肺動脈高壓分子機(jī)制的研究進(jìn)展課件

肺動脈高壓分子機(jī)制的研究進(jìn)展

低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)

鈣離子濃度的影響及機(jī)制

Recentadvanceinmolecularmechanismofpulmonaryarterialhypertension

RoleofhypoxiaonintracellularCa2+concentrationinpulmonaryarterysmoothmusclecells(PASMCs)

JianWang(王健)JohnsHopkinsUniversity廣州醫(yī)學(xué)院

肺動脈高壓分子機(jī)制的研究進(jìn)展

低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌前言(Introduction)我國40歲以上人群COPD總患病率高達(dá)8.2%，大部分患者最終經(jīng)慢性低氧性肺動脈高壓（chronichypoxicpulmonaryhypertension,CHPH）而發(fā)展成為慢性肺源性心臟病。兩個(gè)環(huán)節(jié):肺血管急性低氧性收縮反應(yīng)和慢性低氧性肺血管結(jié)構(gòu)重建是CHPH發(fā)生的主要機(jī)制。前言(Introduction)我國40歲以上人群COP前言(Introduction)急性低氧導(dǎo)致包括大鼠、豬、狗、綿羊、雪貂、牛等多種動物肺動脈的強(qiáng)烈收縮，慢性低氧引起包括人類、大鼠及綿羊肺動脈的結(jié)構(gòu)重建。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度（[Ca2+]i）在引起肌細(xì)胞的收縮和增殖的復(fù)雜機(jī)制中起至關(guān)重要的作用。

前言(Introduction)急性低氧導(dǎo)致包括大鼠、豬VDCCROCCCa2+Ca2+Ca2+SOCCIP3RCa2+Ca2+ATPCa2+ATPCa2+Na+DAGOAGCPATGIP3Ca2+STIMSOCEVDCCROCCCa2+Ca2+Ca2+SOCCIP3RCa前言(Introduction)Storeoperatedcalciumchannel(SOCC)主要由經(jīng)典型瞬時(shí)受體電位（TRPC）蛋白家族成員組成,TRPC家族包括TRPC-1至TRPC-7。SOCE和TRPC蛋白在肺動脈平滑肌[Ca2+]i調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。前言(Introduction)Storeoperat前言急性低氧性肺動脈收縮時(shí)[Ca2+]i的增加部分是由于SOCE通過由TRPC組成的SOCC而造成。慢性低氧大鼠肺動脈平滑肌[Ca2+]i和SOCE增加，TRPC蛋白參與慢性低氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌[Ca2+]i升高。前言急性低氧性肺動脈收縮時(shí)[Ca2+]i的增加部分是由于SOCHPH急性低氧SOCE[Ca2+]i血管收縮？？PA肺循環(huán)外周阻力TRPCCa2+內(nèi)流[Ca2+]i血管重塑慢性低氧？？PA？CHPH急性低氧SOCE[Ca2+]i血管收縮？？PA肺循環(huán)研究目的(Aims)

以大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌、遠(yuǎn)端PASMCs及CHPH大鼠模型為研究對象，深入探討性低氧對大鼠遠(yuǎn)PASMC[Ca2+]i的影響及機(jī)制。研究目的(Aims)以大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌、遠(yuǎn)端PA急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的影響

Effectofacutehypoxiaoncalciumsinglinginpulmonaryarterialsmoothmusclecells急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的影響

Eff方法(Methods)酶消化法原代培養(yǎng)大鼠遠(yuǎn)端PASMCs形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)及功能鑒定PASMCs細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng)觀測急性低氧(4%O2)對大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i的影響方法(Methods)酶消化法原代培養(yǎng)大鼠遠(yuǎn)端PASMCsPhasecontrastmicroscopyofdistalPASMCsculturedfor3-6days.Cellsshowedspindle-shapedmorphology.Smoothmusclespecifica-actinantibodyidentifieda-actin(showninred)in>95%culturedcells.ThenuclearmarkerYO-PRO-1isshowningreen.ImmunocytochemistryRatDistalPASMCsMorphologyPhasecontrastmicroscopyofd高鉀KRBS溶液對大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i的影響及5μM硝苯地平的干預(yù)作用

-500501001502000510152025Time(min)Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+Nifed050100150200250Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+NifedAB＊§-500501001502000510152025Time(min)Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+Nifed050100150200250Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+NifedAB-500501001502000510152025Time(min)Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+Nifed-500501001502000510152025Time(min)Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+NifedcontrolKCLKCL+Nifed050100150200250Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+Nifed050100150200250Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+NifedcontrolKCLKCL+NifedAB＊§A：時(shí)間曲線，B：峰值。control組n=5,細(xì)胞數(shù)=138；KCL組n=6，細(xì)胞數(shù)=171；KCL+Nifed組n=5，細(xì)胞數(shù)=145。＊：P＜0.01vscontrol；§：P＜0.01vsKCL。高鉀KRBS溶液對大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i的影響及急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i的影響

