)疏水型離子交換劑；親水型離子交換劑應(yīng)用制備純化生物物質(zhì)定量、定性測(cè)定混合物中各組分1.平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合2.吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換3、4.解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，既可重復(fù)使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第56頁(yè)!梯度混合器凝膠顆粒蛋白質(zhì)混合物大分子小分子儲(chǔ)液瓶混合瓶層析柱磁力攪拌器洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度簡(jiǎn)單型梯度混合器梯度洗脫曲線洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度儲(chǔ)液瓶混合瓶復(fù)合型梯度混合器梯度洗脫曲線凸形線形凹形蛋白質(zhì)的分離純化和表征共62頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第57頁(yè)!常用