水產(chǎn)品獸藥殘留檢測技術(shù)課件

樣品處理方法涉及的因素很多，操作復(fù)雜，方法靈活，直接影響各項分析指標(biāo)、成本和效率，一般占70%的分析工作量。水產(chǎn)品獸藥殘留檢測樣品前處理技術(shù)乙腈，甲醇，丙酮與樣品容易結(jié)合，溶劑化作用和滲透能力強，粘度小，提取速度快，能使結(jié)合態(tài)的藥物釋放，提取的同時脫蛋白脫脂，PH值可調(diào)，待測物分布均勻。但提取的雜質(zhì)較多，進(jìn)一步萃取乳化嚴(yán)重，效果相似，甲醇提取液的雜質(zhì)最高?！叭f能溶劑”DMSO沸點高極少用。在酯溶性的殘留物中，采用非水溶性極性溶劑，乙酸乙酯，氯仿，二氯甲烷，乙醚。加無水硫酸鈉，鹽析提高回收率。干樣（含水小10%）加水增強提取。

1、提取溶劑的選擇

超臨界流體密度與液體相似，但是溶質(zhì)在其中的擴(kuò)散系數(shù)比液體中大得多。極性低的碳?xì)浠衔铮?，酯，環(huán)氧化合物，可以在低壓力下提?。?-10MPa）進(jìn)行萃取，羥基，羧基難萃取，一個羧基和兩個羥基的化合物和三個酚羥基的苯環(huán)衍生物可以被萃取；40MPa以下，糖和氨基酸都不能被萃取；分級極性差異和揮發(fā)性差異。2、提取方法

水產(chǎn)品獸藥殘留檢測樣品前處理技術(shù)

超臨界流體萃取儀—流體源，加壓裝置，控溫裝置，萃取容器，節(jié)流裝置，收集裝置。CO2作為流體操作溫度低，利于熱不穩(wěn)定的化合物，組分中不含氧，防止氧化。2、提取方法

水產(chǎn)品獸藥殘留檢測樣品前處理技術(shù)液-液萃取LLELLE利用待測組分與樣品雜質(zhì)在互不相溶的兩相中溶解性差異進(jìn)行凈化。設(shè)計的基礎(chǔ)為：極性組分與非極性組分；極性物質(zhì)再分成酸性，中性，堿性物質(zhì)。正己烷（石油醚）-乙腈；正己烷-甲醇；正己烷-丙酮；異辛烷-80%丙酮；氯仿-水；乙酸乙酯-水。影響因素：溶劑，PH值（磺胺，喹諾酮，苯并米唑類，苯乙胺類等）3、凈化方法水產(chǎn)品獸藥殘留檢測樣品前處理技術(shù)液-液萃取操作方法分液漏斗震蕩，漩渦萃取，逆流萃取，特殊容器萃取。從水相中提取藥物時溶劑中常帶如少量的水分，可干擾固相萃取，延長濃縮時間和增加雜質(zhì)，加無水硫酸鈉脫水。高極性的藥物在凈化中發(fā)生吸附，硅烷化玻璃器皿（1%三甲基氯硅烷的甲苯溶液淌一次，100℃下干燥30min）；加異丙醇或二乙胺也能降低吸附。3、凈化方法水產(chǎn)品獸藥殘留檢測樣品前處理技術(shù)固相萃?。⊿PE）采用固相萃取小柱作為分離媒介，小柱中添加了不同填料的固定相，以鍵合硅膠為基質(zhì)的C18、NH2、COOH、PSA、SAX等，是硅膠的表面活性大為降低，最大程度的降低了極性化合物的不可吸附和拖尾，使樣品回收率和重現(xiàn)性得到保障；以高分子聚合物為基質(zhì)的如PEP、HXN、PAX、PCX等，具有高純度、高比表面的特點；以吸附型填料為固定相的如硅酸鎂、氧化鋁等，主要通過表面的極性吸附達(dá)到分離的目的。因此，固相萃取法適用于各種極性的化合物

3、凈化方法水產(chǎn)品獸藥殘留檢測樣品前處理技術(shù)固相萃?。⊿PE）操作步驟：活化，上樣，洗滌，洗脫。其他方法固相微萃?。汗桃何狡胶庵苽渖V法：制備HPLC分析激素殘留凝膠滲透色譜法：分子篩作用膜分離技術(shù)：硝酸纖維，醋酸纖維等半透膜基質(zhì)固相分散技術(shù)：樣品和填料的比例是1：4免疫親和色譜：連接有抗體的惰性基質(zhì)做固定相，選擇性吸附。分子印跡技術(shù)：印跡聚合物，塑料抗體

3、凈化方法水產(chǎn)品獸藥殘留檢測樣品前處理技術(shù)