4%O216%O2-200204060800102030timeΔ[Ca2+]i(nM)A0204060801004%O216%O2Δ[Ca2+]i(nM)＊B4%O216%O2-200204060800102030timeΔ[Ca2+]i(nM)4%O216%O24%O216%O24%O216%O2-20020406080-200204060800102030timeΔ[Ca2+]i(nM)A0204060801004%O216%O2Δ[Ca2+]i(nM)＊BA0204060801004%O216%O2Δ[Ca2+]i(nM)＊0204060801004%O216%O2Δ[Ca2+]i(nM)＊＊BA：時(shí)間曲線，B：峰值。4％O2組n=8，細(xì)胞數(shù)=166；16％O2組n=6，細(xì)胞數(shù)=133，＊：P＜0.001。急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i的影響4%O21小結(jié)1(Summary1)原代培養(yǎng)PASMCs是研究低氧造成肺動脈病理生理及病理改變的首要前提。在低氧及各種血管活性物質(zhì)刺激下，肺動脈發(fā)生的血管收縮反應(yīng)和結(jié)構(gòu)重建主要定位于肺內(nèi)遠(yuǎn)端肺動脈(肺內(nèi)4級分支以下的肺動脈)。培養(yǎng)細(xì)胞呈長梭形，表現(xiàn)典型的血管平滑肌細(xì)胞生長特點(diǎn)，即“峰谷”狀生長。60mM高鉀溶液使培養(yǎng)的PASMC[Ca2+]i增高，5μM硝苯地平能完全阻斷此反應(yīng)，說明培養(yǎng)的PASMC表達(dá)具有完好功能的VDCC通道。小結(jié)1(Summary1)原代培養(yǎng)PASMCs是研究低小結(jié)2Ca2+是重要的第二信使，調(diào)節(jié)細(xì)胞的許多生理過程，也包括肺血管平滑肌的急性收縮反應(yīng)和慢性增殖過程。無論外部各種因素調(diào)控肺血管平滑肌細(xì)胞收縮和增殖的機(jī)制如何復(fù)雜，最后都?xì)w結(jié)于各種因素對于肺血管平滑肌細(xì)胞[Ca2+]i的影響。小結(jié)2Ca2+是重要的第二信使，調(diào)節(jié)細(xì)胞的許多生理過程，也小結(jié)3急性低氧能使大鼠、羊、貓、人等肺動脈平滑肌細(xì)胞的[Ca2+]i升高。我們發(fā)現(xiàn)：急性低氧也能使大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i升高，提示急性低氧可能通過升高[Ca2+]i參與肺動脈平滑肌的急性低氧性收縮反應(yīng)。小結(jié)3急性低氧能使大鼠、羊、貓、人等肺動脈平滑肌細(xì)胞的[C小結(jié)急性低氧[Ca2+]i小結(jié)急性低氧[Ca2+]i二.急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度影響的機(jī)制二.急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度影響的機(jī)制方法PASMCPA正常SOCE的檢測急性低氧對SOCE的影響TRPC表達(dá)硝苯地平對急性低氧誘導(dǎo)PASMC[Ca2+]i升高的干預(yù)恢復(fù)細(xì)胞外鈣錳熒光焠滅SOCC拮抗劑干預(yù)熒光定量PCRWestern-blot[Ca2+]i檢測系統(tǒng)方法PASMCPA正常SOCE的檢測急性低氧對SOCE的5μM硝苯地平對急性低氧誘導(dǎo)大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i升高的影響

A：時(shí)間曲線，B：峰值。4％O2組n=7，細(xì)胞數(shù)=146；4％O2+Nifed組n=6，細(xì)胞數(shù)=128，＊：P＜0.0010204060801004%O24%O2+NifedΔ[Ca2+]i(nM)＊AB-200204060800102030time(min)Δ[Ca2+]i(nM)4%O24%O2+Nifed0204060801004%O24%O2+NifedΔ[Ca2+]i(nM)＊AB0204060801004%O24%O2+NifedΔ[Ca2+]i(nM)＊0204060801000204060801004%O24%O2+NifedΔ[Ca2+]i(nM)＊AB-200204060800102030time(min)Δ[Ca2+]i(nM)4%O24%O2+Nifed-200204060800102030time(min)Δ[Ca2+]i(nM)-200204060800102030time(min)Δ[Ca2+]i(nM)4%O24%O2+Nifed4%O24%O2+Nifed4%O24%O2+Nifed結(jié)果(Results)5μM硝苯地平對急性低氧誘導(dǎo)大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌組織及培養(yǎng)的PASMC’sTRPC的mRNA表達(dá)的PCR結(jié)果

大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌組織及培養(yǎng)的PASMC’sTRPC的大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌組織及培養(yǎng)的PASMC的TRPC1、TRPC4和TRPC6的Western結(jié)果

大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌組織及培養(yǎng)的PASMC的TRPC1、TR恢復(fù)細(xì)胞外鈣法檢測大鼠遠(yuǎn)端PASMC’sSOCE

A：時(shí)間曲線，B：峰值。Nifed+CPA組n=8，細(xì)胞數(shù)=239；Nifed組n=6，細(xì)胞數(shù)=168，＊：P＜0.001

