蛋白質的分離純化和表征

蛋白質的

分離純化和表征◆

一、蛋白質的酸堿性質◆

二、蛋白質分子的大小和空間結構◆

三、蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀◆

四、蛋白質分離純化的一般原則◆

五、蛋白質的分離純化方法◆

六、蛋白質的含量測定與純度鑒定蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第1頁!一、蛋白質的酸堿性質蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第2頁!蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第3頁!蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第4頁!蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第5頁!三、蛋白質的膠體性質與

蛋白質的沉淀

（1）蛋白質的膠體性質

（2）蛋白質的沉淀

分散相質點在膠體系統(tǒng)中保持穩(wěn)定，需要具備3個條件：，分散相的質點大小在1～100nm范圍內，這樣大小的質點在動力學上是穩(wěn)定的，介質分子對這種質點碰撞的合力不等于零，使它能在介質中作不斷的布朗運動(Brownmovement)；第二，分散相的質點帶有同種凈電荷，互相排斥，不易聚集成大顆而沉淀；第三，分散相的質點能與溶劑形成溶劑化層，例如與水形成水化層(hydrationmantle)，質點有了水化層，相互間不易靠攏而聚集。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第6頁!（2）蛋白質的沉淀

蛋白質在溶液中的穩(wěn)定性是有條件的、相對的。如果條件發(fā)生改變，破壞了蛋白質溶液的穩(wěn)定性，蛋白質就會從溶液中沉淀出來。蛋白質溶液的穩(wěn)定性既然與質點大小、電荷和水化作用有關，那么很自然，任何影響這些條件的因素都會影響蛋白質溶液的穩(wěn)定性。

鹽析法

有機溶劑沉淀法

重金屬鹽沉淀法

生物堿試劑和某些酸類沉淀法

加熱變性沉淀法

蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第7頁!有機溶劑沉淀法向蛋白質溶液中加入一定量的極性有機溶劑（甲醇、乙醇或丙酮等），因引起蛋白質脫去水化層以及降低介電常數而增加帶電質點間的相互作用，致使蛋白質顆粒容易凝集而沉淀。有機溶劑沉淀法，如果控制在低溫下操作并且盡量縮短處理的時間則可使變性速度減慢。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第8頁!生物堿試劑和某些酸類沉淀法生物堿試劑是指能引起生物堿沉淀的一類試劑，如驟酸也稱單寧酸苦味酸即2，4，6-三硝基酚，鎢酸和碘化鉀等。某些酸類指的是三氯醋酸，磺基水楊酸和硝酸等。當溶液pH小于等電點時，蛋白質顆粒帶正電荷，容易與生物堿試劑和酸類的酸根負離子發(fā)生反應生成不溶性鹽而沉淀。這類沉淀反應經常被臨床檢驗部門用來除去體液中干擾測定的蛋白質。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第9頁!四、蛋白質分離純化的一般原則

1.前處理

2.粗分級分離

3.細分級分離

動物材料應先剔除結締組織和脂肪組織；種子材料應先去殼甚至去種皮以免受單寧等物質的污染，油料種子最好先用低沸點的有機溶劑如乙醚等脫脂。然后根據不同的情況，選擇適當的方法，將組織和細胞破碎。動物組織和細胞可用電動搗碎機或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎。

蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第10頁!2.粗分級分離當蛋白質提取液（有時還雜有核酸、多糖之類）獲得后，選用一套適當的方法，將所要的蛋白質與其他雜蛋白分離開來。一般這一步的分級分離用鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法。這些方法的特點是簡便、處理量大．既能除去大量雜質（包括脫鹽），又能濃縮蛋白質溶液。有些蛋白質提取液體積較大，又不適于用沉淀或鹽析法濃縮，則可采用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥或其他方法（如聚乙二醇濃縮法）進行濃縮。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第11頁!五、蛋白質的分離純化方法

（一）根據分子大小不同的純化方法

（二）利用溶解度差別的純化方法

（三）根據電荷不同的純化方法

（四）利用選擇性吸附的純化方法

（五）利用配體的特異性親和力的純化方法蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第12頁!1.透析和超濾半透膜袋蛋白質溶液透析液磁棒磁力攪拌器

透析是利用蛋白質等大分子不能通過半透膜的性質，使蛋白質和其它小分子物質如無機鹽單糖等分開。常用的半透膜：

玻璃紙（賽璐玢紙，cellophanepaper）

火綿紙（賽璐玎紙,celloidinpaper）

其他改型纖維素材料蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第13頁!2.密度梯度離心法（densitygradient）