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)：溶劑可回收氣流吹蒸：少量溶劑K-D濃縮器：濃縮，回流，洗滌，定容真空離心：熱敏性組分，粘稠液體再溶解使用流動相的初始比例作溶劑4、濃縮富集及再溶解水產(chǎn)品獸藥殘留檢測樣品前處理技術(shù)文獻(xiàn)檢索：了解化合物的性質(zhì)包括化合物的結(jié)構(gòu)、化合物的極性及化合物的pKa值。首先了解化合物的結(jié)構(gòu)，可大概的推斷其碎片離子的斷裂方式，選擇較為穩(wěn)定的碎片離子作為定量的子離子，也可以根據(jù)經(jīng)驗判斷選用哪種離子源更為合適；根據(jù)化合物的極性大小，可以選擇一種或幾種恰當(dāng)?shù)娜軇┳鳛槿苊?，既能保證完全將樣品溶解，又能提高化合物的質(zhì)譜響應(yīng)；化合物的pKa值，有助于選擇流動相的添加劑及其pH值，從而提高質(zhì)譜響應(yīng)。

建立液質(zhì)定量分析方法1.連接管路2.選擇Q1MS掃描模式和FullScan掃描類型3.設(shè)置離子源參數(shù)4.將流動相導(dǎo)入質(zhì)譜儀，觀察到待測化合物的準(zhǔn)分子離子峰峰強度在10的6次方左右。1、確立質(zhì)譜條件（化合物優(yōu)化）建立液質(zhì)定量分析方法5.選擇MSOnly優(yōu)化模式和SyringePumpInfusion入口類型選項6.優(yōu)化TubeLensOffset、SprayVoltage、SheathGasPressure、AuxGasPressure獲得待測化合物穩(wěn)定的準(zhǔn)分子離子峰。7.選擇MS+MS/MS優(yōu)化模式設(shè)置ParentMass、ChargeState和NumProduct對子離子進(jìn)行優(yōu)化。8.MRM優(yōu)化模式優(yōu)化TubeLensOffset和CollisionPressure9.記錄并保存子離子全掃描質(zhì)譜圖。保存TuneMethod文件。

1、確立質(zhì)譜條件（化合物優(yōu)化）建立液質(zhì)定量分析方法1、確立質(zhì)譜條件（化合物優(yōu)化）建立液質(zhì)定量分析方法1、確立質(zhì)譜條件（化合物優(yōu)化）建立液質(zhì)定量分析方法2、確立LC條件由于生物樣品中含有大量的基質(zhì)，這些基質(zhì)的存在會嚴(yán)重的干擾和影響化合物的測定，因而我們需要利用色譜將化合物與基質(zhì)分開，從而降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，即降低離子抑制。待測化合物要在色譜柱上有保留，并且適當(dāng)延長保留時間。三聚氰胺最好用離子柱。建立液質(zhì)定量分析方法3、內(nèi)標(biāo)選擇內(nèi)標(biāo)工作方式：在每個樣品、標(biāo)準(zhǔn)和空白中加入測定到每個樣品中內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)根據(jù)實際測定內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值與預(yù)期內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的比值來校正其他化合物的信號用分析信號和內(nèi)標(biāo)的比作標(biāo)準(zhǔn)曲線或乘校正因子或除內(nèi)標(biāo)回收率計算未知樣品的分析信號和內(nèi)標(biāo)的比值并從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出信號建立液質(zhì)定量分析方法3、內(nèi)標(biāo)選擇1.樣品中不存在或者可以忽略2.沒有受到質(zhì)譜干擾3.沒有對分析對象產(chǎn)生質(zhì)譜干擾4.不容易受到環(huán)境污染5.和分析對象質(zhì)量數(shù)接近（氘代物）6.離解方式和分析對象接近建立液質(zhì)定量分析方法能力驗證經(jīng)驗及基質(zhì)效應(yīng)為什么要采用LC-MS考核化合物的含量越來越低基體越來越復(fù)雜藥殘的能力驗證建議的第一方法例如：干魚粉中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星魚肉中的氟苯尼考能力驗證經(jīng)驗及基質(zhì)效應(yīng)