SOCE恢復(fù)細(xì)胞外鈣法檢測大鼠遠(yuǎn)端PASMC’sSOCEA：時(shí)間錳熒光焠滅法檢測大鼠遠(yuǎn)端PASMC’sSOCE

A：時(shí)間曲線，B：峰值。+CPA組n=7，細(xì)胞數(shù)=177；-CPA組n=5，細(xì)胞數(shù)=137，＊：P＜0.001。錳熒光焠滅法檢測大鼠遠(yuǎn)端PASMC’sSOCEA：時(shí)間曲恢復(fù)細(xì)胞外鈣法觀測SKF-96365和NiCl2

分別對大鼠遠(yuǎn)端PASMC’sSOCE的影響

恢復(fù)細(xì)胞外鈣法觀測SKF-96365和NiCl2

分別對大鼠錳熒光焠滅法觀測SKF-96365和NiCl2

分別對大鼠遠(yuǎn)端PASMC’sSOCE的影響

錳熒光焠滅法觀測SKF-96365和NiCl2

分別對大鼠遠(yuǎn)SKF,Ni2+andLa3+對高鉀KRBS溶液誘導(dǎo)大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i升高的影響

SKF,Ni2+andLa3+對高鉀KRBS溶液誘導(dǎo)大急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC’SOCE的影響

急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC’SOCE的影響不存在CPA的情況下，急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC錳熒光焠滅的影響

A：時(shí)間曲線，B：峰值。16％O2（noMn2+）組n=5，細(xì)胞數(shù)=141；16％O2組n=5，細(xì)胞數(shù)=114，與16％O2（noMn2+

）組比較P＞0.4；4％O2組n=5，細(xì)胞數(shù)=136，與16％O2組比較P＜0.001。607080901001100510F/F0at360nM(%)4%O216%O216%O2(noMn2+)Time(min)Nifed+0Ca2+Mn2+(200μM)0-10-20-30-4016%O216%O24%O2Mn2+＊F/F0at360nM(%)AB607080901001100510F/F0at360nM(%)4%O216%O216%O2(noMn2+)4%O216%O216%O2(noMn2+)Time(min)Nifed+0Ca2+Nifed+0Ca2+Mn2+(200μM)Mn2+(200μM)0-10-20-30-4016%O216%O24%O2Mn2+＊0-10-20-30-4016%O216%O24%O2Mn2+＊F/F0at360nM(%)AB不存在CPA的情況下，急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC錳熒光焠滅存在CPA的情況下，急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC錳熒光焠滅的影響

A：時(shí)間曲線，B：峰值。16％O2組n=5，細(xì)胞數(shù)=119；4％O2組n=5，細(xì)胞數(shù)=112，＊：P＜0.001-30-40-50-60-7016%O24%O2F/F0at360nM(%)＊B405060708090100110051016%O24%O2F/F0at360nM(%)Mn2+(200μM)Nifed+CPA+0Ca2+A-30-40-50-60-7016%O24%O2-30-40-50-60-7016%O24%O2F/F0at360nM(%)＊B405060708090100110051016%O24%O216%O24%O2F/F0at360nM(%)Mn2+(200μM)Mn2+(200μM)Nifed+CPA+0Ca2+A存在CPA的情況下，急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC錳熒光焠滅的SKF-96365和NiCl2分別對急性低氧誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端PASMC’s

SOCE的影響

SKF-96365和NiCl2分別對急性低氧誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端急性低氧使大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i升高，而VDCC拮抗劑硝苯地平只能部分抑制急性低氧引起的PASMC[Ca2+]i升高,提示急性低氧通過激活大鼠遠(yuǎn)端PASMC的VDCC和另外的非VDCC依賴的通道導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而引起[Ca2+]i升高。SOCE在調(diào)解細(xì)胞內(nèi)鈣平衡發(fā)揮重要作用,廣泛存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、主動脈平滑肌細(xì)胞、肺動脈平滑肌細(xì)胞及肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞等。

