HPV16E6蛋白在宮頸病變組織中的表達(dá)及臨床應(yīng)用

HPV16E6蛋白在宮頸病變組織中的表達(dá)及臨床應(yīng)用hpv16e6蛋白在宮頸病變組織中的表達(dá)及臨床應(yīng)用【本文關(guān)鍵詞語】人乳頭瘤病毒16型e6蛋白;免疫組織化學(xué);宮頸腫瘤;hpv疫苗【內(nèi)容摘要】目的研究人乳頭瘤病毒16型e6蛋白(humanpapillomavirus16e6protein，hpv16e6)在宮頸病變組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征之間的關(guān)系。方法采取免疫組化sp法檢測hpv16e6蛋白在宮頸正常組織、慢性炎癥、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervicalintraepithelialneoplasia，cin)、浸潤癌上皮中的陽性表達(dá)情況。結(jié)果hpv16e6在正常宮頸、宮頸炎、cin,宮頸癌各組中，陽性表達(dá)率分別為0.5%、38.35%、46.15%、71.11%，4組比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=27.50，p0.01)。經(jīng)χ2分割后比較(α′=0.007143)，宮頸癌組、cin組、宮頸炎組的陽性率顯著高于正常宮頸組(p0.05)，宮頸癌組的陽性率顯著高于宮頸炎組(p0.01)。hpv16e6與年齡、病理類型、宮旁或脈管浸潤相關(guān)(p0.05)。結(jié)論hpv16e6與宮頸癌的啟動、發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移均親密相關(guān)。hpv疫苗對于宮頸癌的防治有廣泛的應(yīng)用前景?！颈疚年P(guān)鍵詞語】人乳頭瘤病毒16型e6蛋白;免疫組織化學(xué);宮頸腫瘤;hpv疫苗theexpressionandclinicalsignificanceofhpv16e6inthepathologicaltissuesofcervixzhanglihua,xinhuadong,wumentofgynecology,handancentralhospital,hebei,handan056001,china【abstract】objectivetoinvestigatetherelationshipbetweentheexpressionofhumanpapillomavirus16e6protein(hpv16e6)andclinicalpathologicalstheexpressionofhpv16e6proteininpatientswithcervicalcancer,cervicalintraepithelialneoplasia(cin),chroniccervicitisandnormalcervicalepitheliumwereexaminedbysthepositiverateofhpv16e6proteinwas71.11%,46.15%,38.35%,0.5%incervicalcancer,cin,chroniccervicitisandnormalcervicalepitheliumrespectively.thereweresignificantdifferencesinthepositiveratesamongthe4groups(p0.01).thepositiverateincervicalcancergroupwassignificantlyhigherthanthatinchroniccervicitisgroupandnormalcervicalepitheliumgroup(p0.01).thepositiverateincinandcervicitisgroupwassignificantlyhigherthanthatnormalcervicalepitheliumgroup(p0.01).thepositiveexpressionofhpv16-e6wascorrelatedwiththeageofthepatients,pathologicaltypesandtheinfiltrationoflatero-uterusorhaemaltube(p0.05).conclusionhpv16e6playsanimportantroleinthegenesis,development,invasionandmetastasisofcervicalcarcinoma.thevaccineofhpvhaswideapplicationprospectinthepreventionandtreatmentofcervicalcarcinoma.【keywords】hpv16e6;immunohistochemitry;cervicalcancer;vaccineofhpv宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤[1]，在我們國家發(fā)病率居女性惡性腫瘤的首位，是導(dǎo)致女性死亡的重要原因[2]。