生物大分子及顆粒的沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。顆粒在具有密度梯度的介質中離心時，質量和密度大的顆粒沉降的快，并且每種蛋白質顆粒沉降到與自身密度相等的介質密度梯度時，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底刺一個小孔逐滴放出，分步收集。常用的介質有蔗糖、氯化銫等。滴加樣品離心管蔗糖密度梯度蔗糖濃度蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第14頁!分子篩層析原理示意圖蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第15頁!蛋白質Mr=49,000洗出液中的蛋白質濃度洗脫體積（mL）未知logMr洗脫體積與相對分子質量的關系

Andrews的經驗公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白Mr“選擇性曲線”G-200G-100logMrKav蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第16頁!1.等電沉淀和PH控制蛋白質處于等電點時，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀。因此在其他條件相同時，它的溶解度達到最低點。在等電點以上或以下的pH時，蛋白質分子攜帶同種符號的凈電荷而相互排斥，阻止了單個分子聚集成沉淀，因此溶解度較大。在其等電點(pH5.2-5.3)時達到最低值，在等電點兩側的pH下，其溶解度迅速上升；不同的蛋白質具有不同的等電點，利用蛋白質在等電點時溶解度最低的原理，可以把蛋白質混合物分開。當pH被調至蛋白質混合物中某種成分的等電點pH時，這種蛋白質的大部分或全部將沉淀下來，那些等電點高于或低于該pH的蛋白質則仍留在溶液中這樣沉淀出來的蛋白質保持著天然構象，能重新溶解于適當的pH和一定濃度的鹽溶液中。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第17頁!3.有機溶劑分級分離（1）有機溶劑可以使蛋白質沉淀主要有乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。（2）有機溶劑可以破壞水化膜、造成一個低介電區(qū)。（3）有分級分離現象（4）要求對有機溶劑低溫預冷。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第18頁!（三）根據電荷不同的純化方法

1.電泳

2.聚丙烯酰胺凝膠電泳

3.毛細管電泳

4.等電聚焦

5.層析聚焦

6.離子交換層析蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第19頁!電泳技術分類垂直板電泳毛細管電泳水平板電泳電泳支持物濾紙凝膠薄膜圓盤電泳蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第20頁!PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交聯劑亞甲基雙丙烯酰胺(N，N-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化劑的作用下聚合而成，聚合反應的催化系統(tǒng)有兩種。化學聚合:催化劑過硫酸銨(AP)，加速劑TEMED光聚合:催化劑核黃素，加速劑TEMED不連續(xù)PAGE三種效應：電荷效應、分子篩效應和濃縮效應蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第21頁!高效毛細管電泳儀

highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第22頁!二、儀器流程與主要部件

processandmainassembly

電壓：0～30kV；分離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導熒光檢測器；（可檢測到：10-19～10-21mol/L）蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第23頁!

毛細管結構

毛細管是CE分離的心臟。理想的毛細管必須是電絕緣、紫外/可見光透明且富有彈性的，目前可以使用的有玻璃、熔融石英或聚四氟乙烯塑料等。毛細管內徑一般為10～100μm，其截面結構圖標意圖如左圖所示。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第24頁!3.緩沖液池

化學惰性，機械穩(wěn)定性好；4.檢測器

要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測；檢測器、數據采集與計算機數據處理一體化；

類型檢測限/mol特點紫外-可見10-13～10-15加二極管陣列，光譜信息熒光10-15～10-17靈敏度高，樣品需衍生激光誘導熒光10-18～10-20靈敏度極高，樣品需衍生電導10-18～10-19離子靈敏，需專用的裝置；蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第25頁!5.聚焦層析（Chromatofocusing）該法是在等電點聚焦方法基礎上發(fā)展起來的，其分離純化蛋白質的依據是等電點的差異和離子交換行為。蛋白質按其等電點在pH梯度環(huán)境中進行排列的過程叫做聚焦效應。pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應的先決條件，如果一種蛋白質加到已形成pH梯度的層析柱上時,由于洗脫液的連續(xù)流動，蛋白質將迅速地遷移到與它等電點相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質將以緩慢的速度進行吸附、解吸附，直到在等電點pH時被洗出。在聚焦層析過程中,一種樣品分次加入時，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的時間進行聚焦,剩余樣品還可以加到柱上,其聚焦過程都能順利完成。pH梯度溶液的形成示意圖蛋白質1（pI=7）蛋白質2（pI=8）流速移動速率層析時的聚焦效應示意圖蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第26頁!離子交換層析原理示意圖