小結(jié)1急性低氧使大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i升高，而VDCC拮我們運(yùn)用恢復(fù)細(xì)胞外鈣法和錳熒光焠滅法,發(fā)現(xiàn)CPA能使PASMCs中的[Ca2+]i迅速顯著升高，錳熒光焠滅增強(qiáng)，且能被SOCC拮抗劑顯著抑制，表明大鼠遠(yuǎn)端PASMC存在SOCE。TRPC蛋白參與組成SOCC，大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌主要表達(dá)TRPC-1、TRPC-4和TRPC-6，且尤其以TRPC-1和TRPC-6的蛋白表達(dá)最強(qiáng)。小結(jié)2我們運(yùn)用恢復(fù)細(xì)胞外鈣法和錳熒光焠滅法,發(fā)現(xiàn)CPA能使PASM用含有CPA和硝苯地平的無鈣溶液孵育PASMCs，急性低氧不僅能顯著增加由恢復(fù)細(xì)胞外鈣所引起的[Ca2+]i升高，而且能顯著增加錳熒光焠滅。以上兩種反應(yīng)均能被SOCC拮抗劑阻斷。急性低氧通過增強(qiáng)由SOCC介導(dǎo)的SOCE，進(jìn)而引起PASMC的[Ca2+]i升高。小結(jié)3用含有CPA和硝苯地平的無鈣溶液孵育PASMCs，急性低氧不用不含CPA但含硝苯地平的無鈣溶液孵育PASMCs，常氧時(shí)，錳熒光焠滅與細(xì)胞的熒光自發(fā)衰減量沒有差異，而在急性低氧時(shí)，錳熒光焠滅顯著增加，且此反應(yīng)能被SOCC拮抗劑顯著抑制，表明急性低氧能夠誘發(fā)SOCE。急性低氧時(shí)用含有CPA和硝苯地平的無鈣溶液孵育PASMC，錳熒光焠滅顯著增加，且能被SOCC拮抗劑顯著抑制，表明急性低氧能夠放大由CPA誘導(dǎo)的SOCE。急性低氧的這些作用可能由于低氧加速了Ca2+從肌漿網(wǎng)清空，也可能是由于低氧增強(qiáng)了與肌漿網(wǎng)鈣耗竭信號耦聯(lián)的SOCC的活性。小結(jié)4用不含CPA但含硝苯地平的無鈣溶液孵育PASMCs，常氧時(shí)，小結(jié)TRPC-1TRPC-4TRPC-6SOCE急性低氧[Ca2+]iSOCE小結(jié)TRPC-1TRPC-4TRPC-6SOCE急性低氧[C三.慢性低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的影響三.慢性低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的影響方法常壓持續(xù)低氧（10%O2）21天的方法建立CHPH大鼠模型，觀測MPAP、RVSP、RV/(LV+S)及肺血管形態(tài)學(xué)改變。分離正常大鼠和CHPH大鼠的遠(yuǎn)端PASMCs，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng)檢測正常大鼠和CHPH大鼠PASMCs[Ca2+]i。方法常壓持續(xù)低氧（10%O2）21天的方法建立CHPH大鼠模結(jié)果n=6，*:P﹤0.01MPAP（mmHg）PVSP（mmHg）RV/(LV+S)正常組10.8±0.6325.3±1.020.27±0.01低氧組26.5±0.84*54.6±1.87*0.56±0.04*慢性持續(xù)低氧對大鼠MPAP、RVSP及RV/(LV+S)的影響結(jié)果n=6，*:P﹤0.01MPAP（mmHg）PVSP（m慢性低氧對大鼠肺內(nèi)血管結(jié)構(gòu)重建的影響

A:低氧組，B:常氧組慢性低氧對大鼠肺內(nèi)血管結(jié)構(gòu)重建的影響A:低氧組，B:常慢性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i的影響

常氧組n=5，細(xì)胞數(shù)=112，低氧組n=5，細(xì)胞數(shù)=104，＊：P＜0.001

050100150200NormoxiaHypoxiaBasic[Ca2+]i(nM)＊050100150200NormoxiaHypoxiaBasic[Ca2+]i(nM)＊慢性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i的影響常氧組n=討論本實(shí)驗(yàn)以10%O2飼養(yǎng)大鼠3周，低氧大鼠MPAP﹑RVSP及RV/(LV+S)較正常大鼠明顯增高，肺內(nèi)血管較正常大鼠明顯增厚，提示慢性低氧通過直接或間接作用導(dǎo)致肺血管重構(gòu)，肺動脈壓升高，右心室肥大。常壓持續(xù)低氧能很好復(fù)制CHPH模型。慢性低氧能使大鼠遠(yuǎn)端PASMCs中[Ca2+]i的升高，提示慢性低氧誘導(dǎo)的[Ca2+]i升高參與慢性肺血管結(jié)構(gòu)重建。討論本實(shí)驗(yàn)以10%O2飼養(yǎng)大鼠3周，低氧大鼠MPAP﹑RVS小結(jié)慢性低氧[Ca2+]iCHPH小結(jié)慢性低氧[Ca2+]iCHPH四.慢性低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度影響的機(jī)制四.慢性低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度影響的機(jī)制方法10%O2或常氧3周PAPASMCTRPC表達(dá)熒光定量PCRWestern-blotCPA誘導(dǎo)OAG誘導(dǎo)恢復(fù)細(xì)胞外鈣錳熒光焠滅[Ca2+]i檢測系統(tǒng)方法10%O2或常氧3周PAPASMCTRPC表達(dá)熒光定結(jié)果TRPCgene&proteinexpression結(jié)果TRPCgene&proteinexpressi慢性低氧對CPA誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i變化的影響

慢性低氧對CPA誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i變慢性低氧對CPA誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端PASMC錳熒光焠滅的影響