高危型hpv的連續(xù)感染是宮頸癌及其癌前病變的直接病因，沒有連續(xù)高危hpv感染，便沒有可能發(fā)生宮頸鱗癌[3，4]。本研究采取免疫組化法檢測人不同宮頸病變組織中的hpv16e6蛋白的陽性率，討論hpv16e6蛋白不同宮頸病變組織中的表達(dá)情況及其與宮頸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。1資料與方法1.1一般資料本研究標(biāo)本取自2007年3月至2009年3月在河北省邯鄲市中心醫(yī)院婦科初診的宮頸癌患者45例。年齡26～61歲，平均年齡46歲。其中鱗癌36例，腺癌6例，腺鱗癌及透明細(xì)胞癌3例。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(figo，2000年)標(biāo)準(zhǔn)分期：ⅰ期25例，ⅱ期17例，ⅲ期3例。組織分化水平g1、g2、g3分別為12例、20例、13例?；颊咝g(shù)前均未承受放、化療。選擇同期因婦科良性疾病手術(shù)治療或門診治療患者的正常宮頸組織21例，宮頸慢性炎癥73例，cin26例。所有標(biāo)本于離體0.5h內(nèi)取材，以10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片備用。所有取材標(biāo)本均慣例he染片確定病理學(xué)診斷、組織學(xué)類型和分級，病歷資料完好。1.2檢測方法采取鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物酶聯(lián)合免疫組化(sp)法進(jìn)行實驗檢測?；驹硎遣扇∩锼貥?biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及基質(zhì)素混合液來測定細(xì)胞和組織中的抗原。鼠抗人hpv16e6單克隆抗體、即用型鼠spkate檢測試劑、dab顯色試劑盒、sp試劑盒均為北京中山生物技術(shù)產(chǎn)品。本實驗染色程序嚴(yán)格按sp染色試劑盒說明書操作。1.3免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)文獻(xiàn)，按陽性細(xì)胞百分比及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱評分(immunohistochemicalscores，ihs)[5]：ihs=a×b。a代表陽性細(xì)胞百分比：a=0，無陽性細(xì)胞;a=1，陽性細(xì)胞為1%～10%;a=2，陽性細(xì)胞為11%～50%;a=3，陽性細(xì)胞為51%～80%;a=4，陽性細(xì)胞為81%以上。b代表陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱：b=0，陰性;b=1，弱陽性;b=2，中度陽性;b=3，強(qiáng)陽性。ihs0分為(-);ihs1～4分為(+);ihs5～8分為(++);ihs9～12分為(+++)。hpv16e6蛋白陽性細(xì)胞以胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為主，部分出如今胞漿中。每張切片均以ihs評價得分情況。每批染色均同步設(shè)立對照，以pbs液代替一抗為陰性空白對照。1.4統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用sas8.1統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采取χ2檢驗、確切概率法、多個樣本率比較的χ2分割法，p0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1hpv16e6蛋白在不同宮頸病變組織中的表達(dá)hpv16e6染色陽性以胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為主，部分出如今胞漿中，其在正常宮頸、宮頸炎、cin、宮頸癌各組中的陽性表達(dá)率分別為0.5%、38.35%、46.15%、71.11%，4組比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=27.50，p0.01)。經(jīng)χ2分割后比較(α′=0.007143)，宮頸癌組的陽性率明顯高于宮頸炎組及正常宮頸組(χ2=11.95，p=0.0005;χ2=25.21，p0.01)。cin組明顯高與正常宮頸組(χ2=9.95，p=0.0016)。宮頸炎組明顯高于正常宮頸組(χ2=8.63，p=0.0033)。而宮頸癌組與cin組，cin組與宮頸炎組陽性率比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.35，p=0.0369;χ2=0.4841，p=0.4866)。