瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)課件

哺乳動(dòng)物基因組DNA的提取實(shí)驗(yàn)一儲(chǔ)備液的制備實(shí)驗(yàn)二破碎細(xì)胞實(shí)驗(yàn)三分離、純化DNA實(shí)驗(yàn)四瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》哺乳動(dòng)物基因組DNA的提取實(shí)驗(yàn)一儲(chǔ)備液的制備12/1/1一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)了解并掌握提取動(dòng)物基因組DNA的原理和步驟。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)熟練掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。熟練掌握分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中各種儀器的使用方法及試劑的配制方法。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)了解并掌握提取動(dòng)物基因組DNA的原理和2二、實(shí)驗(yàn)原理

天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取DNA時(shí)，先把DNP抽提出來(lái)，再把P除去，再除去細(xì)胞中的糖，RNA及無(wú)機(jī)離子等。在EDTA和SDS等去污劑存在下，用蛋白酶K消化細(xì)胞，隨后用酚抽提，可以得到哺乳動(dòng)物基因組DNA。用此方法得到的DNA大小為100-150kb，適用于λ噬菌體構(gòu)建基因組文庫(kù)和Southern分析。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》二、實(shí)驗(yàn)原理天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形3三、儀器、材料和試劑（一）儀器高速冷凍離心機(jī)、微量取樣器、玻璃勻漿器、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)：電泳儀、水平電泳槽、紫外透射儀（或凝膠成像分析系統(tǒng)）、恒溫水浴器、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、超低溫冰箱、電子天平、酸度計(jì)12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》三、儀器、材料和試劑（一）儀器12/1/20222003級(jí)4（二）實(shí)驗(yàn)材料、用具、藥品1.鼠肝或兔肝2.1.5mL微量離心管、微孔過(guò)濾器、20mL注射器、各種型號(hào)的吸頭3.三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、醋酸鈉（NaAc）、平衡酚、氯仿、異戊醇、乙醇、瓊脂糖、蛋白酶K、RNA酶、DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物、硼酸、溴酚藍(lán)、蔗糖溴化乙錠（危險(xiǎn)）12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（二）實(shí)驗(yàn)材料、用具、藥品1.鼠肝或兔肝12/1/202225（三）試劑

1.5mol／LNaCl2.0.5mol／LTris.HClpH8.03.0.5mol／LEDTApH8.04.3mol／LNaAcpH5.25.dddH2O6.生理鹽水（0.85％NaCl）以上均高壓滅菌12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（三）試劑1.5mol／LNaCl12/1/67.10mg／mL蛋白酶K配好后用一次性過(guò)濾器過(guò)濾，-20℃保存；8.10mg／mL無(wú)DNA酶的RNA酶配好后用一次性過(guò)濾器過(guò)濾，-20℃保存；9.組織勻漿液10.酶解液11.提取液1：平衡酚(pH8.0)：氯仿：異戊醇＝25：24：112.提取液2：氯仿：異戊醇＝24：113.5×TBE14.TE緩沖液15.6×凝膠加樣緩沖液12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》7.10mg／mL蛋白酶K配好后用一次性過(guò)濾器過(guò)濾，-207四、實(shí)驗(yàn)步驟本實(shí)驗(yàn)在無(wú)液氮的條件下，制備鼠肝或兔肝DNA，與有液氮條件下相比，產(chǎn)量和質(zhì)量都有所下降。整個(gè)操作過(guò)程中，應(yīng)盡量避免DNA酶的污染，特別注意動(dòng)作溫和，減少對(duì)DNA的機(jī)械損傷。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》四、實(shí)驗(yàn)步驟本實(shí)驗(yàn)在無(wú)液氮的條件下，制備鼠肝或兔肝DNA，與8（一）儲(chǔ)備液的制備（第一次）

1.5mol／LNaCl2.0.5mol／LTris.HClpH8.03.0.5mol／LEDTApH8.04.3mol／LNaAcpH5.25.dddH2O6.生理鹽水（0.85％NaCl）以上均高壓滅菌7.10mg／mL蛋白酶K-20℃保存8.10mg／mL無(wú)DNA酶的RNA酶

-20℃保存9.5×TBE10.6×凝膠加樣緩沖液12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（一）儲(chǔ)備液的制備（第一次）1.5mol／L9（二）破碎細(xì)胞（第二次）

冰浴處理生理鹽水玻璃勻漿器

冰冷的生理鹽水清洗配制工作液處死小鼠取出肝臟

組織勻漿液

酶解液2ml勻漿液

組織細(xì)胞液

玻璃勻漿器勻漿移至1.5ml離心管5000r／min30—60s加400ul吹散加400ul離心無(wú)菌水酶解液水浴處理（55℃、12—18h）

12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（二）破碎細(xì)胞（第二次）冰浴處理生理鹽水10（三）分離、純化DNA（第三次）

等量分裝在兩支離心管內(nèi)加入20ul的RNase加入等體積①提取液500ul4℃10min

酶解樣品待抽提的樣品抽提

靜置離心

配制TE緩沖液

加等體積②提取液500ul10000r／min離心10min4℃10min

移出水相至離心管抽提

靜置

10000r／min離心10min加1/10加2倍放入離心移出水相NaAc無(wú)水乙醇

-75℃1-2h12000r／min離心15min加入超低溫冰箱融化、離心棄上清液

洗滌12000r／min離心15min干燥4℃

75%冷乙醇離心棄上清液加TE存放

DNA

12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（三）分離、純化DNA（第三次）11（四）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA（第四次）制備瓊脂糖凝膠膠板的制備加樣電泳紫外投射儀檢測(cè)DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中由負(fù)極向正極移動(dòng)。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（四）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA（第四次）制備瓊脂糖凝膠121.計(jì)算方法:（1）摩爾質(zhì)量的計(jì)算:質(zhì)量(g)分子量