BasalMn2+quenching(Ca2+entry)inPASMCs慢性低氧對CPA誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端PASMC錳熒光焠滅的影響B(tài)討論慢性低氧能上調(diào)肺動脈平滑肌TRPC1,TRPC6的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，但對TTRPC4的表達(dá)水平無影響。CHPH大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌TRPC1,-6表達(dá)上調(diào)，提示TRPC1,-6可能在慢性低氧誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌[Ca2+]i的改變中扮演重要角色。恢復(fù)細(xì)胞外鈣和錳熒光焠滅實(shí)驗(yàn)證實(shí)：慢性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMCs的SOCE并無影響，可能原因是慢性低氧對編碼SOCC通道的基因（TRPC4）的表達(dá)沒有影響。討論慢性低氧能上調(diào)肺動脈平滑肌TRPC1,TRPC6的mR討論TRPC1-6主要參與組成SOCC,ROCC，ROCC被DAG或OAG激活后導(dǎo)致細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流。恢復(fù)細(xì)胞外鈣和錳熒光焠滅實(shí)驗(yàn)證實(shí)：CHPH大鼠遠(yuǎn)端PASMCs由低氧誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流和錳熒光焠滅較常氧組增強(qiáng)，提示慢性低氧時(shí)經(jīng)由PASMC的SOCC,ROCC的Ca2+內(nèi)流增加，導(dǎo)致[Ca2+]i升高。慢性低氧時(shí)大鼠遠(yuǎn)端PASMC的[Ca2+]i升高主要是由于慢性低氧時(shí)TRPC1,-6蛋白表達(dá)上調(diào)、主要由TRPC1,-6蛋白組成的SOCCandROCC通道增加，進(jìn)而導(dǎo)致由Ca2+內(nèi)流增加。討論TRPC1-6主要參與組成SOCC,ROCC，ROC小結(jié)慢性低氧[Ca2+]iCa2+內(nèi)流TRPC1,-6小結(jié)慢性低氧[Ca2+]iCa2+內(nèi)流TRPC1,-6結(jié)論1、急性和慢性低氧都能使大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高。2、大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌主要表達(dá)TRPC-1、TRPC-4和TRPC-6，尤以TRPC-1和TRPC-6為主。3、急性低氧不僅自身能夠誘發(fā)大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞的SOCE，而且能夠放大SOCE，從而引起細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高。4、慢性低氧能上調(diào)大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌TRPC1，-6的表達(dá)，使主要由由TRPC1蛋白組成的SOCC增加,TRPC6蛋白組成的ROCC增加，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流增加，從而引起細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高。結(jié)論1、急性和慢性低氧都能使大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度致謝Prof.SylvesterandProf.Shimoda,Prof.Semenza(JohnsHopkinsUniversity)鐘南山教授,冉丕鑫教授(廣州醫(yī)學(xué)院)致謝Prof.SylvesterandProf.S

肺動脈高壓分子機(jī)制的研究進(jìn)展

低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)

鈣離子濃度的影響及機(jī)制

Recentadvanceinmolecularmechanismofpulmonaryarterialhypertension

RoleofhypoxiaonintracellularCa2+concentrationinpulmonaryarterysmoothmusclecells(PASMCs)

JianWang(王健)JohnsHopkinsUniversity廣州醫(yī)學(xué)院

肺動脈高壓分子機(jī)制的研究進(jìn)展

低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌前言(Introduction)我國40歲以上人群COPD總患病率高達(dá)8.2%，大部分患者最終經(jīng)慢性低氧性肺動脈高壓（chronichypoxicpulmonaryhypertension,CHPH）而發(fā)展成為慢性肺源性心臟病。兩個(gè)環(huán)節(jié):肺血管急性低氧性收縮反應(yīng)和慢性低氧性肺血管結(jié)構(gòu)重建是CHPH發(fā)生的主要機(jī)制。前言(Introduction)我國40歲以上人群COP前言(Introduction)急性低氧導(dǎo)致包括大鼠、豬、狗、綿羊、雪貂、牛等多種動物肺動脈的強(qiáng)烈收縮，慢性低氧引起包括人類、大鼠及綿羊肺動脈的結(jié)構(gòu)重建。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度（[Ca2+]i）在引起肌細(xì)胞的收縮和增殖的復(fù)雜機(jī)制中起至關(guān)重要的作用。

前言(Introduction)急性低氧導(dǎo)致包括大鼠、豬VDCCROCCCa2+Ca2+Ca2+SOCCIP3RCa2+Ca2+ATPCa2+ATPCa2+Na+DAGOAGCPATGIP3Ca2+STIMSOCEVDCCROCCCa2+Ca2+Ca2+SOCCIP3RCa前言(Introduction)Storeoperatedcalciumchannel(SOCC)主要由經(jīng)典型瞬時(shí)受體電位（TRPC）蛋白家族成員組成,TRPC家族包括TRPC-1至TRPC-7。SOCE和TRPC蛋白在肺動脈平滑肌[Ca2+]i調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。前言(Introduction)Storeoperat前言急性低氧性肺動脈收縮時(shí)[Ca2+]i的增加部分是由于SOCE通過由TRPC組成的SOCC而造成。慢性低氧大鼠肺動脈平滑肌[Ca2+]i和SOCE增加，TRPC蛋白參與慢性低氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌[Ca2+]i升高。前言急性低氧性肺動脈收縮時(shí)[Ca2+]i的增加部分是由于SOCHPH急性低氧SOCE[Ca2+]i血管收縮？？PA肺循環(huán)外周阻力TRPCCa2+內(nèi)流[Ca2+]i血管重塑慢性低氧？？PA？CHPH急性低氧SOCE[Ca2+]i血管收縮？？PA肺循環(huán)研究目的(Aims)