cin組及宮頸炎組內(nèi)重度病變陽性率明顯高于輕度病變(χ2=11.17，p=0.0008)。見表1、2。表1hpv16e6在cc、cin、cc正常宮頸組織中表達(dá)比較表2χ2分割后hpv16e6陽性表達(dá)率比較2.2hpv16e6蛋白的表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系hpv16e6的陽性率在宮頸癌組織中的表達(dá)與組織學(xué)分級、臨床分期、有無淋逢迎轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑、肌層浸潤深度差別無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。在45歲和≥45歲患者中分別為57.65%、89.47%，二者比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.39，p0.05);在鱗癌與非鱗癌中分別為88.24%、18.18%，二者比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.59，p0.05);有宮旁或脈管浸潤與無宮旁或脈管浸潤的組織中分別為89.47%、57.69%，二者比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.40，p0.05)。見表3。表3hpv16e6蛋白表達(dá)與宮頸癌的關(guān)系和臨床病理特征3討論hpv為乳多空病毒科a屬成員，由無被膜的正20面體構(gòu)成病毒殼體，是7900bp環(huán)狀、雙鏈、右手螺旋、嗜上皮性的dna病毒[6]。錢元淑等[7]用pcr法檢測hpv16/18在宮頸癌及其癌前病變中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：hpv16/18陽性率在正常宮頸到宮頸炎、cin、再到宮頸癌有逐步升高趨勢。宮頸癌組與cin組、cinⅲ與cinⅰ～ⅱ級、中重度宮頸炎組與輕度宮頸炎組差別有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究頂用χ2分割法處理后，宮頸癌組陽性率顯著高于宮頸炎組及正常宮頸組，cin組和宮頸炎組陽性率顯著高于正常宮頸組。提示：從正常宮頸向cin及宮頸癌的轉(zhuǎn)化是一個漸進(jìn)的經(jīng)過，而高危型hpv16感染是宮頸細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的主要因素，是宮頸病變發(fā)生的早期事件。本實驗中，經(jīng)χ2分割后，宮頸癌組與cin組的陽性率無統(tǒng)計學(xué)意義，分析可能與cin組樣本例數(shù)少有關(guān)，但cinⅲ級顯著高于cinⅰ～ⅱ級，中重度宮頸炎顯著高于輕度宮頸炎，提示：hpv16感染在宮頸病變早期發(fā)揮作用，且陽性率有逐步增高趨勢。與文獻(xiàn)報道[8，9]結(jié)果類似。當(dāng)前大量研究發(fā)現(xiàn)：高危型hpvdna整合[10]到宿主基因組將導(dǎo)致宿主細(xì)胞產(chǎn)生抑癌基因功能缺陷、基因組不穩(wěn)定性和細(xì)胞永生化等一系列不可逆的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是宮頸癌變的主要機(jī)制之一。高危型hpv從腫瘤的啟動、發(fā)生、發(fā)展及惡性表型的全經(jīng)過都親密相關(guān)。由此可見，hpv16感染在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮主要作用。本研究顯示：在宮頸癌組織中hpv16e6蛋白的陽性表達(dá)率與宮旁或脈管浸潤有關(guān)(p0.05)。關(guān)于hpv感染對宮頸癌侵襲能力的報道較少。研究顯示：與hpv感染相關(guān)的高級鱗狀上皮內(nèi)病變及惡性腫瘤中e6和e7蛋白的表達(dá)水平顯著提升，表示清楚e6和e7蛋白的表達(dá)水平與病變的進(jìn)展水平及細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化親密相關(guān)。特定的hpv16e6變異可能具有較高的宮頸癌患病風(fēng)險[11]。眾多研究證明端粒酶的激活與宮頸異型增生和宮頸癌的進(jìn)展經(jīng)過有關(guān)[12-14]。hpv16e6可提升端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase，htert)mrna的水平，激活端粒酶，是cin向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)化經(jīng)過中的關(guān)鍵步驟，其陽性表達(dá)率隨宮頸癌前病變的進(jìn)展逐步升高，與宮頸癌的級別呈正相關(guān)[15]。