5mol／LNaCl分子量58.44x58.44（2）組織勻漿液：10ml

5mol／LNaCl100mmol／L5mol／L×x＝0.1mol／L×10ml0.2ml

÷體積(L)＝摩爾體積（mol/L）÷0.5(L)＝5（mol/L）x＝146.1（g）12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》1.計(jì)算方法:（1）摩爾質(zhì)量的計(jì)算:÷體積(L)＝摩爾體積132.溶液的配置（1)3mol/L乙酸鈉（sodiumacetate）：溶解20.4g的三水乙酸鈉于約40ml水中，用冰乙酸調(diào)溶液的pH至5.2，再加水定容到50ml。(2)0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）:配制等摩爾的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三鈉鹽。或稱(chēng)取9.31g的Na2EDTA·2H2O和1g的NaOH，并溶于約40ml水中，定容至50ml。(3)5mol/L氯化鈉（NaCl）：溶解14.6g氯化鈉于足量的水中，定容至50ml。

12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》2.溶液的配置（1)3mol/L乙酸鈉（sodiumac14(4)10％十二烷基硫酸鈉（SDS）：稱(chēng)取10gSDS慢慢轉(zhuǎn)移到約含90ml的水的燒杯中，用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。用水定容至100ml。(5)10N氫氧化鈉（NaOH）：溶解40g氫氧化鈉顆粒于約90ml水的燒杯中（磁力攪拌器攪拌），氫氧化鈉完全溶解后用水定容至100ml。(6)1mol/L鹽酸（HCl）：加8.6ml的濃鹽酸至91.4ml的水中。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(4)10％十二烷基硫酸鈉（SDS）：12/1/2022215(7)20mg/ml蛋白酶K（proteinaseK）：將200mg的蛋白酶L加入到9.5ml水中，輕輕搖動(dòng)，直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。(8)10mg/mlRnase（無(wú)DNase）（DNase－freeRNase）：溶解10mg的胰蛋白R(shí)NA酶于1ml的10mmol/L的乙酸鈉水溶液中（pH5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris－HCl調(diào)pH至7.5，于-20℃貯存。（配制過(guò)程中要戴手套）12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(7)20mg/ml蛋白酶K（proteinaseK）：16(9)Tris緩沖液（Tris-HClbuffer）

將121g的Tris堿溶解于約0.9L水中，再根據(jù)所要求的pH（25℃下）加一定量的濃鹽酸（11.6N），用水調(diào)整終體積至1L。濃鹽酸的體積（ml）pH148.621

28.5

38

46

56

66

71.3

769.08.8

8.6

8.4

8.2

8.0

7.8

7.6

7.4

7.212/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(9)Tris緩沖液（Tris-HClbuffer）175×TBE（電泳緩沖液）100mL5.4gTris，2.75g硼酸，2mL0.5mol／LEDTA(pH8.0)加蒸餾水到100mL（1000ml）pH8.012/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》5×TBE（電泳緩沖液）100mL5.4gTris，12/186×上樣緩沖液0．25％溴酚藍(lán)：取60ml雙蒸水，將250mg溴酚藍(lán)溶解于其中40％(W／V)蔗糖水溶液：在上述溶液中加入40g蔗糖12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》6×上樣緩沖液0．25％溴酚藍(lán)：取60ml雙蒸水，將250m19破碎細(xì)胞1．取0.2g鼠肝或兔肝，用冰冷的生理鹽水洗3次，然后置于2.0mL勻漿液中，用玻璃勻漿器勻漿至無(wú)明顯組織塊存在(冰浴操作，切匆將細(xì)胞破碎，可鏡檢觀(guān)察)。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》破碎細(xì)胞1．取0.2g鼠肝或兔肝，用冰冷的生理鹽水洗3次，然202．將組織細(xì)胞液移至1.5mL離心管中，5000r／min離心30—60s，(盡可能在低溫下操作)，棄上清，若沉淀中血細(xì)胞較多，可再加入5倍于細(xì)胞體積的勻漿液洗一次。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》2．將組織細(xì)胞液移至1.5mL離心管中，5000r／min離213．沉淀加400uL無(wú)菌水迅速吹散，再加400uL酶解液，翻轉(zhuǎn)混勻(動(dòng)作一定要輕)55℃水浴處理12—18h。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》3．沉淀加400uL無(wú)菌水迅速吹散，再加400uL酶解液，翻22分離、純化DNA4．取20uLRNase加入1.5ml離心管內(nèi)，使RNase至終濃度200μg／mL，37℃水浴1h。5．將待抽提的樣品等量分裝在兩支離心管內(nèi)，各加入等體積①提取液酚／氯仿／異戊醇500ul，抽提(慢慢旋轉(zhuǎn)混勻，傾斜使兩相接觸面增大)一次。4℃10min靜置，然后10000r／min離心10min。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》分離、純化DNA4．取20uLRNase加入1.5ml離心236.有時(shí)如果DNA含量過(guò)高，水相在下層，實(shí)驗(yàn)時(shí)注意觀(guān)察。用擴(kuò)口吸頭移出含DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀)。7.然后加等體積②提取液氯仿／異戊醇500ul，抽提，4℃10min靜置，然后10000r／min離心10min(若界面或水相中蛋白含量多，可重復(fù)5，6，7操作)。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》6.有時(shí)如果DNA含量過(guò)高，水相在下層，實(shí)驗(yàn)時(shí)注意觀(guān)察。用擴(kuò)248.用擴(kuò)口吸頭小心吸出上層含DNA的水相，加1／10體積的NaAc，小心混勻(要充分)。9.再向每管中加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇，-75℃1-2h。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》8.用擴(kuò)口吸頭小心吸出上層含DNA的水相，加1／10體積的N2510.