蛋白質濃度洗脫體積帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質收集樣品的管收集樣品的管帶負電荷的蛋白質蛋白質混合物玻璃柱帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質帶正電荷的蛋白質收集樣品的管NaClNaCl梯度蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第27頁!常用的陽離子交換劑

離子交換劑可電離基團可電離基團結構CM-纖維素（弱酸型）羧甲基P-纖維素（中強弱酸型）磷酸基SE-纖維素（強弱酸型）磺乙基SP-纖維素（強弱酸型）磺丙基蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第28頁!（四）利用選擇性吸附的純化方法

1.羥磷灰石層析

2.疏水作用層析

某些稱為吸附劑的固體物質具有吸附能力，能夠將其他種類的分子吸附在自己的表面，吸附力的強弱因被吸物質的性質而異。吸附過程涉及范德華相互作用和氫鍵這些非離子吸引力。吸附層析就是利用待純化的分子和雜質分子與吸附劑之間的吸附能力和解吸性質不同而達到分離目的的。典型的吸附劑有硅膠、氧化鋁和活性炭等。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第29頁!2.疏水作用層析疏水作用層析就是根據蛋白質表面的疏水性差別發(fā)展起來的一種純化技術。在疏水作用層析中，不是暴露的疏水基團促進蛋白質與蛋白質之間的相互作用，而是連接在支持介質（如瓊脂糖）上的疏水基團與蛋白質表面上暴露的疏水基團結合。市售的疏水吸附劑有苯基瓊脂糖、辛基瓊脂糖等。為使吸附達到最大，可將蛋白質樣品的pH調至等電點附近。一旦蛋白質吸附于固定相，則可利用多種方式進行選擇洗脫，包括使用逐漸降低離子強度或增加pH的洗脫液（增加蛋白質的親水性），或使用對固定相的親和力比對蛋白質更強的置換劑進行置換洗脫。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第30頁!親和層析（affiuitychromatography）

應用分離純化酶、抗原、抗體分離純化核酸研究酶的結構與功能+待純化分子配體a.理論依據：待純化分子和配體間具有親和性+基質b.活性基質與配體結合產生親和吸附劑++雜質c.待純化分子與親和吸附劑結合，與雜質分離+d.偶聯復合物經解離后，得到純的待純化分子原理：基質纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、sepharose、sephadex蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第31頁!六、蛋白質的含量測定與純度鑒定1.蛋白質的含量測定的方法凱氏定氮法雙縮脈法Folin一酚試劑法（Lowry法）紫外吸收法染料結合法（Bradford法）膠體金測定法

蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第32頁!二、蛋白質分子的大小和空間結構蛋白質分子量很大，相對分子量變化范圍在6000-1000000或更大一些。測定蛋白質分子量的方法：1.根據蛋白質化學組成測定最低相對分子量2.滲透壓法測定相對分子量3.蛋白質的擴散和擴散系數4.沉降分析法測定蛋白質相對分子量5.凝膠過濾法測定相對分子量6.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子量蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第33頁!蛋白質有四級結構肽鏈中各種氨基酸相互聯接的順序是蛋白質的初級結構，也叫一級結構。

多肽鏈主鏈骨架中的若干肽段，通過氫鍵，形成有規(guī)則的構象，這稱為二級結構。 α-螺旋 β-折疊無規(guī)線團

在二級結構的基礎上，多肽鏈間通過氨基酸殘基側鏈的相互作用而進行盤旋和折疊，因而產生的特定的三維空間結構，這稱為三級結構，也稱為蛋白質的亞基。

各個亞基在低聚蛋白中的空間排布及相互作用，稱為蛋白質的四級結構。蛋白質的生理活性是由二級、三級、四級結構來決定的。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第34頁!蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第35頁!（1）蛋白質的膠體性質