同所有實體腫瘤一樣，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移呈明顯的血管依靠性。血管內(nèi)皮生長因子c(vascularendothelialgrowthfactorsc，vegfc)在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，具有誘導(dǎo)血管和淋巴管生成的潛能，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。多項研究顯示[16-18]：vegfc與高危型hpv癌蛋白在宮頸癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，揣測高危型hpv可能在整合入宮頸上皮細(xì)胞dna后，通過促進(jìn)宮頸上皮高表達(dá)vegfc導(dǎo)致腫瘤內(nèi)及癌旁組織新生血管及淋巴管的構(gòu)成，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。上述因素協(xié)同作用，促進(jìn)病毒基因組的復(fù)制和繁衍，使含有整合狀況的病毒癌基因的細(xì)胞不斷的增殖。這與本研究hpv16e6蛋白與宮旁或脈管浸潤有關(guān)一致。提示：高危型hpve6蛋白在促進(jìn)宮頸上皮癌變經(jīng)過中飾演主要角色，hpv16在宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定作用。sherman等[19]以為對ascus患者進(jìn)行hpv檢測可早期發(fā)現(xiàn)cinⅲ及宮頸早期浸潤癌。當(dāng)前的重要觀點是：對細(xì)胞學(xué)檢查顯示ascus且年齡在30以上的患者應(yīng)進(jìn)一步行hpvdna檢測，而且只對高危hpv檢測結(jié)果陽性者作進(jìn)一步陰道鏡檢查。這不僅提升宮頸癌及癌前病變篩查的靈敏度，且可避免和減少不需要的陰道鏡檢查。cin病變在治療后，hpv檢測呈陽性可能意味著病變的殘存余留，有助于評價療效及預(yù)測復(fù)發(fā)。研究顯示：高載量的hpv16型病毒感染不僅與宮頸上皮內(nèi)瘤變的進(jìn)展有關(guān)，還強(qiáng)烈預(yù)示著發(fā)生浸潤性宮頸癌的風(fēng)險增高，且病毒負(fù)荷量越高，宮頸病變加重的風(fēng)險越大[20]。hpv的檢測方法許多，其中僅第二代雜交捕獲法(hybridcaprureⅱ，hcⅱ)被美國食品藥品管理局批準(zhǔn)可廣泛應(yīng)用。hcⅱ敏感性高而特異度較低，固然流行病學(xué)調(diào)查證明hpv負(fù)荷量與宮頸癌患病風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)，但評價長期病毒負(fù)荷狀況與hpv感染進(jìn)展為cin和宮頸癌相關(guān)性的縱向研究數(shù)據(jù)較缺乏。hcⅱ并不能精到準(zhǔn)確地識別hpv類型，且hpv連續(xù)感染和一過性感染都可能表現(xiàn)出高h(yuǎn)pv負(fù)荷，常不能精確評判hpv感染狀況。hcⅱ作為宮頸癌的診斷手段及價值文獻(xiàn)報道不一，存在爭議。隨著hpv病毒與宮頸癌關(guān)系確實定，大大推動了相應(yīng)疫苗的研究。當(dāng)前已有2種hpv預(yù)防性疫苗上市，分別是四價疫苗“gardasil〞和雙價疫苗“cervarix〞?！癵ardasil〞于2006年6月獲美國fda批準(zhǔn)在人群中廣泛使用，是包括hpv16、18、6、11型的混合型疫苗。臨床ⅲ期實驗表示清楚，不僅能夠100%保衛(wèi)健康女性不發(fā)展到高級別宮頸上皮內(nèi)病變階段，對于已有宮頸上皮內(nèi)瘤樣變的患者可部分抑制其病情的進(jìn)展[21]?！癱ervarix〞是包括hpv16、18型其余混合性疫苗，臨床ⅱ期實驗的跟蹤結(jié)果顯示：疫苗的保衛(wèi)期可達(dá)6.4年[22]。當(dāng)前我們國家正在進(jìn)行涵蓋我們國家優(yōu)勢流行病毒株hpv58的多價混合性疫苗的臨床前研究，包括hpv16、18、58、6、11五種型別，估計2～3年進(jìn)入臨床實驗研究階段。臨床實驗表示清楚兩種上市疫苗對型別之外的其他高危型hpv感染及癌前病變沒有預(yù)防作用，故接種宮頸癌疫苗不能完全代替宮頸癌篩查，當(dāng)前宮頸癌篩查還是預(yù)防宮頸癌的有效手段。hpv治療性疫苗重要是誘發(fā)針對e6、e7蛋白的細(xì)胞免疫反應(yīng)，在臨床ⅰ、ⅱ期試驗中顯示出良好的抗hpv反應(yīng)，但尚無有效的hpv治療性疫苗問世。綜上所述，高危型hpv從宮頸癌的啟動、發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的全經(jīng)過都親密相關(guān)。