12000r／min離心15min，棄上清。11.75％冷乙醇洗滌一次，12000r／min離心15min。12.室溫干燥(不要太干，否則DNA不易溶解)，加入50μLTE緩沖液。13.存放于4℃，輕搖溶解過(guò)夜(或2h)，即可得到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基因組DNA。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》10.12000r／min離心15min，棄上清。12/126瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA（1）哺乳動(dòng)物基因組DNA提取檢測(cè)的電泳膠制備A.支持膠：1％瓊脂糖

稱(chēng)取0.4g瓊脂糖，放人錐形瓶中，加入40mL，0.5×TBE緩沖液，置水浴加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1％瓊脂糖凝膠液。B.電泳膠：0.3％瓊脂糖

稱(chēng)取0.18g瓊脂糖，放人錐形瓶中，加入60mL的0.5×TBE緩沖液，置水浴加熱至完全溶化，取出搖勻，則為0.3％瓊脂糖凝膠液。（由于蒸發(fā)作用，溶解前在容量瓶上作一個(gè)記號(hào)，溶解后用雙蒸水補(bǔ)足）12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA（1）哺乳動(dòng)物基因組DNA提取檢測(cè)的2712/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》28（2）膠板的制備

①取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，②將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并在槽內(nèi)底部放上玻璃，然后再放好樣品梳子。③先用2.5％瓊脂糖凝膠液將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好(一定封嚴(yán)，不能留縫隙)。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（2）膠板的制備①取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，12/1/229④將熔化的瓊脂糖凝膠液轉(zhuǎn)入EB專(zhuān)用的三角瓶中，然后加入10mg/ml的EB4ul至終濃度0.5ug/ml。⑤將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒人有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面(注意不要形成氣泡)。⑥待膠凝固后（60min），取出梳子，取下有機(jī)玻璃片，放在電泳槽內(nèi)。⑦加入電泳緩沖液(0.5×）至電泳槽中。

12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》④將熔化的瓊脂糖凝膠液轉(zhuǎn)入EB專(zhuān)用的三角瓶中，然后加入10m30（3）加樣1.樣品DNA：16ul2.上樣緩沖液：4ul1.MarkDNA樣品：6ul

共20ul12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（3）加樣1.樣品DNA：16ul共20ul1231（4）電泳①接通電泳槽與電泳儀的電源(注意正負(fù)極，DNA片段從負(fù)極向正極移動(dòng))。保持電壓190V。②當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。

12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（4）電泳①接通電泳槽與電泳儀的電源(注意正負(fù)極，DNA片段32（5）實(shí)驗(yàn)結(jié)果在紫外燈(312nm或254nm)下觀(guān)察染色后的電泳凝膠(圖實(shí)驗(yàn)12—1)。DNA存在處應(yīng)顯出桔紅色熒光條帶(在紫外燈下觀(guān)察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡，紫外線(xiàn)對(duì)眼睛有傷害作用)。結(jié)果照片圖12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（5）實(shí)驗(yàn)結(jié)果在紫外燈(312nm或254nm)下觀(guān)察染色后33五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析方法

1.紫外分光光度計(jì)2.電泳（瓊脂糖凝膠電泳）3.二苯胺顯色法測(cè)定12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析方法12/1/20222003級(jí)《分34六、思考題1.為什么在低溫下進(jìn)行？2.加入EDTA的作用？3.加SDS的作用？4.加飽和酚、氯仿有什么作用？5.加入異戊醇有什么作用？12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》六、思考題1.為什么在低溫下進(jìn)行？12/1/2022200335七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告哺乳動(dòng)物基因組DNA的提取（綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告）12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告哺乳動(dòng)物基因組DNA的提取12/1/20222036

細(xì)胞（Cell）植物細(xì)胞(plantcell) 動(dòng)物細(xì)胞(animalcell)12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》細(xì)胞（Cell）植物細(xì)3712/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》38溶酶體(lysosome)

溶酶體時(shí)酸性細(xì)胞器,含有一系列消化降解酶(degradativeenzymes);分為初級(jí)溶酶體和次級(jí)溶酶體。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》溶酶體(lysosome)溶酶體時(shí)酸性細(xì)胞器39組織勻漿液（裝入10ml離心管中）10ml100mmol／LNaCl：

0.2ml（5MNaCl）25mmol／LEDTA(pH8．0)：

0.5ml（0.5MEDTApH8．0)l0mmol／LTris.HCIpH8．0)：

0.2ml（0.5MLTris.HCIpH8．0)加三蒸水:9.1ml12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》組織勻漿液（裝入10ml離心管中）10ml100mmo40酶解液（裝入1.5ml離心管中）1ml200mmol／LNaCl：0.04ml

（5MNaCl）50mmol／LEDTA(pH8．0)：0.1ml

（0.5MEDTApH8．0)20mmol／LTris.HCl(pH8．0)：0.04ml（0.5MLTris.HCIpH8．0)1％SDS：0.1ml（10％SDS）200μg／mL蛋白酶K：

0.02ml

（10mg／mL）

加三蒸水:0.7ml12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》酶解液（裝入1.5ml離心管中）1ml200mmol／L41無(wú)DNA酶的RNA酶（-20℃保存）

10mmol／LTris.HCl將胰RNA酶溶于濃度10mg／mL15mmol／LNaCl

于100℃水浴處理15min以降解DNA酶緩慢冷卻到室溫。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》無(wú)DNA酶的RNA酶（-20℃保存）1042平衡酚(pH8.0)：氯仿：異戊醇：25：24：1(體積比)即配即用

每管加500ul平衡酚(pH8.0)：250ul氯仿：240ul異戊醇：10ul12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》平衡酚(pH8.0)：氯仿：異戊醇：25：43氯仿：異戊醇：24：1(體積比)即配即用

