遺傳性疾病的分子診斷

遺傳性疾病診斷策略1.點突變的診斷

方法有等位基因特異性寡核苷酸雜交（ASO）、PCR－ELISA、等位基因特異性擴增（ASA）、PCR－RFLP、基因芯片技術進行診斷；對于一些基因背景未知的點突變，可以采用單鏈構象多態(tài)性（SSCP）、變性梯度凝膠電泳（DEEG）、異源雙鏈分析（HA）、DNA序列測定、蛋白截短測試等方法。

2.片段性突變的檢測

片段性突變是指DNA分子中較大范圍的堿基發(fā)生突變，如堿基的缺失、插入、擴增和重組。對于少數(shù)核苷酸缺失或插入，可以采用檢測點突變的方法，而對于大的片段突變，則使用Southern印跡技術和多重PCR技術。杜氏和貝氏肌營養(yǎng)不良癥的基因診斷

多重PCR檢測患者缺失凝膠電泳圖（9對引物）P1除外顯子1外其余均缺失；

P2外顯子8－19有小的缺失；P3外顯子44-50缺失；

P4外顯子45－52有小的缺失；B1空白對照；C1、C2正常對照。DNAmRNA蛋白質(zhì)轉錄反轉錄

翻譯

核酸的分子雜交

基因結構異?；虮磉_異常PCR

DNA測序

Nothern-blot

實時熒光定量PCR

反轉錄PCR

蛋白質(zhì)芯片

ELISA

蛋白組織化學染色Western-blot基因芯片

基因診斷的技術和方法一、限制性酶切圖譜直接分析法

導致某一限制酶識別位點移位的大片段缺失或插入，

導致某一限制酶識別位點喪失或獲得的點突變，均可引起相應限制性片段的長度和數(shù)量發(fā)生變化。分析限制性酶切圖，即可診斷出此類突變。×MstⅡ酶切位點(GCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析二、ASO探針雜交受檢者基因組DNA或含突變位點的PCR擴增產(chǎn)物與標記的ASO探針雜交主要適用于檢測已知點突變ASO1ASO2NormalHeteroHomo

將與致病基因連鎖的某種多態(tài)性標志作為遺傳標志，在同一個家系成員中探查是否存在致病基因的方法即為基因連鎖分析法。

基因連鎖分析

遺傳性疾病的主要分子機理是基因突變，因而是基因診斷的最佳適應癥。用分子生物學技術直接檢測病原體，可對感染性疾病特異、快速地作出早期診斷?；蛟\斷在遺傳性疾病中的應用

血紅蛋白病最早成功進行產(chǎn)前基因診斷可分為兩大類：異常血紅蛋白病（abnormalhemoglobinsyndrome）地中海貧血（thalassemia）一、

遺傳性疾病1）異常血紅蛋白病珠蛋白基因突變（單鹼基替代、缺失或插入等）

鐮狀細胞貧血：

b-珠蛋白基因第6位密碼子GAG→GTG(E6V)

該突變使限制酶MstII位點消失(CCTGAGG→CCTGTGG)

診斷方法：限制性酶切圖譜直接分析法(基因組DNA或PCR產(chǎn)物)ASO斑點印跡雜交分析法

(ASO=等位基因特異性寡核苷酸探針)

b-珠蛋白基因點突變

GAG(Glu)-->GTG(Val)

bAprobeACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCbSprobeACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC

HeterobAprobebSprobeHomoNormal

a-地中海貧血：

不同數(shù)量(1-4個)a-珠蛋白基因缺失

aa

14kbBamHIBamHIaa/aaaa/--aa/a-a-/----/--10kb14kb10kb

a

2）地中海貧血

珠蛋白基因缺失或基因中某些鹼基替代→影響a-或b-珠蛋白鏈的合成速率→a-或b-地貧b-地中海貧血主要是b-珠蛋白基因點突變。突變常不涉及限制酶識別位點不能用限制性酶切圖譜進行直接分析。診斷方法：

RFLP連鎖分析間接檢測病變基因

ASO斑點印跡雜交分析直接檢測病變基因點突變

DNA芯片（包括各種基因突變位點的所有探針）可快速、簡便地檢出所有已知突變

甲型血友病（血友病A）凝血因子IIIV（FIIIV）缺乏所致，發(fā)病的分子機制是FIIIV基因突變，主要為點突變或少數(shù)鹼基的缺失和插入以及第22內(nèi)含子的大片段倒位。乙型血友病（血友病B）起因于凝血因子IX的缺乏其分子機制是分布于整個基因各處的多種形式的突變。

診斷方法：PCR/ASO直接檢測法（點突變）

PCR/RFLP連鎖分析法（多種不定突變）（2）血友病（haemophilia）

人類基因組上的DNA遺傳標記

限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs)1985短串聯(lián)重復序列(shorttendemrepeats,STRs,mini-satellites)1990s單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotidepolymor-phismsSNPs)短串聯(lián)重復序列STRs(shorttendemrepeats,Microsatellites)STR廣泛存在于人基因組，占約5%，基本單位是1bp-8bp的串聯(lián)重復，重復次數(shù)n=15-60，已知8000多個，主要形式為：

(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，

(CGG)n，其中以

(CA)n，(GT)n為多見。1992年，Welssenbanch等以STR為標記的第二代連鎖圖取代了RFLP連鎖圖。

定義:主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。與RFLP與STR不同,它是直接以序列的變異作為標記,而不是以片段的長度差異作為標記.