蛋白質的分子大小屬于膠體質點的范圍。蛋白質溶液是一種親水膠體，蛋白質分子表面的親水基團，如一NH2，-COOH,-OH以及–CO-NH-等，在水溶液中能與水分子起水化作用，使蛋白質分子表面形成一個水化層，每克蛋白質分子能結合0.3～0.5克水。蛋白質分子表面上的可解離基團，在適當的pH條下．都帶有相同的凈電荷，與其周圍的反離子構成穩(wěn)定的雙電層。蛋白質溶液由于具有水化層——雙電層兩方面的穩(wěn)定因素，所以作為膠體系統(tǒng)是相當穩(wěn)定的，如無外界因素的影響，就不致互相凝集而沉淀。蛋白質溶液也和一般的膠體系統(tǒng)一樣具有丁達爾效應、布朗運動以及不能通過半透膜。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第36頁!鹽析法鹽析法向蛋白質溶液中加入大量的中性鹽（硫酸胺、硫酸鈉或氯化鈉等），使蛋白質脫去水化層而聚集沉淀。鹽析沉淀一般不引起蛋白質變性。當除去鹽后，復可溶解。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第37頁!重金屬鹽沉淀法當溶液pH大于等電點時，蛋白質顆粒帶負電荷，這樣它就容易與重金屬離子結合成不溶性鹽而沉淀。誤服重金屬鹽的病人可口服大量牛乳或豆?jié){等蛋白質進行解救就是因為它能和重金屬離子形成不溶性鹽，然后再服用催吐劑排出體外。重金屬鹽常能使蛋白質變性，這可能是因為重金屬鹽水解生成酸或堿的緣故。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第38頁!加熱變性沉淀法幾乎所有的蛋白質都因加熱變性而凝固。少量鹽類促進蛋白質加熱凝固。當蛋白質處于等電點時，加熱凝固最完全和最迅速。加熱變性引起蛋白質凝固沉淀的原因可能是由于熱變性是蛋白質天然結構解體，疏水基外露，因而破壞了水化層，同時由于蛋白質處于等電點也破壞了帶電狀態(tài)。我國很早就創(chuàng)造了將大豆蛋白質的濃溶液加熱并點入少量鹽鹵（含MgCl2)的制豆腐的方法，這是成功的應用加熱變性沉淀蛋白質的一個例子。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第39頁!1.前處理

植物組織和細胞，由于具有由纖維素、半纖維素和果膠等物質組成的細胞壁，一般需要用與石英砂或玻璃粉和適當的提取液一起研磨的方法破碎或用纖維素酶處理也能達到目的。細菌整個細菌細胞壁的骨架實際上是一個借共價鍵連接而成的肽肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。破碎細菌細胞壁的常用方法有超聲波震蕩，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）等。組織和細胞破碎以后，選擇適當的緩沖液把所要的蛋白質提取出來。細胞碎片等不溶物用離心或過濾等方法除去。如果所要的蛋白質主要集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖體或可溶性的細胞質等，則可利用差速離心方法將它們分開，收集該細胞組分作為下步純化的材料。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第40頁!3.細分級分離

結晶是蛋白質分離純化的最后步驟。盡管結晶并不能保證蛋白質一定是均一的，但只有某種蛋白質在溶液中數量上占優(yōu)勢時才能形成結晶。結晶過程本身也伴隨著一定程度的純化，而重結晶又可除去少量夾雜的蛋白質。由于結晶中從未發(fā)現過變性蛋白質，因此蛋白質的結晶不僅是純度的一個標志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標。

一般使用層析法包括凝膠過濾，離子交換層析，吸附層析以及親和層析等。必要時還可選擇電泳法，包括區(qū)帶電泳、等電聚焦等作為最后的純化步驟。用于細分級分離的方法一般規(guī)模較小，但分辨率很高。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第41頁!（一）根據分子大小不同的純化方法

1.透析和超濾

2.密度梯度離心

3.凝膠過濾蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第42頁!超過濾（ultrafiltration）

利用壓力、抽濾（A）或離心力（B）等多種形式，強行使水和其它小分子溶質通過半透膜，而蛋白質被截留在膜上，以達到濃縮和脫鹽目的。濾膜有多種規(guī)格，可選擇性的截留相對分子量不同的蛋白質。為了避免被膜截留的蛋白質在膜表面上堆積，現常用截向流過濾的方法，即液體在泵驅動下沿著與膜表面相切方向流動，在膜上形成壓力，使部分液體透過膜，而另一部分液體切向地流過表面將被膜截留的蛋白質分子沖走。濾膜抽氣濾膜離心AB蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第43頁!3.凝膠過濾

原理：凝膠層析也稱為排阻凝膠層析、凝膠過濾和分子篩層析。它是60年代發(fā)展起來的，利用凝膠把物質按分子大小不同進行分離的一種方法。由于被分離物質的分子大?。ㄖ睆剑┖托螤畈煌?，洗脫時，大分子物質由于直徑大于凝膠網孔不能進入凝膠內部，只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨溶劑向下移動，因此流程短，首先流出層析柱，而小分子物質，由于直徑小于凝膠網孔，能自由進出膠粒網孔，使之洗脫時流程增長，移動速度慢而后流出層析柱。應用測定分子量蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第44頁!分子篩層析與洗脫曲線

凝膠顆粒收集蛋白質管蛋白質混合物大分子從柱上面加緩沖溶液小分子洗脫體積（Ve）凝膠柱大分子小分子Ve1Ve2V0蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第45頁!（二）利用溶解度差別的