每支試管加500ul氯仿：480ul異戊醇：20ul12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》氯仿：異戊醇：24：1(體積比)即配即用12/1/2022244TE緩沖液5ml10mmol／LTris.HCl(pH8．0)：0.1ml（0.5MLTris.HCIpH8．0)1mmol／LEDTA(PH8．0)：

0.01ml（0.5MEDTApH8．0)加三蒸水至4.89mL12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》TE緩沖液5ml10mmol／L45酚抽提除去蛋白質(zhì)的示意圖12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》酚抽提除去蛋白質(zhì)的示意圖12/1/20222003級(jí)《46

加入二苯胺試劑2ml

乳白色無(wú)色沸水水浴10分鐘。無(wú)色淺藍(lán)色

二苯胺顯色12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》二苯胺顯色12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)47二苯胺試劑的配制

A液:1.5g二苯胺溶于100mL冰醋酸中再加15mL濃硫酸,用棕色瓶保存。如冰醋酸呈結(jié)晶狀態(tài),則需加溫后待其熔化,再使用。

B液:乙醛的體積分?jǐn)?shù)為0.2%的溶液。

配制:將0.1mLB液加入到10mLA液中,現(xiàn)配現(xiàn)用。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》二苯胺試劑的配制A液:1.5g二苯胺溶于100mL48細(xì)胞的破碎

由于高等動(dòng)物DNA主要存在于細(xì)胞核與線(xiàn)粒體中，所以提取時(shí)有兩個(gè)困難（高等植物與此類(lèi)似）：①破碎細(xì)胞難；從處死動(dòng)物?分離組織器宮到破碎細(xì)胞費(fèi)時(shí)長(zhǎng)。在此時(shí)期間DNA可能會(huì)被DNAase降解，而動(dòng)物組織：特別是肌肉組織很難破碎,即使是較易破碎的肝?腎等組織也往往使用組織勻漿器，易造成DNA斷裂。②分子量大，一般比細(xì)菌的大2—3個(gè)數(shù)量級(jí)，比病毒的大4—5個(gè)數(shù)量。對(duì)不同生物材料，要根據(jù)具體情況選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x提取方法。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》細(xì)胞的破碎12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)49核酸的酚抽提原理：交替使用酚、氯仿兩種蛋白質(zhì)變性劑，更有效去除蛋白質(zhì)。氯仿還可加速有機(jī)相與水相的分層。異戊醇：抑制界面泡沫的形成。標(biāo)準(zhǔn)程序：酚——酚-氯仿——氯仿。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》核酸的酚抽提原理：交替使用酚、氯仿兩種蛋白質(zhì)變性劑，更有效去50核酸的沉淀原理：核酸與鈉、鉀、鎂形成的鹽在許多有機(jī)溶劑中不溶，也不會(huì)變性。醋酸鈉為沉淀DNA、RNA的最常用鹽類(lèi)。有機(jī)溶劑：乙醇、異丙醇、聚乙二醇。溫度：冰水12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》核酸的沉淀原理：核酸與鈉、鉀、鎂形成的鹽在許多有機(jī)溶劑中不溶51

核酸的理化性質(zhì)

物理性質(zhì)1.性狀：RNA及其組分核苷酸、核苷、嘌呤堿、嘧啶堿的純品都呈白色的粉末或結(jié)晶；DNA則為疏松的石棉一樣的纖維狀固體。2、溶解性：

RNA和DNA都是極性的化合物，一般說(shuō)來(lái)，這些化合物都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑。它們的鈉鹽易溶于水。DNA和RNA在生物細(xì)胞內(nèi)都與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白。DNA核蛋白與RNA核蛋白的溶解度受溶液的鹽濃度的影響而不同。DNA蛋白在低濃度的鹽溶液中隨鹽濃度的增加而增加，在1mol/L的NaC溶液中溶解度比純水高2倍，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，僅為水的1%，幾乎不溶解；而RNA蛋白在鹽溶液中其溶解度受鹽濃度的影響較小，在0.14mol/L的NaCl溶解度較大。因此，在核酸的提取中，常用此法將兩種核蛋白分開(kāi)，然后用蛋白質(zhì)變性劑去除蛋白質(zhì)。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》核酸的理化性質(zhì)物理性質(zhì)12/1/20222003級(jí)52核酸的兩性電離與等電點(diǎn)核酸的磷酸基具有酸性，堿基具有堿性，因此，核酸具有兩性電離的性質(zhì)。但核酸中磷酸基的酸性大于堿基的堿性，其等電點(diǎn)偏酸性。DNA的pI約為4-5，RNA的pI約為2.0-2.5，在pH7-8電泳時(shí)泳向正極。

UV吸收核酸分子中含有嘌呤堿和嘧啶堿，因而具有紫外吸收的的性質(zhì)。在260nm處核酸紫外吸收最強(qiáng)。核酸的紫外吸收是核酸定量測(cè)定的基礎(chǔ)。

12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》核酸的兩性電離與等電點(diǎn)12/1/20222003級(jí)《分53DNA的提取方法簡(jiǎn)介為了研究DNA分子在生命代謝中的作用，常常需要從不同的生物材料中提取DNA.由于DNA分子在生物體內(nèi)的分布及含量不同，要選擇適當(dāng)?shù)牟牧咸崛NA。動(dòng)植物中，小牛胸腺?動(dòng)物肝臟?魚(yú)類(lèi)精子，植物種子的胚中都含有豐富的DNA。微生物中，谷氨酸菌體含7%~10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大腸肝菌含9%~10%。

12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》DNA的提取方法簡(jiǎn)介為了研究DNA分子在生命代謝中的作用，常54從各種材料中提取DNA方法不同，分離提取的難易程度也不同。對(duì)于低等生物。如從病毒中提取DNA比較容易，多數(shù)病毒DNA分子量較小，提取時(shí)易保持其結(jié)構(gòu)完整性。從細(xì)菌及高等動(dòng)植物中提取DNA難度大一些。細(xì)菌DNA分子量較大，一般達(dá)2×10道爾頓。因此易被機(jī)械張力剪斷。細(xì)菌DNA，除核DNA外，還有質(zhì)粒DNA等。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》從各種材料中提取DNA方法不同，分離提取的難易程度也不同。155核酸的分離純化、測(cè)定及研究方法一、