考核中的質(zhì)量控制方法控制樣品空白平行雙樣測定或三樣加標(biāo)回收標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)的同步分析重復(fù)測定和儀器比對能力驗證經(jīng)驗及基質(zhì)效應(yīng)加標(biāo)回收：可分為前處理加標(biāo)回收和上機(jī)加標(biāo)（單點標(biāo)準(zhǔn)加入）能力驗證經(jīng)驗及基質(zhì)效應(yīng)加標(biāo)回收：可分為前處理加標(biāo)回收和上機(jī)加標(biāo)（單點標(biāo)準(zhǔn)加入）加標(biāo)回收接近100％不能代表考核結(jié)果完全準(zhǔn)確無誤。不能檢查標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身所帶來的誤差；不能檢查加和性干擾，如污染和質(zhì)譜干擾；能力驗證經(jīng)驗及基質(zhì)效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)的同步分析：選擇基體和濃度相似的標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)同步進(jìn)行分析作用：標(biāo)準(zhǔn)是否合格樣品前處理是否合適測定中是否存在干擾目前藥殘的標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)很難購買，對于固體的國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，即使不能購得，也要盡量收集到證書。能力驗證經(jīng)驗及基質(zhì)效應(yīng)其他質(zhì)控方法不同儀器的比對實驗不同儀器在一定程度可考察基體和質(zhì)譜的干擾狀況重復(fù)分析和人員比對實驗盡量消除過失誤差和隨機(jī)誤差以上的質(zhì)量控制方法在考核中應(yīng)盡量多采用能力驗證經(jīng)驗及基質(zhì)效應(yīng)考核前準(zhǔn)備確認(rèn)色譜柱柱效各流動相充足清洗錐口重新調(diào)諧校正儀器總之就是使儀器處于良好狀態(tài)能力驗證經(jīng)驗及基質(zhì)效應(yīng)預(yù)試驗稀釋到一定(或要求)的倍數(shù)后測定稀釋成多種稀釋倍數(shù)有利于多項目的測定使?jié)舛仍跇?biāo)準(zhǔn)曲線的中間點有利于發(fā)現(xiàn)干擾有利于防止污染能力驗證經(jīng)驗及基質(zhì)效應(yīng)定容要考慮溶劑的匹配。測定每個樣品測定23次，同時分析標(biāo)準(zhǔn)參加物質(zhì)并分析加標(biāo)樣品。數(shù)據(jù)處理查看校準(zhǔn)曲線是否符合要求確定是不同質(zhì)量數(shù)測定結(jié)果是否相同盡量不同超過標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，如超過應(yīng)稀釋后測定。能力驗證經(jīng)驗及基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)成因待測組分與基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)共洗脫而引起的色譜柱超載所致，這些成分常因在色譜分析中與目標(biāo)化合物分離不完全或未被檢測到而進(jìn)入質(zhì)譜后產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。待測組分與生物樣品中的基質(zhì)成分在霧滴表面離子化過程中的競爭。由于基質(zhì)中某些干擾組分的存在會使待測組分離子生成的速度同標(biāo)準(zhǔn)樣品相比有顯著不同，使得信號響應(yīng)值產(chǎn)生較大變異。離子的有效淌度受到周圍離子的影響，由其周圍離子所形成的包圍圈，稱為離子基體。如果樣品組分從進(jìn)樣點到探測點遷移過程中，在某一時間間隔遇上一個不同組成的基體區(qū)帶，這個離子基體區(qū)帶就將對樣品組分產(chǎn)生影響，使它們的淌度發(fā)生瞬時變化，從而選擇性地影響溶質(zhì)的遷移和分離，這就是瞬時離子基體效應(yīng)。分為離子抑制和離子增強

能力驗證經(jīng)驗及基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)的評價：1.用流動相配制高中低三個濃度的待測物，并加入內(nèi)標(biāo)，測得響應(yīng)值。2.空白基質(zhì)提取后加入相同濃度的待測物和內(nèi)標(biāo)，測響應(yīng)值。

基質(zhì)效應(yīng)=空白基質(zhì)響應(yīng)值/流動相響應(yīng)值×100％

這樣不同濃度的待測物的基質(zhì)效應(yīng)和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)均可得到。

能力驗證經(jīng)驗及基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)消除方法1.選擇合適的樣品制備方法，對于不同的樣品制備方法，不能簡單地說某種方法優(yōu)于另一種方法，每種組分對基質(zhì)效應(yīng)的敏感度不同，其適宜采用的樣品制備方法也不同，要通過實驗來確定。2.改善色譜分析條件：采用反相色譜分離，適當(dāng)?shù)卦黾哟郎y組分的保留時間；減少進(jìn)樣體積；3.優(yōu)化質(zhì)譜分析條件，源的選擇4.選擇內(nèi)標(biāo)。

5.基質(zhì)匹配定量儀器維護(hù)一、LC泵：使用buffer后的清洗。2、泵120L流動相（或滲漏）時更換活塞密封圈，清洗液從部件中滲漏更換活塞。3、流速不對，或RT不穩(wěn)時更換washseal，柱壓過高時更換linefilterfrit，流速不穩(wěn)或有氣泡時更換流動相瓶中的filter，drainvalve滲出溶劑時更換更換drainvalveO-ring4、泵不能啟動時更換保險絲儀器維護(hù)二、自動進(jìn)樣器：1、檢查管路及連接處（查漏），跑一針標(biāo)準(zhǔn)品。2、更換轉(zhuǎn)子密封圈，更換theflushsolventinletf