結(jié)腸癌腫瘤自身抗體譜篩選及其應(yīng)用

結(jié)腸癌腫瘤自身抗體譜篩選及其應(yīng)用【內(nèi)容摘要】目的本研究擬尋找鑒定結(jié)腸癌本身抗體譜，研究這些本身抗體作為結(jié)腸癌診斷候選血清標(biāo)記物的可能性，同時鑒定這些本身抗體的抗原為研究結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因提供線索。方法用結(jié)腸癌組織建立了庫容量達(dá)5×105pfu的cdna表達(dá)文庫，用結(jié)腸癌患者血清進(jìn)行了文庫血清學(xué)分析〔serex〕，挑選獲得了陽性抗原克隆，進(jìn)一步分析了其中4個克隆與30例結(jié)腸癌和30例正常人血清的反應(yīng)情況。結(jié)果獲得的33個陽性克隆中，31個剪切成功，2個克隆與已經(jīng)知道est序列明顯無同源性，另外29個克隆與已經(jīng)知道基因高度同源。uracildnaglycosylase等4個抗原克隆與結(jié)腸癌患者和正常人血清反應(yīng)陽性率分別為76%〔23%〕、80%〔6%〕、77%〔0〕、73%〔66%〕。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)的29個結(jié)腸癌抗原可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，可能作為結(jié)腸癌的治療潛在分子靶點(diǎn)和結(jié)腸癌診斷新的候選血清學(xué)標(biāo)記物。uracildnaglycosylase等3個克隆與結(jié)腸癌患者血清的反應(yīng)陽性率明顯高于正常人的血清，其相關(guān)本身抗體可作為結(jié)腸癌診斷的血清標(biāo)記物?！颈疚年P(guān)鍵詞語】結(jié)腸癌腫瘤抗原本身抗體cdna表達(dá)文庫血清標(biāo)記物結(jié)腸癌是在歐美國家發(fā)病率位居第二的癌癥，在我們國家結(jié)腸癌的發(fā)病率當(dāng)前排第五位。近年來，其發(fā)病率還在逐年上升。當(dāng)前早期結(jié)腸癌的診斷率仍很低，約1/4的患者在首次確診時已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中50%是肝轉(zhuǎn)移。最新的腫瘤研究以為，病人可對本身腫瘤抗原產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答[1]。正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化經(jīng)過中，突變的基因或各種異常表達(dá)的蛋白能夠成為腫瘤抗原誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)，在腫瘤患者血清中能夠檢測到腫瘤相關(guān)抗原的本身抗體譜[2]。進(jìn)一步的研究發(fā)如今腫瘤患者和正常人的血清中腫瘤本身抗體譜存在顯著差別[3]，提示本身抗體譜有可能作為腫瘤早期診斷的新型血清標(biāo)記物?；谶@個理論，我們構(gòu)建患者結(jié)腸癌組織的cdna表達(dá)文庫，挑選了結(jié)腸癌相關(guān)本身抗體譜，并討論將其作為結(jié)腸癌早診的血清學(xué)標(biāo)記物的可能。1資料和方法1.1資料結(jié)腸癌組織來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院收治的1例男性結(jié)腸癌患者，病理診斷為低分化型腺癌，肝多發(fā)轉(zhuǎn)移，淋逢迎轉(zhuǎn)移6/18，為本院腹部外科手術(shù)切除，手術(shù)同時取該病人血清。其他30例結(jié)腸癌術(shù)前病人血清來自本院檢驗(yàn)科。手術(shù)獲取的癌組織和患者血清及30例健康正常自愿者的血清收集后立即凍于-80℃?zhèn)溆谩?.2方法1.2.1結(jié)腸癌組織mrna的提取取結(jié)腸癌組織500mg，照mrna提取試劑盒mrnapolyattractsystem1000的說明書進(jìn)行。