分離核酸的一般原則

因?yàn)檫z傳信息全部貯存在核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，故完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》核酸的分離純化、測(cè)定及研究方法一、分離核酸的一般原則1256（一）核酸的分離和純化時(shí)應(yīng)遵循兩個(gè)原則：

①保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；

②排除其它分子的污染。（二）核酸的純度要求①

核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；②其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類(lèi)分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時(shí)，應(yīng)去除RNA，反之亦然。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（一）核酸的分離和純化時(shí)應(yīng)遵循兩個(gè)原則：

①保證核酸一級(jí)結(jié)57（三）核酸分離純化的注意事項(xiàng)為保證分離核酸的完整性和純度，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意：①盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過(guò)程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞；②減少化學(xué)物質(zhì)對(duì)核酸的降解，為避免過(guò)酸、過(guò)堿對(duì)核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH4～10條件下進(jìn)行；③防止核酸的生物降解。細(xì)胞內(nèi)或外來(lái)的各種核酸酶水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。其中DNA酶需要金屬二價(jià)陽(yáng)離子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金屬離子螯合劑，如EDTA或檸檬酸鹽等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布廣泛、極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸堿、不易失活，所以生物降解是RNA提取過(guò)程中的主要危害因素；④減少物理因素對(duì)核酸的降解，物理降解因素主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。

12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（三）核酸分離純化的注意事項(xiàng)為保證分離核酸的完整性和純度，在58

高溫：如長(zhǎng)時(shí)間煮沸，除水沸騰帶來(lái)的剪切力外，高溫本身對(duì)核酸分子中的某些化合鍵也有破壞作用。核酸提取過(guò)程中常規(guī)操作溫度為0～4℃以降低核酸酶的活性從而減少對(duì)核酸的生物降解。

機(jī)械剪切力：包括強(qiáng)力高速的溶液振蕩、攪拌，細(xì)胞突然置于低滲液中；細(xì)胞爆炸式地破裂及DNA樣品的反復(fù)凍融等。這些操作細(xì)節(jié)在實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)加倍注意。機(jī)械剪切作用的主要危害對(duì)象是大分子量的線(xiàn)性DNA分子，如真核細(xì)胞的染色體DNA等。

12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》高溫：如長(zhǎng)時(shí)間煮沸，除水沸騰帶來(lái)的剪切力外，高溫本身59二、核酸分離純化的一般步驟破碎細(xì)胞→去除蛋白質(zhì)、多糖、脂類(lèi)等生物大分子→沉淀核酸→去除鹽類(lèi)、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)→純化干燥→溶解。核酸提取方案，應(yīng)根據(jù)具體生物材料和待提取核酸分子的特點(diǎn)而定。對(duì)于某特定細(xì)胞器中富集的核酸分子，采用先提取細(xì)胞器后再提取目的核酸分子的方案，可獲得完整性和純度兩方面質(zhì)量均高的核酸分子。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》二、核酸分離純化的一般步驟破碎細(xì)胞→去除蛋白質(zhì)、多糖、脂類(lèi)等60哺乳動(dòng)物基因組DNA的提取實(shí)驗(yàn)一儲(chǔ)備液的制備實(shí)驗(yàn)二破碎細(xì)胞實(shí)驗(yàn)三分離、純化DNA實(shí)驗(yàn)四瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》哺乳動(dòng)物基因組DNA的提取實(shí)驗(yàn)一儲(chǔ)備液的制備12/1/61一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)了解并掌握提取動(dòng)物基因組DNA的原理和步驟。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)熟練掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。熟練掌握分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中各種儀器的使用方法及試劑的配制方法。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)了解并掌握提取動(dòng)物基因組DNA的原理和62二、實(shí)驗(yàn)原理

天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取DNA時(shí)，先把DNP抽提出來(lái)，再把P除去，再除去細(xì)胞中的糖，RNA及無(wú)機(jī)離子等。在EDTA和SDS等去污劑存在下，用蛋白酶K消化細(xì)胞，隨后用酚抽提，可以得到哺乳動(dòng)物基因組DNA。用此方法得到的DNA大小為100-150kb，適用于λ噬菌體構(gòu)建基因組文庫(kù)和Southern分析。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》二、實(shí)驗(yàn)原理天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形63三、儀器、材料和試劑（一）儀器高速冷凍離心機(jī)、微量取樣器、玻璃勻漿器、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)：電泳儀、水平電泳槽、紫外透射儀（或凝膠成像分析系統(tǒng)）、恒溫水浴器、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、超低溫冰箱、電子天平、酸度計(jì)12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》三、儀器、材料和試劑（一）儀器12/1/20222003級(jí)64（二）實(shí)驗(yàn)材料、用具、藥品1.鼠肝或兔肝2.1.5mL微量離心管、微孔過(guò)濾器、20mL注射器、各種型號(hào)的吸頭3.三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、醋酸鈉（NaAc）、平衡酚、氯仿、異戊醇、乙醇、瓊脂糖、蛋白酶K、RNA酶、DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物、硼酸、溴酚藍(lán)、蔗糖溴化乙錠（危險(xiǎn)）12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（二）實(shí)驗(yàn)材料、用具、藥品1.鼠肝或兔肝12/1/2022265（三）試劑

