實驗七八課件

實驗七單向瓊脂擴散試驗實驗八雙向瓊脂擴散試驗指導老師：程燕概述沉淀反應：可溶性抗原（如細菌浸出液、血清以及其他來源的蛋白質、多糖等）與其相應的抗體相遇后，在電解質參與下，抗原抗體結合形成白色絮狀沉淀，出現(xiàn)白色沉淀線，此種現(xiàn)象稱為沉淀反應。沉淀反應主要包括：1、環(huán)狀沉淀反應：主要是用已知的抗體診斷未知的抗原（試管內(nèi)）。2、絮狀沉淀反應：常用于毒素與抗毒素的滴定（試管內(nèi)或凹玻片上）。3、瓊脂凝膠免疫擴散：指抗原抗體在瓊脂凝膠內(nèi)擴散，特異性的抗原抗體相遇后，在凝膠內(nèi)的電解質參與下發(fā)生沉淀，形成可見的沉淀線。這種反應簡稱瓊脂擴散。（平皿或玻片上）

實驗原理抗原抗體復合物的沉淀帶是一種特異性的半滲透性屏障。阻止免疫學性質與其相似的抗原抗體分子通過，允許那些性質不相似的分子繼續(xù)擴散，所以：由不同抗原或不同抗體所形成的沉淀帶各有各的位置，從而可以分離和鑒定混合系統(tǒng)本實驗中使用瓊脂凝膠形成構架，1％-2%瓊脂所形成的構架網(wǎng)孔較大，允許分子量在20萬以下甚至更大些的大分子物質通過，絕大多數(shù)可溶性抗原和抗體的分子量在20萬以下，因此可以在瓊脂凝膠中自由擴散，所受阻力較小。抗原與抗體在瓊脂凝膠中相遇，在最適比例處發(fā)生沉淀，此沉淀物因顆粒較大而不擴散，故形成沉淀帶。實驗七

單向瓊脂擴散試驗（一）實驗目的掌握一種抗原的定量測定方法觀察單向瓊脂擴散試驗形成的沉淀環(huán)了解沉淀環(huán)的直徑與抗原或抗體濃度的關系（二）實驗原理單向瓊脂擴散是一種定量檢測抗原的方法。在含有相應特異性抗體的瓊脂板孔內(nèi)加入待測血清（抗原）。抗體在瓊脂內(nèi)有一定濃度，抗原經(jīng)過一定時間擴散，在適當?shù)臐舛忍幣c抗體相遇結合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的直徑大小與樣品中抗原濃度成正比。根據(jù)沉淀環(huán)的直徑從標準曲線中即可算出抗原的含量。（三）實驗材料2.5％生理鹽水瓊脂標準抗體（Ab）：羊抗兔IgG標準抗原（Ag）：兔IgG生理鹽水、待測抗原（待測Ag）恒溫培養(yǎng)箱、水浴箱、微量加樣器、打孔器、載玻片、吸管、濕盒、坐標紙（四）實驗步驟5、打孔：孔徑3mm，孔距10mm，挑取、封板。6、加樣及擴散：各濃度參考血清及待檢血清按順序加入，每孔10ul，濕盒、37℃溫箱擴散，24h。8、測量并計算：測量稀釋標準抗原各沉淀環(huán)直徑，做標準曲線，測待檢抗原的沉淀環(huán)直徑，依據(jù)標準曲線計算待測血清中IgG的實際含量。（五）實驗結果實驗八雙向瓊脂擴散實驗（一）實驗目的了解雙向瓊脂擴散試驗的原理和用途掌握抗體效價和特異性的測定方法觀察沉淀線的特征（二）實驗原理將抗原和抗體分別加到含有電介質的瓊脂板相應孔內(nèi)，兩者各自向四周擴散。如抗原抗體對應，就在比例適當處形成白色沉淀線。一對抗原抗體系統(tǒng)只能形成一條沉淀線。如果有多對抗原抗體系統(tǒng)，則因其分子大小不同，擴散速度不同，可在瓊脂中出現(xiàn)多條沉淀線。根據(jù)沉淀線的形態(tài)和位置等可作如下三種分析：1.抗原或抗體的存在與否及其相對含量的估計2.抗原或抗體相對分子量的分析3.用于抗原性質的分析1.抗原或抗體的存在與否及其相對含量的估計沉淀線的形成是根據(jù)兩者比例，沉淀線靠近抗原孔，則指示抗體含量較大；靠近抗體孔，則指示著抗原含量較多。不出現(xiàn)沉淀線則表明抗體或抗原的缺如或者抗體或抗原過剩。另外，如出現(xiàn)多條沉淀線，則說明抗原和抗體均不是單一的成分。因此，可用于鑒定抗原或抗體的純度。兩種受檢抗原的性質可完全相同、部分相同或完全不同。3.用于抗原性質的分析雙向瓊脂擴散平板法

在瓊脂板上相距3～5mm打一對孔，或者打梅花孔、雙排孔、三角孔型等。在相對的孔中加入抗原或抗體，置室溫或37℃18～24h后，凝膠中各自擴散的抗原和抗體可在濃度比例適當處形成可見的沉淀線。（四）實驗步驟1．制板：制備1.5%生理鹽水瓊脂，趁熱吸取溶化的瓊脂3.5ml均勻傾注于載玻片上，使厚度3-4mm，自然冷卻。2．打孔：根據(jù)要求按模板打孔。一般多打成梅花形孔。挑出孔內(nèi)瓊脂，注意不要挑破孔緣并封底。3．加樣：每孔加樣10μl。4．擴散：將瓊脂板置于濕盒中,37℃擴散24－48h。注意事項：1、不要產(chǎn)生氣泡，以加滿為度。加少了，影響反應程度，加多了，易溢出，也影響反應結果。

2．用以檢測的抗血清的效價時，將抗原置中心孔，抗血清倍比稀釋后置周圍孔，以出