人類基因組圖譜的初步分析表明，共有3萬至3.5萬個基因。有300多萬個單核苷酸多態(tài)性,SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，3-4個相鄰的標記構成的單倍型（haplotype）就可有8-16種。

1996年，Lander報道了用單核苷酸多態(tài)性標記制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標記。單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidpolymorphism，SNP）

SNP用作遺傳標記具有以下優(yōu)點：①SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計出來。②它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標記廣泛得多。③與串聯(lián)重復的微衛(wèi)星位點(STR)相比，SNP是高度穩(wěn)定的.尤其是處于編碼區(qū)的SNP(cSNP),而前者的高突變率容易引起對人群的遺傳分析出現(xiàn)困難。④部分位于基因內(nèi)部的SNP可能會直接影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結構或基因表達水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機制的候選改變位點。⑤易于進行自動化分析，縮短了研究時間.點突變(pointmutation)包括錯義突變、無義突變、移碼突變。各種點突變所造成的后果：

蛋白質(zhì)分子量改變蛋白質(zhì)合成量下降無蛋白質(zhì)合成片段性突變(fragememtalmutation)核苷酸的丟失和增多缺失：基因中鹼基（遺傳物質(zhì)）的丟失插入：外來基因片段插入某一基因序列中倍增：基因內(nèi)部某一段序列發(fā)生重復基因重排：基因組中原來不在一起的基因由于某些原因組合排列在一起DMD的基因檢測

Duchennemusculardystrophy(DMD)是一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X連鎖的遺傳性疾病，在3500個活產(chǎn)男嬰中即有一個患者。

DMD基因的全長為250kb，有79個外顯子。

DMD的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占

60%~70%。單拷貝序列在基因組中僅出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次，大多數(shù)基因(50%-80%)在單倍體中都為單拷貝。中度重復序列

重復次數(shù)為數(shù)十至數(shù)萬(<105)次，長度多在300-7000bp，多為不編碼序列，與單拷貝基因間隔排列。如Alu家族、KpnI家族、rRNA等。高度重復序列存在于基因組的間隔區(qū)和基因的內(nèi)含子等非編碼區(qū)重復頻率可高達106以上，不轉錄具高度多態(tài)性，成為有效的遺傳標記志已廣泛用于基因定位和基因診斷雙等位基因(bi-allele）多態(tài)性：限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）第一代DNA遺傳標記，所含信息量有限。

檢測技術：Southern印跡技術多等位基因多態(tài)性(multi-allele)小衛(wèi)星序列又稱串聯(lián)重復可變數(shù)目（variablenumbertandemrepeats，VNTR）第二代DNA遺傳標志，屬高度重復序列以6~70bp為單位，以串聯(lián)形式排列，構成數(shù)量可變的串聯(lián)重復序列等位基因常常達10個以上，信息量比RFLP大檢測技術：PCR

微衛(wèi)星序列(microsatellite)以2~6bp為單位(如CArepeat)，又稱短串聯(lián)重復序列(STR)

。在基因組中分布廣泛，重復次數(shù)可達幾十次，具高度多態(tài)性。檢測技術：PCR單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepoly-morphism，SNP)第三代DNA的遺傳標志，其多態(tài)性僅表現(xiàn)為單個核苷酸的變異。在人類基因組中的數(shù)目可達300萬個，是一種信息量非常大的標記系統(tǒng)。

檢測技術：DNA芯片技術凝血因子Ⅷ(F8)基因的主要遺傳缺陷主要為點突變和基因缺失 缺失 169種

插入 28種

點突變 347種第22號內(nèi)含子倒位:40%-50%重型HA

一DNA多態(tài)

DNA多態(tài)（DNAPolymorphism）：群體中每個個體DNA區(qū)域中等位基因（或片段）存在兩種或兩種以上的形式，對基因功能沒有影響，稱DNA多態(tài)。它通過孟德爾方式遺傳。常用做遺傳分析中的標記。DNA分析中常用的遺傳性多態(tài)性標記有3類：1）RFLP：稱限制性片段長度多態(tài)性，為第一代多態(tài)性標記；2）重復序列多態(tài)性（VNTR）：如短串聯(lián)重復序列（STR），為第二代多態(tài)性標記；3）單堿基多態(tài)性（SNP）：DNA序列的單個核苷酸的差別，為第三代多態(tài)性標記。二)數(shù)目變異串聯(lián)重復，variablenumbertandemrepeats,VNTR）重復序列以各自的核心序列（重復單元），首尾相連多次重復，稱為串聯(lián)重復序列，其重復次數(shù)在人群中存在變異，形成多態(tài)即VNTR。散在分布于染色體上。重復單位6~25bp長，稱為小衛(wèi)星DNA。

重復單位2~6bp長，如（TA）n,(CGG)n等，稱為微衛(wèi)星DNA。VNTR兩側酶切位點固定，但兩酶切點之間的串聯(lián)重復拷貝數(shù)不同，酶切后產(chǎn)生不同長度的片段。DNA多態(tài)可以通過PCR擴增后電泳來檢出，稱擴增片段長度多態(tài)（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,Amp-FLP）VNTR酶切，電泳后的檢測結果

大小PCR-VNTR檢測PCR-VNTR三)單核苷酸多態(tài)性（SNP）（SingleNucleiotidePolymorphism）SNP：發(fā)生在基因組中的單個核苷酸的替代根據(jù)SNP在基因中的位置，分為：基因編碼區(qū)SNP

基因周邊SNP

基因間SNP在人類基因組中每100~300個核苷酸就有一個SNP1Southernblot--RFLP診斷(PKU)PAH基因兩側有Msp1酶切位點,用該酶消化可產(chǎn)生23kb、19kb兩種等位片段，以PAHcDNA為探針與PKU家系成員外周血DNA雜交。間接基因診斷患者為19kb片段的純合子,說明患者缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖其父、母親缺陷的PAH基