提取mrna溶于無rnase去離子水，測a260/280值，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。取6μgmrna用于cdna文庫的構(gòu)建。1.2.2cdna表達(dá)文庫的構(gòu)建cdna表達(dá)文庫的構(gòu)建使用stratagene公司提供的zapcdnalibraryconstructionkit。第一鏈cdna合成使用thermoscriptrt高溫逆轉(zhuǎn)錄酶〔invitrogen〕，其余參照建庫試劑盒說明書進(jìn)行。文庫4℃保存，挑選之前不擴(kuò)增。1.2.3大腸桿菌/噬菌體裂解液與cnbrsepharose4b柱料的偶聯(lián)取600μl大腸桿菌液參加7×103pfu的λzap空載噬菌體，37℃孵育15min后參加8mlnzy/瓊脂糖頂層膠，混勻后鋪于18cm直徑的含有nzy/agar底層膠的平板上，37℃擴(kuò)增培養(yǎng)過夜。然后于平板中參加10ml偶聯(lián)緩沖液〔0.1mol/lnahco3,ph8.3〕，4℃振蕩洗脫16h。采集洗脫液，超聲破碎未完全裂解的大腸桿菌。經(jīng)紫外分光光度法進(jìn)行蛋白定量。偶聯(lián)的經(jīng)過基本根據(jù)amersham公司提供的說明書進(jìn)行。偶聯(lián)后用含有0.02%疊氮鈉的tbs平衡凝膠介質(zhì)，4℃保存待用。1.2.4血清標(biāo)本的吸收患者血清對文庫進(jìn)行免疫學(xué)挑選之前或用陽性克隆與異體血清反應(yīng)前，必需排除血清中存在的與細(xì)菌和噬菌體反應(yīng)的抗體。采取上述偶聯(lián)的cnbrsepharose4b柱料對血清進(jìn)行預(yù)吸收。去除血清中與大腸桿菌/噬菌體蛋白反應(yīng)的抗體成分。用含有1%bsa的1×tbs1∶10稀釋血清后，根據(jù)1∶1的體積比與偶聯(lián)了大腸桿菌/噬菌體裂解蛋白的柱料混合，4℃輕度振蕩過夜，采集血清。血清反復(fù)吸收3次。采集吸收后的血清，用含有1%bsa的1×tbs以最終1∶50的稀釋度稀釋血清，參加0.02%的疊氮鈉防腐，4℃保存?zhèn)溆谩?.2.5cdna文庫的挑選取600μlxl1bluemrf'菌液參加7×103pfu的重組噬菌體，37℃孵育15min后參加8mlnzy/瓊脂糖頂層膠，混合后鋪于18cm直徑的含有nzy/agar底層膠的平板上，37℃擴(kuò)增培養(yǎng)至噬斑剛剛可見時，轉(zhuǎn)印至經(jīng)10mmiptg浸泡的硝酸纖維素膜上37℃誘導(dǎo)表達(dá)8h。將平板移至4℃，放置2h。硝酸纖維素膜與1∶50稀釋的自體血清室溫反應(yīng)2h，用tbs/t洗滌5次，然后與1∶2500稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人igg〔sigma〕二抗室溫孵育1h。用tbs/t緩沖液洗滌5次，最后1次換用tbs，參加至配制好的nbt/bcip底物液中，暗室內(nèi)顯色。與陽性顯色斑對應(yīng)的噬斑即為cdna文庫第一輪挑選的陽性噬菌體克隆。將第一輪挑選得到的陽性克隆混合后進(jìn)行第二輪挑選，但是同一個平板鋪兩張膜，一張與患者自體的血清反應(yīng)，另一張則直接與羊抗人iggap反應(yīng)，兩張膜同時顯色。那些與自體血清反應(yīng)陽性而直接與羊抗人iggap二抗反應(yīng)陰性的噬斑為文庫第二次挑選的陽性克隆。1.2.6陽性克隆的內(nèi)部剪切按stratagene公司提供的說明書將含有插入序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為單鏈絲狀噬菌體形式存在的pbluescript噬菌粒。噬菌粒感染solr菌后，用于堿裂解法小量提取質(zhì)粒，以ecori和xhoi進(jìn)行雙酶切，初步鑒定插入片段的大小。