1.5mol／LNaCl2.0.5mol／LTris.HClpH8.03.0.5mol／LEDTApH8.04.3mol／LNaAcpH5.25.dddH2O6.生理鹽水（0.85％NaCl）以上均高壓滅菌12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（三）試劑1.5mol／LNaCl12/1/667.10mg／mL蛋白酶K配好后用一次性過(guò)濾器過(guò)濾，-20℃保存；8.10mg／mL無(wú)DNA酶的RNA酶配好后用一次性過(guò)濾器過(guò)濾，-20℃保存；9.組織勻漿液10.酶解液11.提取液1：平衡酚(pH8.0)：氯仿：異戊醇＝25：24：112.提取液2：氯仿：異戊醇＝24：113.5×TBE14.TE緩沖液15.6×凝膠加樣緩沖液12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》7.10mg／mL蛋白酶K配好后用一次性過(guò)濾器過(guò)濾，-2067四、實(shí)驗(yàn)步驟本實(shí)驗(yàn)在無(wú)液氮的條件下，制備鼠肝或兔肝DNA，與有液氮條件下相比，產(chǎn)量和質(zhì)量都有所下降。整個(gè)操作過(guò)程中，應(yīng)盡量避免DNA酶的污染，特別注意動(dòng)作溫和，減少對(duì)DNA的機(jī)械損傷。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》四、實(shí)驗(yàn)步驟本實(shí)驗(yàn)在無(wú)液氮的條件下，制備鼠肝或兔肝DNA，與68（一）儲(chǔ)備液的制備（第一次）

1.5mol／LNaCl2.0.5mol／LTris.HClpH8.03.0.5mol／LEDTApH8.04.3mol／LNaAcpH5.25.dddH2O6.生理鹽水（0.85％NaCl）以上均高壓滅菌7.10mg／mL蛋白酶K-20℃保存8.10mg／mL無(wú)DNA酶的RNA酶

-20℃保存9.5×TBE10.6×凝膠加樣緩沖液12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（一）儲(chǔ)備液的制備（第一次）1.5mol／L69（二）破碎細(xì)胞（第二次）

冰浴處理生理鹽水玻璃勻漿器

冰冷的生理鹽水清洗配制工作液處死小鼠取出肝臟

組織勻漿液

酶解液2ml勻漿液

組織細(xì)胞液

玻璃勻漿器勻漿移至1.5ml離心管5000r／min30—60s加400ul吹散加400ul離心無(wú)菌水酶解液水浴處理（55℃、12—18h）

12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（二）破碎細(xì)胞（第二次）冰浴處理生理鹽水70（三）分離、純化DNA（第三次）

等量分裝在兩支離心管內(nèi)加入20ul的RNase加入等體積①提取液500ul4℃10min

酶解樣品待抽提的樣品抽提

靜置離心

配制TE緩沖液

加等體積②提取液500ul10000r／min離心10min4℃10min

移出水相至離心管抽提

靜置

10000r／min離心10min加1/10加2倍放入離心移出水相NaAc無(wú)水乙醇

-75℃1-2h12000r／min離心15min加入超低溫冰箱融化、離心棄上清液

洗滌12000r／min離心15min干燥4℃

75%冷乙醇離心棄上清液加TE存放

DNA

12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（三）分離、純化DNA（第三次）71（四）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA（第四次）制備瓊脂糖凝膠膠板的制備加樣電泳紫外投射儀檢測(cè)DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中由負(fù)極向正極移動(dòng)。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（四）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA（第四次）制備瓊脂糖凝膠721.計(jì)算方法:（1）摩爾質(zhì)量的計(jì)算:質(zhì)量(g)分子量

5mol／LNaCl分子量58.44x58.44（2）組織勻漿液：10ml

5mol／LNaCl100mmol／L5mol／L×x＝0.1mol／L×10ml0.2ml

÷體積(L)＝摩爾體積（mol/L）÷0.5(L)＝5（mol/L）x＝146.1（g）12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》1.計(jì)算方法:（1）摩爾質(zhì)量的計(jì)算:÷體積(L)＝摩爾體積732.溶液的配置（1)3mol/L乙酸鈉（sodiumacetate）：溶解20.4g的三水乙酸鈉于約40ml水中，用冰乙酸調(diào)溶液的pH至5.2，再加水定容到50ml。(2)0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）:配制等摩爾的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三鈉鹽?；蚍Q(chēng)取9.31g的Na2EDTA·2H2O和1g的NaOH，并溶于約40ml水中，定容至50ml。(3)5mol/L氯化鈉（NaCl）：溶解14.6g氯化鈉于足量的水中，定容至50ml。

12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》2.溶液的配置（1)3mol/L乙酸鈉（sodiumac74(4)10％十二烷基硫酸鈉（SDS）：稱(chēng)取10gSDS慢慢轉(zhuǎn)移到約含90ml的水的燒杯中，用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。用水定容至100ml。(5)10N氫氧化鈉（NaOH）：溶解40g氫氧化鈉顆粒于約90ml水的燒杯中（磁力攪拌器攪拌），氫氧化鈉完全溶解后用水定容至100ml。(6)1mol/L鹽酸（HCl）：加8.6ml的濃鹽酸至91.4ml的水中。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(4)10％十二烷基硫酸鈉（SDS）：12/1/2022275(7)20mg/ml蛋白酶K（proteinaseK）：將200mg的蛋白酶L加入到9.5ml水中，輕輕搖動(dòng)，直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。(8)10mg/mlRnase（無(wú)DNase）（DNase－freeRNase）：溶解10mg的胰蛋白R(shí)NA酶于1ml的10mmol/L的乙酸鈉水溶液中（pH5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris－HCl調(diào)pH至7.5，于-20℃貯存。（配制過(guò)程中要戴手套）12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(7)20mg/ml蛋白酶K（proteinaseK）：76(9)Tris緩沖液（Tris-HClbuffer）

將121g的Tris堿溶解于約0.9L水中，再根據(jù)所要求的pH（25℃下）加一定量的濃鹽酸（11.6N），用水調(diào)整終體積至1L。濃鹽酸的體積（ml）pH148.621