以大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌、遠(yuǎn)端PASMCs及CHPH大鼠模型為研究對象，深入探討性低氧對大鼠遠(yuǎn)PASMC[Ca2+]i的影響及機(jī)制。研究目的(Aims)以大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌、遠(yuǎn)端PA急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的影響

Effectofacutehypoxiaoncalciumsinglinginpulmonaryarterialsmoothmusclecells急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的影響

Eff方法(Methods)酶消化法原代培養(yǎng)大鼠遠(yuǎn)端PASMCs形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)及功能鑒定PASMCs細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng)觀測急性低氧(4%O2)對大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i的影響方法(Methods)酶消化法原代培養(yǎng)大鼠遠(yuǎn)端PASMCsPhasecontrastmicroscopyofdistalPASMCsculturedfor3-6days.Cellsshowedspindle-shapedmorphology.Smoothmusclespecifica-actinantibodyidentifieda-actin(showninred)in>95%culturedcells.ThenuclearmarkerYO-PRO-1isshowningreen.ImmunocytochemistryRatDistalPASMCsMorphologyPhasecontrastmicroscopyofd高鉀KRBS溶液對大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i的影響及5μM硝苯地平的干預(yù)作用

-500501001502000510152025Time(min)Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+Nifed050100150200250Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+NifedAB＊§-500501001502000510152025Time(min)Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+Nifed050100150200250Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+NifedAB-500501001502000510152025Time(min)Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+Nifed-500501001502000510152025Time(min)Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+NifedcontrolKCLKCL+Nifed050100150200250Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+Nifed050100150200250Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+NifedcontrolKCLKCL+NifedAB＊§A：時(shí)間曲線，B：峰值。control組n=5,細(xì)胞數(shù)=138；KCL組n=6，細(xì)胞數(shù)=171；KCL+Nifed組n=5，細(xì)胞數(shù)=145。＊：P＜0.01vscontrol；§：P＜0.01vsKCL。高鉀KRBS溶液對大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i的影響及急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i的影響

4%O216%O2-200204060800102030timeΔ[Ca2+]i(nM)A0204060801004%O216%O2Δ[Ca2+]i(nM)＊B4%O216%O2-200204060800102030timeΔ[Ca2+]i(nM)4%O216%O24%O216%O24%O216%O2-20020406080-200204060800102030timeΔ[Ca2+]i(nM)A0204060801004%O216%O2Δ[Ca2+]i(nM)＊BA0204060801004%O216%O2Δ[Ca2+]i(nM)＊0204060801004%O216%O2Δ[Ca2+]i(nM)＊＊BA：時(shí)間曲線，B：峰值。4％O2組n=8，細(xì)胞數(shù)=166；16％O2組n=6，細(xì)胞數(shù)=133，＊：P＜0.001。急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i的影響4%O21小結(jié)1(Summary1)原代培養(yǎng)PASMCs是研究低氧造成肺動脈病理生理及病理改變的首要前提。在低氧及各種血管活性物質(zhì)刺激下，肺動脈發(fā)生的血管收縮反應(yīng)和結(jié)構(gòu)重建主要定位于肺內(nèi)遠(yuǎn)端肺動脈(肺內(nèi)4級分支以下的肺動脈)。培養(yǎng)細(xì)胞呈長梭形，表現(xiàn)典型的血管平滑肌細(xì)胞生長特點(diǎn)，即“峰谷”狀生長。60mM高鉀溶液使培養(yǎng)的PASMC[Ca2+]i增高，5μM硝苯地平能完全阻斷此反應(yīng)，說明培養(yǎng)的PASMC表達(dá)具有完好功能的VDCC通道。小結(jié)1(Summary1)原代培養(yǎng)PASMCs是研究低小結(jié)2Ca2+是重要的第二信使，調(diào)節(jié)細(xì)胞的許多生理過程，也包括肺血管平滑肌的急性收縮反應(yīng)和慢性增殖過程。無論外部各種因素調(diào)控肺血管平滑肌細(xì)胞收縮和增殖的機(jī)制如何復(fù)雜，最后都?xì)w結(jié)于各種因素對于肺血管平滑肌細(xì)胞[Ca2+]i的影響。小結(jié)2Ca2+是重要的第二信使，調(diào)節(jié)細(xì)胞的許多生理過程，也小結(jié)3急性低氧能使大鼠、羊、貓、人等肺動脈平滑肌細(xì)胞的[Ca2+]i升高。我們發(fā)現(xiàn)：急性低氧也能使大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i升高，提示急性低氧可能通過升高[Ca2+]i參與肺動脈平滑肌的急性低氧性收縮反應(yīng)。小結(jié)3急性低氧能使大鼠、羊、貓、人等肺動脈平滑肌細(xì)胞的[C小結(jié)急性低氧[Ca2+]i小結(jié)急性低氧[Ca2+]i二.急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度影響的機(jī)制二.急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度影響的機(jī)制方法PASMCPA正常SOCE的檢測急性低氧對SOCE的影響TRPC表達(dá)硝苯地平對急性低氧誘導(dǎo)PASMC[Ca2+]i升高的干預(yù)恢復(fù)細(xì)胞外鈣錳熒光焠滅SOCC拮抗劑干預(yù)熒光定量PCRWestern-blot[Ca2+]i檢測系統(tǒng)方法PASMCPA正常SOCE的檢測急性低氧對SOCE的5μM硝苯地平對急性低氧誘導(dǎo)大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i升高的影響