1.2.7核苷酸序列測定及生物信息學(xué)分析測序由上海博亞公司完成。將測序所得核苷酸序列在各種核苷酸數(shù)據(jù)庫〔ncbigenbackdatabase〕中進(jìn)行分析，重要包含核苷酸序列同源性分析、讀碼框分析等。1.2.8異體血清與抗原克隆反應(yīng)用上述偶聯(lián)的cnbrsepharose4b柱料吸收過的30例結(jié)腸癌病人及30例正常人的血清，在預(yù)先用1%bsa封閉的24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行操作。將選定的陽性克隆噬菌體分別鋪于平板中，保證每平方厘米有3～5個噬斑。待噬斑剛剛可見時，用裁剪為1cm×1cm小片并用10mmiptg浸濕并晾干的硝酸纖維素膜貼在上，保證每片有3～5個噬斑，誘導(dǎo)表達(dá)。揭膜后，pbs洗滌再于24孔培養(yǎng)板頂用1%bsa封閉帶有噬菌斑的硝酸纖維素膜，每一片膜與一例用1%bsa/pbs/t進(jìn)行1∶100稀釋的血清反應(yīng)。之后與cdna文庫挑選操作一樣。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)各個陽性克隆在正常人及結(jié)腸癌病人血清中的抗體陽性率，用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果2.1構(gòu)建庫容為5×105pfu的人結(jié)腸癌cdna表達(dá)文庫共提取mrna10μg,od260∶od280值為2.05,說明其純度較高，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示其為從9.4～0.5kb的彌散，重要集中于1.5～2.0kb左右，表示清楚提取的mrna質(zhì)量較好，沒有明顯的降解。以提取的5μg結(jié)腸癌組織mrna為模板，在合成cdna第一鏈和第二鏈的同時隨機(jī)摻入32p。電泳后放射自顯影顯示，第一鏈為介于9.0～0.5kb的彌散，大部分集中于1.5～2.0kb左右,無明顯的條帶；cdna第二鏈的范圍比第一鏈稍大，為介于10.0～0.5kb的彌散，大部分集中于1.5～2.0kb左右，也無明顯的條帶。結(jié)果表示清楚，利用高溫反轉(zhuǎn)錄酶成功地對mrna進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄，合成的cdna第一鏈涵蓋了絕大多數(shù)的mrna分子，造成隨后合成的第二鏈同樣涵蓋了絕大多數(shù)的mrna分子。取100ngcdna與zapexpress載體連接后，用gigapackⅲgoldcloningkit提供的包裝蛋白進(jìn)行包裝。獲得庫容為5×105pfu的結(jié)腸癌組織cdna表達(dá)原始文庫。文庫不經(jīng)擴(kuò)增直接用于抗原挑選。2.2從結(jié)腸癌組織cdna表達(dá)文庫中挑選出了33個與患者血清反應(yīng)的克隆a：第一輪挑選；b：第二輪挑選。實(shí)心箭頭所示為第一、二輪挑選的陽性克隆，空心箭頭為在第一輪挑選中呈陽性而在第二輪挑選中呈陰性的克隆圖1文庫血清學(xué)挑選得到的陽性克隆利用上述偶聯(lián)的cnbrsepharose4b柱料吸收后的結(jié)腸癌患者自體血清挑選了總共5×106的克隆。初篩共獲得了89個陽性克隆。圖1a是一張經(jīng)初篩得到的陽性克隆在硝酸纖維素膜上的顯色情況。將得到的89個克隆混合培養(yǎng)后從新轉(zhuǎn)印到新的膜上進(jìn)行第二輪挑選，并排除本身igg反應(yīng)的克隆，即排除那些能直接與抗人igg的二抗反應(yīng)的克隆。圖1b是經(jīng)過第二輪挑選后陽性克隆在膜上顯色的一張代表圖。經(jīng)過第二輪挑選共得到33個陽性克隆。2.3同源性分析陽性克隆基因代表29個不同基因?qū)Λ@得的33個陽性克隆首先進(jìn)行內(nèi)部剪切。用ecori和xhoi雙酶切鑒定外源插入片段的大小。其中31個陽性克隆剪切成功，片段大小在0.5～2.0kb之間。