純化方法

1.等電沉淀和PH控制

2.蛋白質的鹽溶和鹽析

3.有機溶劑分級分離

4.溫度對蛋白質溶解度的影響蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第46頁!2.蛋白質的鹽溶和鹽析低濃度的中性鹽可以增加蛋白質的溶解度，這種現象稱為鹽溶(saltingin),鹽溶作用主要是由于蛋白質分子吸附某種鹽類離子后，帶電層使蛋白質分子彼此排斥，而蛋白質分子與水分子間的相互作用卻加強，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析過程中往往沉淀析出，這就是因為透析除去了鹽類離子，使蛋白質分子間的相互吸引增加，引起蛋白質分子的凝集并沉淀。表明中性鹽對球狀蛋白質的溶解度有顯著的影響。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第47頁!4.溫度對蛋白質溶解度的影響在一定溫度范圍內，約0-40℃之間，大部分球狀蛋白質的溶解度隨溫度升高而增加，但也有例外，例如人的血紅蛋白從0到25℃，溶解度隨溫度上升而降低。在40-50℃以上開始變性，一般在中性pH介質中即失去溶解力。大多數蛋白質在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質的分級分離操作一般都在0℃或更低的溫度下進行。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第48頁!1.電泳電泳分離蛋白質是根據蛋白質在電場中的遷移的差別達到分離目的的。蛋白質樣品加到一塊預先制好的凝膠介質上，只要在凝膠的兩端加上電場，就可以達到分離蛋白質的目的，這樣的電泳稱之凝膠電泳（gelelectrophoresis）。凝膠可以是淀粉凝膠（starchgel）、瓊脂糖凝膠（agarosegel）和聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel）。一般凝膠介質中的pH被維持在堿性區(qū)，目的是使大多數蛋白質都帶有負電荷，這樣它們可以向陽極遷移。蛋白質的遷移與蛋白質的質量和帶電荷的多少有關。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第49頁!2.聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,簡稱PAGE)，也稱圓盤凝膠電泳或圓盤電泳(discgelelectrophoresis)，它是在區(qū)帶電泳的基礎上發(fā)展起來的。它以聚丙烯Ift胺凝膠為支持物，一般制成凝膠柱或凝膠板，凝膠是由相連的二部分組成（小的部分是濃縮膠，大的部分是分離膠），這二部分凝膠的濃度（孔徑大?。?、緩沖液組分和離子強度,pH以及電場強度都是不同的，即不連續(xù)的。這樣,電泳時樣品首先在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮而成很薄的起始區(qū)帶（厚度約為0.1mm），然后再進行電泳分離。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第50頁!3.毛細管電泳

毛細管電泳又稱毛細管區(qū)帶電泳，它是在毛細管（2-75μm）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細管兩端加高壓直流電實現對樣品的分離，分離后的樣品依次通過設在毛細管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴散和樣品擴散的問題，實現了快速和高效分離。毛細管電泳是近年來發(fā)展起來的一項新技術，被認為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測定及PCR產物的分析鑒定等。蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第51頁!儀器蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第52頁!1.高壓電源（1）0～30kV穩(wěn)定、連續(xù)可調的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場強度程序控制系統(tǒng)；（4）電壓穩(wěn)定性：0.1%；（5）電源極性易轉換；2.毛細管柱

（1）材料：石英：各項性能好；玻璃：光學、機械性能差；（2）規(guī)格：內徑20～75μm，外徑350～400μm；長度<=1m蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第53頁!紫外吸收

蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第54頁!4.等電聚焦（isoelectricfocusing）原理:

在一定抗對流介質（如凝膠）中加入兩性電解質載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當直流電通過時，便形成一個由陽極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其pI相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到分離。應用：

高效率分離純化蛋白質測定蛋白質分子量pH10pH3pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-+線性梯度蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第55頁!6.離子交換層析

（ion-changechromatography）

原理基質疏水型離子交換劑；親水型離子交換劑應用制備純化生物物質定量、定性測定混合物中各組分1.平衡階段:離子交換劑與反離子結合2.吸附階段：樣品與反離子進行交換3、4.解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質，后洗下強吸附物質5.再生階段：用原始平衡液進行充分洗滌，既可重復使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第56頁!梯度混合器凝膠顆粒蛋白質混合物大分子小分子儲液瓶混合瓶層析柱磁力攪拌器洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度簡單型梯度混合器梯度洗脫曲線洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度儲液瓶混合瓶復合型梯度混合器梯度洗脫曲線凸形線形凹形蛋白質的分離純化和表征共62頁，您現在瀏覽的是第57頁!常用