A：時(shí)間曲線，B：峰值。4％O2組n=7，細(xì)胞數(shù)=146；4％O2+Nifed組n=6，細(xì)胞數(shù)=128，＊：P＜0.0010204060801004%O24%O2+NifedΔ[Ca2+]i(nM)＊AB-200204060800102030time(min)Δ[Ca2+]i(nM)4%O24%O2+Nifed0204060801004%O24%O2+NifedΔ[Ca2+]i(nM)＊AB0204060801004%O24%O2+NifedΔ[Ca2+]i(nM)＊0204060801000204060801004%O24%O2+NifedΔ[Ca2+]i(nM)＊AB-200204060800102030time(min)Δ[Ca2+]i(nM)4%O24%O2+Nifed-200204060800102030time(min)Δ[Ca2+]i(nM)-200204060800102030time(min)Δ[Ca2+]i(nM)4%O24%O2+Nifed4%O24%O2+Nifed4%O24%O2+Nifed結(jié)果(Results)5μM硝苯地平對急性低氧誘導(dǎo)大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌組織及培養(yǎng)的PASMC’sTRPC的mRNA表達(dá)的PCR結(jié)果

大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌組織及培養(yǎng)的PASMC’sTRPC的大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌組織及培養(yǎng)的PASMC的TRPC1、TRPC4和TRPC6的Western結(jié)果

大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌組織及培養(yǎng)的PASMC的TRPC1、TR恢復(fù)細(xì)胞外鈣法檢測大鼠遠(yuǎn)端PASMC’sSOCE

A：時(shí)間曲線，B：峰值。Nifed+CPA組n=8，細(xì)胞數(shù)=239；Nifed組n=6，細(xì)胞數(shù)=168，＊：P＜0.001

SOCE恢復(fù)細(xì)胞外鈣法檢測大鼠遠(yuǎn)端PASMC’sSOCEA：時(shí)間錳熒光焠滅法檢測大鼠遠(yuǎn)端PASMC’sSOCE

A：時(shí)間曲線，B：峰值。+CPA組n=7，細(xì)胞數(shù)=177；-CPA組n=5，細(xì)胞數(shù)=137，＊：P＜0.001。錳熒光焠滅法檢測大鼠遠(yuǎn)端PASMC’sSOCEA：時(shí)間曲恢復(fù)細(xì)胞外鈣法觀測SKF-96365和NiCl2

分別對大鼠遠(yuǎn)端PASMC’sSOCE的影響

恢復(fù)細(xì)胞外鈣法觀測SKF-96365和NiCl2

分別對大鼠錳熒光焠滅法觀測SKF-96365和NiCl2

分別對大鼠遠(yuǎn)端PASMC’sSOCE的影響

錳熒光焠滅法觀測SKF-96365和NiCl2

分別對大鼠遠(yuǎn)SKF,Ni2+andLa3+對高鉀KRBS溶液誘導(dǎo)大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i升高的影響

SKF,Ni2+andLa3+對高鉀KRBS溶液誘導(dǎo)大急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC’SOCE的影響

急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC’SOCE的影響不存在CPA的情況下，急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC錳熒光焠滅的影響

A：時(shí)間曲線，B：峰值。16％O2（noMn2+）組n=5，細(xì)胞數(shù)=141；16％O2組n=5，細(xì)胞數(shù)=114，與16％O2（noMn2+

）組比較P＞0.4；4％O2組n=5，細(xì)胞數(shù)=136，與16％O2組比較P＜0.001。607080901001100510F/F0at360nM(%)4%O216%O216%O2(noMn2+)Time(min)Nifed+0Ca2+Mn2+(200μM)0-10-20-30-4016%O216%O24%O2Mn2+＊F/F0at360nM(%)AB607080901001100510F/F0at360nM(%)4%O216%O216%O2(noMn2+)4%O216%O216%O2(noMn2+)Time(min)Nifed+0Ca2+Nifed+0Ca2+Mn2+(200μM)Mn2+(200μM)0-10-20-30-4016%O216%O24%O2Mn2+＊0-10-20-30-4016%O216%O24%O2Mn2+＊F/F0at360nM(%)AB不存在CPA的情況下，急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC錳熒光焠滅存在CPA的情況下，急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC錳熒光焠滅的影響