將這些克隆進(jìn)行核苷酸序列測定。核苷酸序列顯示31個克隆代表不同的抗原分子。進(jìn)入genbank進(jìn)行est同源性比較發(fā)現(xiàn)，有29個克隆與genbank已有的est具有較高的同源性，如表1所示。余下2個克隆的序列與genbank已報道的est或基因的外顯子序列無明顯同源。表1部分結(jié)腸癌cdna表達(dá)文庫的陽性克隆的同源性分析克隆號基因名稱c1uracildnaglycosylasec2hlaa2c3humantransmembraneproteintyrosinephosphatasehomologuec4productofmitochondriondnac5peroxisomalfarnesylatedproteinc6humantransforminggrowthfactorbetastimulatedproteinclone22c7cytochromecoxidasesubmitvibc8humanribosomalproteinl11c9humangpiarchoredproteinp137c10humandbpblikeproteinc11humanhypotheticalproteinloc51321c12humanhypotheticalproteinflj20348c13humanganpproteinc14humanapexnucleasemultifunctionaldnarepairenzymec15humanribosomalproteinl23a2.4陽性克隆與正常人血清反應(yīng)性明顯低于結(jié)腸癌患者我們檢測了4個陽性克隆與30例結(jié)腸癌患者血清和30例正常人血清的反應(yīng)情況。圖2是c1克隆與5例結(jié)腸癌和5例正常人血清的反應(yīng)情況。c1克隆與腫瘤患者的血清反應(yīng)明顯強(qiáng)于正常人血清。c1、c29、c21克隆在正常人血清中抗體陽性率較低，均小于23%，而在結(jié)腸癌病人血清中抗體陽性率較高均大于77%，見表2，χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示有顯著性差別〔p0.01〕，提示其有可能成為結(jié)腸癌早期診斷的血清學(xué)標(biāo)記物。c14與正常人和結(jié)腸癌患者血清的反應(yīng)性類似。以c1、c29、c21三個克隆中任意一個陽性為診斷標(biāo)準(zhǔn)，則對上述30例癌和30例正常的診斷特異性和敏感性分別達(dá)90%和70%。假如以c1、c29、c21三個克隆中任意兩個陽性為診斷標(biāo)準(zhǔn)，則對上述30例癌和30例正常的診斷特異性和敏感性分別達(dá)80%和100%。a：腫瘤血清；b：正常血清圖2c1克隆與5例結(jié)腸癌陽性反應(yīng)和與5例正常人血清陰性反應(yīng)表2c1、c29、c21、c14與正常人及結(jié)腸癌病人血清反應(yīng)的陽性率克隆號正常血清陽性率病人血清陽性率卡方檢驗(yàn)c123%(7/30)76%(23/30)p0.01c296%(2/30)80%(24/30)p0.01c210%(0/30)77%(23/30)p0.01c1466%(20/30)73%(22/30)p0.053討論在過去的20多年中，越來越多的證據(jù)顯示機(jī)體對本身腫瘤的成分也能產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)[3，4]，十分是近年來采取serex技術(shù)對多種腫瘤患者的體液免疫反應(yīng)進(jìn)行分析[57]，發(fā)現(xiàn)了很多腫瘤患者血液中都存在與腫瘤細(xì)胞成分十分是胞內(nèi)成分蛋白反應(yīng)的“腫瘤本身抗體〞。這些在惡性腫瘤病人血液中以較高頻度出現(xiàn)的本身抗體一般是非專一性的，綜合反映了異常的腫瘤發(fā)生發(fā)展經(jīng)過中的機(jī)體體液免疫狀況[3]。