作為宮頸癌前病變及浸潤癌的病因已得到多項研究的證明，在與其他致癌因素的協(xié)同下促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化并永生化，繼而通過端粒酶、vegfc等復(fù)雜的機(jī)制促進(jìn)宮頸癌惡性生物學(xué)行為的演進(jìn)，因而，針對高危型hpv的檢測、預(yù)防及治療具有主要的臨床意義及社會效益?！疽韵聻閰⒖嘉墨I(xiàn)】1linh，mohjs，ouyc，etal.asimplemethodforthedetectionandgenotypingofhighriskhumanpapillomavirususingseminestedpolymerasechainreactionandreversehybridization.gynecoloncol，2005，96：8491.2李淑敏，章文華，吳令英，等.人乳頭狀瘤病毒負(fù)荷量與子宮頸癌及其癌前病變關(guān)系的初步研究.雜志，2004，39：400402.3陳浩華，謝文華.子宮頸病變的篩查方法及其新進(jìn)展.河北醫(yī)藥，2008，30：15861587.4coxpapillomavirustestinginprimarycervicalscreeningandabnormalpapanicolaoumanagement.obstetgynecolsurv，2006，191：1525.5歐陽艷瓊，吳緒峰，陳惠禎,等.宮頸癌組織中環(huán)氧合酶2和誘生型一氧化氮合酶的表達(dá)及其意義.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2003，12：364.6marshallaldysplasiaearlymedrev，2003，8：156170.7錢元淑，呂雯，隋麗華.人乳頭狀瘤病毒16/18、單純皰疹病毒ⅱ型和巨細(xì)胞病毒感染與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系.臨床流行病學(xué),2005，26：622625.8李際春，韓淑霞，何玲，等.宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變與人乳頭瘤病毒感染的相關(guān)分析.寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2008，30：10631064.9姜星，曾子華，周序瓏.hpv和vegf在子宮頸癌及癌前病變中的表達(dá)研究.中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2007，8：103110.10hocm，chienty，huangsh，etatedhumanpapillomavirustypes52and58areinfrequentlyfoundincervicalcancer，andhighviralloadspredictriskofcervicalloncol，2006，102：5460.11grodzkim，bessong，clavelc，etsedriskforcervicaldiseaseprogressionoffrenchwomeninfectedwiththehumanpapillomavirustype16e6350gepidemiolbiomarkersprev，2006，15：820822.12shayjw，gazdarraseintheearlydetectionofcancer.jclinpathol，1997，50：106.13nairp，jayaprakishpg，nairmk，etrase，p53andhumanpapillomavirusinfectionintheuterineoncol，2000，39：6570.14孫信，薛敏，鄧新糧.宮頸病變中端粒酶活性與高危hpv感染關(guān)系的研究.實用預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008，15：10211024.15萬俊，崔滿華.端粒與端粒酶與宮頸癌及癌前病變的關(guān)系.國外醫(yī)學(xué)婦幼保健分冊，2003，14：396398.16李艷麗，鄭紅兵，李允光，等.vegfc在宮頸病變中的表達(dá)及其與高危型hpv感染的相關(guān)性.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)雜志，2007，15：834837.17靳雙玲，趙澤燕，邊肖海.血管內(nèi)皮生長因子c、高危型人乳頭瘤病毒在子宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變及子宮頸鱗癌中的表達(dá)和意義.腫瘤研究一臨床雜志，2006，18：615618.18brancaf，giorgic，santinid，etal.aberrantexpressionofvegfcisrelatedtogradeofcervicalintraepithelialneoplasin(cn)andhighris