A：時(shí)間曲線，B：峰值。16％O2組n=5，細(xì)胞數(shù)=119；4％O2組n=5，細(xì)胞數(shù)=112，＊：P＜0.001-30-40-50-60-7016%O24%O2F/F0at360nM(%)＊B405060708090100110051016%O24%O2F/F0at360nM(%)Mn2+(200μM)Nifed+CPA+0Ca2+A-30-40-50-60-7016%O24%O2-30-40-50-60-7016%O24%O2F/F0at360nM(%)＊B405060708090100110051016%O24%O216%O24%O2F/F0at360nM(%)Mn2+(200μM)Mn2+(200μM)Nifed+CPA+0Ca2+A存在CPA的情況下，急性低氧對大鼠遠(yuǎn)端PASMC錳熒光焠滅的SKF-96365和NiCl2分別對急性低氧誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端PASMC’s

SOCE的影響

SKF-96365和NiCl2分別對急性低氧誘導(dǎo)的大鼠遠(yuǎn)端急性低氧使大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i升高，而VDCC拮抗劑硝苯地平只能部分抑制急性低氧引起的PASMC[Ca2+]i升高,提示急性低氧通過激活大鼠遠(yuǎn)端PASMC的VDCC和另外的非VDCC依賴的通道導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而引起[Ca2+]i升高。SOCE在調(diào)解細(xì)胞內(nèi)鈣平衡發(fā)揮重要作用,廣泛存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、主動脈平滑肌細(xì)胞、肺動脈平滑肌細(xì)胞及肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞等。

小結(jié)1急性低氧使大鼠遠(yuǎn)端PASMC[Ca2+]i升高，而VDCC拮我們運(yùn)用恢復(fù)細(xì)胞外鈣法和錳熒光焠滅法,發(fā)現(xiàn)CPA能使PASMCs中的[Ca2+]i迅速顯著升高，錳熒光焠滅增強(qiáng)，且能被SOCC拮抗劑顯著抑制，表明大鼠遠(yuǎn)端PASMC存在SOCE。TRPC蛋白參與組成SOCC，大鼠遠(yuǎn)端肺靜脈平滑肌主要表達(dá)TRPC-1、TRPC-4和TRPC-6，且尤其以TRPC-1和TRPC-6的蛋白表達(dá)最強(qiáng)。小結(jié)2我們運(yùn)用恢復(fù)細(xì)胞外鈣法和錳熒光焠滅法,發(fā)現(xiàn)CPA能使PASM用含有CPA和硝苯地平的無鈣溶液孵育PASMCs，急性低氧不僅能顯著增加由恢復(fù)細(xì)胞外鈣所引起的[Ca2+]i升高，而且能顯著增加錳熒光焠滅。以上兩種反應(yīng)均能被SOCC拮抗劑阻斷。急性低氧通過增強(qiáng)由SOCC介導(dǎo)的SOCE，進(jìn)而引起PASMC的[Ca2+]i升高。小結(jié)3用含有CPA和硝苯地平的無鈣溶液孵育PASMCs，急性低氧不用不含CPA但含硝苯地平的無鈣溶液孵育PASMCs，常氧時(shí)，錳熒光焠滅與細(xì)胞的熒光自發(fā)衰減量沒有差異，而在急性低氧時(shí)，錳熒光焠滅顯著增加，且此反應(yīng)能被SOCC拮抗劑顯著抑制，表明急性低氧能夠誘發(fā)SOCE。急性低氧時(shí)用含有CPA和硝苯地平的無鈣溶液孵育PASMC，錳熒光焠滅顯著增加，且能被SOCC拮抗劑顯著抑制，表明急性低氧能夠放大由CPA誘導(dǎo)的SOCE。急性低氧的這些作用可能由于低氧加速了Ca2+從肌漿網(wǎng)清空，也可能是由于低氧增強(qiáng)了與肌漿網(wǎng)鈣耗竭信號耦聯(lián)的SOCC的活性。小結(jié)4用不含CPA但含硝苯地平的無鈣溶液孵育PASMCs，常氧時(shí)，小結(jié)TRPC-1TRPC-4TRPC-6SOCE急性低氧[Ca2+]iSOCE小結(jié)TRPC-1TRPC-4TRPC-6SOCE急性低氧[C三.慢性低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的影響三.慢性低氧對大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的影響方法常壓持續(xù)低氧（10%O2）21天的方法建立CHPH大鼠模型，觀測MPAP、RVSP、RV/(LV+S)及肺血管形態(tài)學(xué)改變。分離正常大鼠和CHPH大鼠的遠(yuǎn)端PASMCs，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng)檢測正常大鼠和CHPH大鼠PASMCs[Ca2+]i。方法常壓持續(xù)低氧（10%O2）21天的方法建立CHPH大鼠模結(jié)果n=6，*:P﹤0.01MPAP（mmHg）PVSP（mmHg）RV/(LV+S)正常組10.8±0.6325.3±1.020.27±0.01低氧組26.5±0.84*54.6±1