本研究采取serex技術(shù)對結(jié)腸癌腫瘤本身抗體譜進(jìn)行了研究，獲得了31例陽性克隆，代表了31種結(jié)腸癌腫瘤本身抗體。其中有兩個克隆與已經(jīng)知道的est和人的dna外顯子序列無明顯同源，有報道這些序列表達(dá)的肽段可能是模仿了某些抗原分子的表位而被腫瘤本身抗體所辨別[8]。其余29例陽性克隆包含人線粒體基因，本身抗原，分子，dna修復(fù)酶，細(xì)胞膜外表蛋白，核糖體蛋白及一些當(dāng)前功能尚未確定的基因等，其中既有發(fā)生了點(diǎn)突變及缺失的基因，也有未發(fā)生突變的基因。比方，c3是人跨膜蛋白酪氨酸激酶同源蛋白,i型糖尿病本身抗原，屬于癌癥非依靠性本身抗原。c4、c22、c21、c23、c27均為人線粒體基因組片段，c8、c15均為核糖體蛋白，應(yīng)屬于癌癥相關(guān)本身抗原，其在正常組織及腫瘤組織均有表達(dá)，在腫瘤壞死時被暴露出來，進(jìn)而被免疫系統(tǒng)所辨別，發(fā)生體液免疫應(yīng)答。其中c1，尿嘧啶dna糖基化酶，重要參與dna復(fù)制時錯配的修復(fù)；c14人apex核酸酶(多功能dna修復(fù)酶)基因；二者都參與dna的復(fù)制及修復(fù)。這些抗原基因是通過何種機(jī)制誘發(fā)腫瘤患者產(chǎn)生本身抗體，它們又是怎樣參與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展的呢？這仍需一步的研究。腫瘤本身抗體譜作為腫瘤血清診斷的新型標(biāo)記物的應(yīng)用前景和價值已逐步被學(xué)界認(rèn)可，這一領(lǐng)域的研究已逐步成為腫瘤血清診斷的新型標(biāo)記物研究的熱門。2005年，wang等[8]報道他們通過類似的方法得到的22個前列腺癌抗原對于前列腺癌的診斷的敏感性到達(dá)了81.6%，特異性到達(dá)了88.2%，明顯高于psa診斷的結(jié)果。他們的這一研究被新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志評為近年來分子診斷標(biāo)記物的最主要的進(jìn)展[9]。2006年的一項(xiàng)最新研究報道也顯示，蛋白芯片檢測本身抗體譜技術(shù)能夠提早于臨床診斷5年發(fā)現(xiàn)約80%的處于“癌前〞階段的患者，證明該技術(shù)在癌前病變的篩查中也具有非常主要的作用[10]。本研究對新發(fā)現(xiàn)4個結(jié)腸癌本身抗體作為結(jié)腸癌血清標(biāo)記物的潛能進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：c1、c29、c21在正常人血清中抗體陽性率較低，均小于23%，而在結(jié)腸癌病人血清中抗體陽性率較高，均大于77%,χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示有顯著性差別〔p0.01〕。應(yīng)用多個分子標(biāo)記物聯(lián)合診斷腫瘤已經(jīng)成為學(xué)界共鳴。我們應(yīng)用這三個標(biāo)記物聯(lián)合分析也明顯地提升了診斷的敏感性和特異性，說明其能夠成為結(jié)腸癌早期診斷的血清學(xué)標(biāo)記物。我們也對這4個本身抗體與結(jié)腸癌的不同臨床分期和分化類型的相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有明顯的相關(guān)性。我們以為這可能是由于我們所用的病例數(shù)太少的原因?？傊?，我們的研究分離得到了結(jié)腸癌相關(guān)腫瘤抗原。這些結(jié)腸癌相關(guān)腫瘤抗原可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，同時可以能成為結(jié)腸癌診斷的血清學(xué)分子標(biāo)記物?！疽韵聻閰⒖嘉墨I(xiàn)】[1]houghtonan,guevara-patinoja.immunerecognitionofselfi