動(dòng)物組織基因組的提取課件

實(shí)驗(yàn)一、動(dòng)物組織基因組DNA提取實(shí)驗(yàn)一動(dòng)物基因組DNA的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握從動(dòng)物組織或細(xì)胞中提取核酸的原理和操作技術(shù)了解提取DNA的幾種方法，原理和優(yōu)缺點(diǎn)學(xué)習(xí)測(cè)定DNA含量和質(zhì)量的基本原理及方法二、實(shí)驗(yàn)原理1、核酸的分類DNA(脫氧核糖核酸)

主要存在于細(xì)胞核的染色體中。核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA），葉綠體DNA（cpDNA），質(zhì)粒DNA。RNA（核糖核酸）

存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA,rRNA,tRNA等。

除上述DNA，RNA外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA。分離純化核酸總的原則：2、核酸制備的一般原則核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求：①核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。①應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；②排除其它分子(蛋白，脂類，多糖類)的污染。核酸制備時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng):

①盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過程。②減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解。③減少物理因素對(duì)核酸的降解：機(jī)械剪切力和高溫④防止核酸的生物降解：排除核酸酶。

⑤排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時(shí)，應(yīng)去除RNA，反之亦然。降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對(duì)核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當(dāng)然，幾個(gè)條件并用更好。對(duì)于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機(jī)械張力拉斷則更重要。對(duì)于RNA，因分子較小，不易被機(jī)械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設(shè)法抑制RNase更重要。核酸酶的抑制和抑制劑DNase抑制

①加入少量金屬離子螯合劑，如0.01mol/LEDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。

②去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。常用的RNA酶抑制劑

焦磷酸二乙酯（DEPC）抑制強(qiáng)烈、不徹底

異硫氰酸胍有效抑制、分解核蛋白氧釩核糖核苷復(fù)合物有效抑制

RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）有效抑制其它：SDS、尿素、硅藻土等有效抑制作用：1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。3.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNase活性和破裂細(xì)胞的作用。

如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑3.核酸制備的一般步驟：破碎組織細(xì)胞提取純化I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中1）破碎細(xì)胞（防止核酸酶的作用）

微生物：溶菌酶、SDS裂解。

高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。

酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。

動(dòng)物：液氮處理后用勻漿器或者研缽破碎。

細(xì)胞器DNA：首先純化細(xì)胞器。以上處理時(shí)均要同時(shí)加入核酸酶抑制劑2）破碎抽提核酸除去雜質(zhì)首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分分離使核酸與蛋白質(zhì)分離除去脂類多糖的除去3）核酸的純化

根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點(diǎn)除去其它核酸污染,并除去提取過程中的系列試劑(鹽、有機(jī)溶劑等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。

4）核酸樣品的保存核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì)

溫度：

4℃樣品經(jīng)常使用-70℃是長(zhǎng)期保存的良好溫度，為一次性保存-20℃保存,避免反復(fù)凍融

保存介質(zhì)：

滅菌水

TE緩沖溶液(最常用)：

10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0三、動(dòng)物基因組DNA的提取（2）陰離子去污劑法:

用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性,可以直接從生物材料中提取DNA。由于細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,而陰離子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA。三、動(dòng)物基因組DNA的提?。?）苯酚抽提法:苯酚作為蛋白變性劑,同時(shí)抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時(shí),由于蛋白與DNA連接鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含DNA的水相。利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA。此法的特點(diǎn)是使提取的DNA保持天然狀態(tài)。1）樣品預(yù)處理取新鮮動(dòng)物組織25-50mg（組織量不宜過多，否則容易導(dǎo)致裂解不完全而堵塞離心柱），組織剪碎或者切成小塊，直接放入勻漿器中勻漿。2）加入600μl的LysisBuffer，顛倒充分混勻。如需消化RNA，可加入20μlRNaseA，顛倒混勻，室溫放置5min。3）加入10μlProteinaseK，混勻。56℃水浴45min-1h，其間顛倒混勻數(shù)次直到看到組織完全裂解，裂解完全的標(biāo)準(zhǔn)為液體變得清亮及粘稠。（此步驟可以過夜處理）2.操作步驟4）12,000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入800μl無水乙醇，混勻。5）將液體轉(zhuǎn)入離心柱（一次加不完，可分次轉(zhuǎn)入），12,000rpm離心1min，棄廢液。6）加入700μlWashbufferA（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm離心30s-1min，棄廢液。

7）加入700μlWashbufferB（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm離心30s-1min，棄廢液。稱取肝臟0.5g冰冷的生理鹽水清洗（3次）剪碎5ml生理鹽水勻漿各組取1/10組織細(xì)胞液移至1.5ml離心管加600ulLysisBuffer加20ulRNaseA顛倒混勻，放置5min加10ulProteinaseK混勻56℃水浴，45min顛倒混勻數(shù)次至液體變清亮及粘稠12000rpm，10min離心取上清轉(zhuǎn)入新離心管加800ul無水乙醇混勻轉(zhuǎn)入離心柱可分次轉(zhuǎn)入12000rpm，1min離心棄廢液，加入700ulWashbufferA12000rpm，1min離心棄廢液，加入700ulWashbufferB12000rpm，1min離心棄廢液，加入500ulWashbufferB12000rpm，1min離心棄廢液12000rpm，2min離心將離心柱置新離心管中，開離心柱蓋，放置5min柱膜中央加100ul65℃預(yù)熱的TEbuffer放置3min12000rpm，30sec離心取離心后所得溶液再加入離心柱中，放置2min12000rpm，2min離心收集離心后所得溶液，即為純化后基因組DNA3.注意事項(xiàng)——材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則會(huì)造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集3.注意事項(xiàng)——細(xì)胞裂解材料應(yīng)適量，過多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動(dòng)物組織－－勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞－－蛋白酶K細(xì)菌－－溶菌酶破壁高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩3.注意事項(xiàng)——核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解

組織勻漿液（裝入10ml離心管中）10ml

100mmol／LNaCl：0.2ml（5MNaCl）25mmol／LED