28.5

38

46

56

66

71.3

769.08.8

8.6

8.4

8.2

8.0

7.8

7.6

7.4

7.212/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(9)Tris緩沖液（Tris-HClbuffer）775×TBE（電泳緩沖液）100mL5.4gTris，2.75g硼酸，2mL0.5mol／LEDTA(pH8.0)加蒸餾水到100mL（1000ml）pH8.012/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》5×TBE（電泳緩沖液）100mL5.4gTris，12/786×上樣緩沖液0．25％溴酚藍(lán)：取60ml雙蒸水，將250mg溴酚藍(lán)溶解于其中40％(W／V)蔗糖水溶液：在上述溶液中加入40g蔗糖12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》6×上樣緩沖液0．25％溴酚藍(lán)：取60ml雙蒸水，將250m79破碎細(xì)胞1．取0.2g鼠肝或兔肝，用冰冷的生理鹽水洗3次，然后置于2.0mL勻漿液中，用玻璃勻漿器勻漿至無(wú)明顯組織塊存在(冰浴操作，切匆將細(xì)胞破碎，可鏡檢觀(guān)察)。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》破碎細(xì)胞1．取0.2g鼠肝或兔肝，用冰冷的生理鹽水洗3次，然802．將組織細(xì)胞液移至1.5mL離心管中，5000r／min離心30—60s，(盡可能在低溫下操作)，棄上清，若沉淀中血細(xì)胞較多，可再加入5倍于細(xì)胞體積的勻漿液洗一次。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》2．將組織細(xì)胞液移至1.5mL離心管中，5000r／min離813．沉淀加400uL無(wú)菌水迅速吹散，再加400uL酶解液，翻轉(zhuǎn)混勻(動(dòng)作一定要輕)55℃水浴處理12—18h。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》3．沉淀加400uL無(wú)菌水迅速吹散，再加400uL酶解液，翻82分離、純化DNA4．取20uLRNase加入1.5ml離心管內(nèi)，使RNase至終濃度200μg／mL，37℃水浴1h。5．將待抽提的樣品等量分裝在兩支離心管內(nèi)，各加入等體積①提取液酚／氯仿／異戊醇500ul，抽提(慢慢旋轉(zhuǎn)混勻，傾斜使兩相接觸面增大)一次。4℃10min靜置，然后10000r／min離心10min。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》分離、純化DNA4．取20uLRNase加入1.5ml離心836.有時(shí)如果DNA含量過(guò)高，水相在下層，實(shí)驗(yàn)時(shí)注意觀(guān)察。用擴(kuò)口吸頭移出含DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀)。7.然后加等體積②提取液氯仿／異戊醇500ul，抽提，4℃10min靜置，然后10000r／min離心10min(若界面或水相中蛋白含量多，可重復(fù)5，6，7操作)。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》6.有時(shí)如果DNA含量過(guò)高，水相在下層，實(shí)驗(yàn)時(shí)注意觀(guān)察。用擴(kuò)848.用擴(kuò)口吸頭小心吸出上層含DNA的水相，加1／10體積的NaAc，小心混勻(要充分)。9.再向每管中加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇，-75℃1-2h。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》8.用擴(kuò)口吸頭小心吸出上層含DNA的水相，加1／10體積的N8510.

12000r／min離心15min，棄上清。11.75％冷乙醇洗滌一次，12000r／min離心15min。12.室溫干燥(不要太干，否則DNA不易溶解)，加入50μLTE緩沖液。13.存放于4℃，輕搖溶解過(guò)夜(或2h)，即可得到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基因組DNA。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》10.12000r／min離心15min，棄上清。12/186瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA（1）哺乳動(dòng)物基因組DNA提取檢測(cè)的電泳膠制備A.支持膠：1％瓊脂糖

稱(chēng)取0.4g瓊脂糖，放人錐形瓶中，加入40mL，0.5×TBE緩沖液，置水浴加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1％瓊脂糖凝膠液。B.電泳膠：0.3％瓊脂糖

稱(chēng)取0.18g瓊脂糖，放人錐形瓶中，加入60mL的0.5×TBE緩沖液，置水浴加熱至完全溶化，取出搖勻，則為0.3％瓊脂糖凝膠液。（由于蒸發(fā)作用，溶解前在容量瓶上作一個(gè)記號(hào)，溶解后用雙蒸水補(bǔ)足）12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA（1）哺乳動(dòng)物基因組DNA提取檢測(cè)的8712/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》88（2）膠板的制備

①取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，②將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并在槽內(nèi)底部放上玻璃，然后再放好樣品梳子。③先用2.5％瓊脂糖凝膠液將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好(一定封嚴(yán)，不能留縫隙)。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（2）膠板的制備①取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，12/1/289④將熔化的瓊脂糖凝膠液轉(zhuǎn)入EB專(zhuān)用的三角瓶中，然后加入10mg/ml的EB4ul至終濃度0.5ug/ml。⑤將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒人有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面(注意不要形成氣泡)。⑥待膠凝固后（60min），取出梳子，取下有機(jī)玻璃片，放在電泳槽內(nèi)。⑦加入電泳緩沖液(0.5×）至電泳槽中。

12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》④將熔化的瓊脂糖凝膠液轉(zhuǎn)入EB專(zhuān)用的三角瓶中，然后加入10m90（3）加樣1.樣品DNA：16ul2.上樣緩沖液：4ul1.MarkDNA樣品：6ul

共20ul12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（3）加樣1.樣品DNA：16ul共20ul1291（4）電泳①接通電泳槽與電泳儀的電源(注意正負(fù)極，DNA片段從負(fù)極向正極移動(dòng))。保持電壓190V。②當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。

12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（4）電泳①接通電泳槽與電泳儀的電源(注意正負(fù)極，DNA片段92（5）實(shí)驗(yàn)結(jié)果在紫外燈(312nm或254nm)下觀(guān)察染色后的電泳凝膠(圖實(shí)驗(yàn)12—1)。DNA存在處應(yīng)顯出桔紅色熒光條帶(在紫外燈下觀(guān)察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡，紫外線(xiàn)對(duì)眼睛有傷害作用)。結(jié)果照片圖12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（5）實(shí)驗(yàn)結(jié)果在紫外燈(312nm或254nm)下觀(guān)察染色后93五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析方法

1.紫外分光光度計(jì)2.電泳（瓊脂糖凝膠電泳）3.二苯胺顯色法測(cè)定12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析方法12/1/20222003級(jí)《分94六、思考題1.為什么在低溫下進(jìn)行？2.加入EDTA的作用？3.加SDS的作用？4.加飽和酚、氯仿有什么作用？5.加入異戊醇有什么作用？12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》六、思考題1.為什么在低溫下進(jìn)行？12/1/2022200395七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告哺乳動(dòng)物基因組DNA的提?。ňC合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告）12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告哺乳動(dòng)物基因組DNA的提取12/1/20222096

細(xì)胞（Cell）植物細(xì)胞(plantcell) 動(dòng)物細(xì)胞(animalcell)12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》細(xì)胞（Cell）植物細(xì)9712/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》98溶酶體(lysosome)

溶酶體時(shí)酸性細(xì)胞器,含有一系列消化降解酶(degradativeenzymes);分為初級(jí)溶酶體和次級(jí)溶酶體。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》溶酶體(lysosome)溶酶體時(shí)酸性細(xì)胞器99組織勻漿液（裝入10ml離心管中）10ml100mmol／LNaCl：

0.2ml（5MNaCl）25mmol／LEDTA(pH8．0)：

0.5ml（0.5MEDTApH8．0)l0mmol／LTris.HCIpH8．0)：

0.2ml（0.5MLTris.HCIpH8．0)加三蒸水:9.1ml12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》組織勻漿液（裝入10ml離心管中）10ml100mmo100酶解液（裝入1.5ml離心管中）1ml200mmol／LNaCl：0.04ml

（5MNaCl）50mmol／LEDTA(pH8．0)：0.1ml

（0.5MEDTApH8．0)20mmol／LTris.HCl(pH8．0)：0.04ml（0.5MLTris.HCIpH8．0)1％SDS：0.1ml（10％SDS）200μg／mL蛋白酶K：

0.02ml

（10mg／mL）

加三蒸水:0.7ml12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》酶解液（裝入1.5ml離心管中）1ml200mmol／L101無(wú)DNA酶的RNA酶（-20℃保存）

10mmol／LTris.HCl將胰RNA酶溶于濃度10mg／mL15mmol／LNaCl

于100℃水浴處理15min以降解DNA酶緩慢冷卻到室溫。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》無(wú)DNA酶的RNA酶（-20℃保存）10102平衡酚(pH8.0)：氯仿：異戊醇：25：24：1(體積比)即配即用

每管加500ul平衡酚(pH8.0)：250ul氯仿：240ul異戊醇：10ul12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》平衡酚(pH8.0)：氯仿：異戊醇：25：103氯仿：異戊醇：24：1(體積比)即配即用

每支試管加500ul氯仿：480ul異戊醇：20ul12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》氯仿：異戊醇：24：1(體積比)即配即用12/1/20222104TE緩沖液5ml10mmol／LTris.HCl(pH8．0)：0.1ml（0.5MLTris.HCIpH8．0)1mmol／LEDTA(PH8．0)：

0.01ml（0.5MEDTApH8．0)加三蒸水至4.89mL12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》TE緩沖液5ml10mmol／L105酚抽提除去蛋白質(zhì)的示意圖12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》酚抽提除去蛋白質(zhì)的示意圖12/1/20222003級(jí)《106

加入二苯胺試劑2ml

乳白色無(wú)色沸水水浴10分鐘。無(wú)色淺藍(lán)色

二苯胺顯色12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》二苯胺顯色12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)107二苯胺試劑的配制

A液:1.5g二苯胺溶于100mL冰醋酸中再加15mL濃硫酸,用棕色瓶保存。如冰醋酸呈結(jié)晶狀態(tài),則需加溫后待其熔化,再使用。

B液:乙醛的體積分?jǐn)?shù)為0.2%的溶液。

配制:將0.1mLB液加入到10mLA液中,現(xiàn)配現(xiàn)用。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》二苯胺試劑的配制A液:1.5g二苯胺溶于100mL108細(xì)胞的破碎

由于高等動(dòng)物DNA主要存在于細(xì)胞核與線(xiàn)粒體中，所以提取時(shí)有兩個(gè)困難（高等植物與此類(lèi)似）：①破碎細(xì)胞難；從處死動(dòng)物?分離組織器宮到破碎細(xì)胞費(fèi)時(shí)長(zhǎng)。在此時(shí)期間DNA可能會(huì)被DNAase降解，而動(dòng)物組織：特別是肌肉組織很難破碎,即使是較易破碎的肝?腎等組織也往往使用組織勻漿器，易造成DNA斷裂。②分子量大，一般比細(xì)菌的大2—3個(gè)數(shù)量級(jí)，比病毒的大4—5個(gè)數(shù)量。對(duì)不同生物材料，要根據(jù)具體情況選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x提取方法。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》細(xì)胞的破碎12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)109核酸的酚抽提原理：交替使用酚、氯仿兩種蛋白質(zhì)變性劑，更有效去除蛋白質(zhì)。氯仿還可加速有機(jī)相與水相的分層。異戊醇：抑制界面泡沫的形成。標(biāo)準(zhǔn)程序：酚——酚-氯仿——氯仿。12/1/20222003級(jí)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》核酸的酚抽提原理：交替使用酚、氯仿兩種蛋白質(zhì)變性劑