菌種科學(xué)保藏常用方法

關(guān)于菌種科學(xué)保藏常用方法第1頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六主要內(nèi)容:一、菌種保藏的目的二、菌種保藏的原理（掌握）三、菌種保藏的方法（重點(diǎn)）第2頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六什么是菌種衰退？生產(chǎn)菌株性狀的劣化或遺傳標(biāo)記的丟失：1、菌落形態(tài)的改變2、生長(zhǎng)速度緩慢3、生產(chǎn)能力下降4、抗不良環(huán)境能力減弱（抗噬菌體、低溫等）第3頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六菌種退化原因1、基因突變2、連續(xù)傳代3、不良培養(yǎng)條件及不良保藏條件第4頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六菌種退化的防止1、減少傳代次數(shù)2、用單核細(xì)胞和單菌落移種傳代3、菌種純化4、采用良好培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件5、科學(xué)的保藏第5頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六一、菌種保藏的目的

菌種保藏的目的是：使菌種長(zhǎng)期保藏之后，仍然保持著原有的生命力、優(yōu)良生產(chǎn)性能、形態(tài)特征，以及不污染雜菌和不發(fā)生蟲害。第6頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六二、菌種保藏的原理菌種保藏的原理是通過低溫、干燥、隔絕空氣（真空）和斷絕營(yíng)養(yǎng)、加保護(hù)劑等手段，以達(dá)到最大限度地降低菌種的代謝強(qiáng)度，抑制微生物的生長(zhǎng)與繁殖。由于菌種的代謝相對(duì)靜止，生命活動(dòng)將處休眠狀態(tài)，所以能夠保藏較長(zhǎng)時(shí)間。第7頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六三、菌種保藏的方法1、斜面低溫保藏

（定期移植法）2、液體石蠟保藏3、砂土管貯藏4、

麩皮保藏法5、懸液保藏

：

1）生理鹽水保藏法；2）蒸餾水保藏法：

6、冷凍真空干燥保藏法7、液氮超低溫保藏法8、甘油保藏法第8頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六國(guó)內(nèi)、國(guó)際常用的菌種保藏法我國(guó)常采用的菌種保藏法：斜面低溫保藏

、液體石蠟保藏

、冷凍干燥法、液氮超低溫法。

國(guó)際（ATCC）常采用的方法：冷凍干燥法（5-15年）、液氮超低溫法（20年）。

第9頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六斜面低溫保藏(定期移植法)這是一種常用最簡(jiǎn)便的保藏方法。為了減少培養(yǎng)基水分散發(fā)，延長(zhǎng)保藏時(shí)間，在配制時(shí)瓊脂用量加到2.5％，再加入0.2％磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀及碳酸鈣等緩沖劑，以中和保藏過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸?？梢杂脽o(wú)菌膠塞代替棉塞，既能防止污染，又可隔絕氧氣，避免斜面干燥細(xì)菌：1個(gè)月，酵母菌3個(gè)月，放線菌、霉菌半年。第10頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六第11頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六二）、液體石蠟法

操作簡(jiǎn)便，只要在菌苔上灌注一層無(wú)菌的液體石蠟，即可使菌種與外界空氣隔絕，達(dá)到防止培養(yǎng)基水分散失，抑制菌絲新陳代謝，推遲菌種老化，延長(zhǎng)菌種生命和保存時(shí)間的目的。此種方法也稱為隔絕空氣保藏法。

第12頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六具體方法：

1、石蠟的準(zhǔn)備：選用化學(xué)純液體石蠟100毫升，裝入250毫升錐形瓶?jī)?nèi)，置于0.11兆帕滅菌30～60分鐘；然后置于160℃烘箱中處理1～2小時(shí)；或置40℃溫箱內(nèi)3天左右，見瓶?jī)?nèi)液體石蠟呈澄清透明，液層中無(wú)白色霧狀物時(shí)即可。其目的是使滅菌時(shí)進(jìn)入瓶?jī)?nèi)的水分得到蒸發(fā)。

2、接種與保存：在無(wú)菌條件下，將液體石蠟用無(wú)菌吸管移入生長(zhǎng)健壯、豐滿的斜面菌種上，使液體石蠟高出斜面頂端1厘米左右；最后直立放置在潔凈的室溫下貯藏。轉(zhuǎn)管時(shí)直接用刀切取1小塊菌種，移接到新的斜面培養(yǎng)基中央，適溫培養(yǎng)，余下的菌種仍在原液體石蠟中貯藏。

第13頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六三）、砂土管貯藏：

此法應(yīng)用廣泛，適于貯藏孢子和酵母狀分生孢子，而對(duì)菌絲體不適用。此法保藏孢子，壽命可達(dá)2～10年，使用時(shí)在無(wú)菌條件下，挑取少許砂土孢子，抖撒在PDA斜面上，適溫培養(yǎng)，菌絲生長(zhǎng)后，再轉(zhuǎn)管培養(yǎng)1次。

第14頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六1.準(zhǔn)備砂土:

細(xì)河砂，用內(nèi)徑0.250～0.177毫米篩孔過篩,除去粗粒和砂未；

紅黃壤土，內(nèi)徑0.149毫米過篩，用磁鐵襯紙吸除砂土中鐵屑，用0.05～0.1N鹽酸浸泡半天，除去有機(jī)質(zhì)。然后用清水反復(fù)沖洗至酸堿度近中性后，置于60～80℃烘箱中烘干。砂土比例2:1或4:1混合，分裝入10毫米×100毫米試管或安瓿瓶?jī)?nèi)，每管裝量0.5克，經(jīng)0.11兆帕121℃高壓滅菌30分鐘，每天1次，共3次，或160℃干熱滅菌1次，保持2～3小時(shí)。滅菌后挑取少許砂土移至PDA斜面上培養(yǎng)，證實(shí)無(wú)雜菌即可。第15頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六2、接種:

干接：用接種環(huán)直接挑取孢子2～3環(huán)，拌入砂土管中濕接：將孢子刮入5毫升無(wú)菌水的試管內(nèi)，充分搖勻，制在孢子懸液，然后用1毫升吸管吸取懸液，每管中加入0.2毫升。

3、貯藏：干接法制成的砂土管，直接放在盛有無(wú)水氯化鈣、變色硅膠或生石灰的廣口瓶?jī)?nèi)保存：濕接法制成的砂土管，用真空泵抽氣8～10小時(shí)，使之干燥。放在盛有無(wú)水氯化鈣或變色硅膠的大試管內(nèi)，加橡皮塞，放置4～6℃冰箱中貯藏。第16頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六四）麩皮保藏法

亦稱曲法保藏。即以麩皮作載體，吸附接入孢子，然后在低溫干燥條件下保存。其制作方法將麩皮與水以一定的比例1：(0.8～1.5)拌勻，裝量為試管體積2/5，濕熱滅菌后經(jīng)冷卻，接入新鮮培養(yǎng)的菌種，適溫培養(yǎng)至孢子長(zhǎng)成。將試管置于盛有氯化鈣等干燥劑的干燥器中，于室溫下干燥數(shù)日后移入低溫下保藏；干燥后也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。此法適用于產(chǎn)孢子的霉菌和某些放線菌，保藏期在1年以上。因操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，工廠較多采用。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所采用麩皮保藏法保藏曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等，其保藏期可達(dá)數(shù)年至數(shù)十年。第17頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六五）、蒸餾水保藏法：

這是保存斜面菌種和孢子最簡(jiǎn)單的方法，有效期可達(dá)1年以上。

1、斜面蒸餾水貯藏：在無(wú)菌條件下，將無(wú)菌蒸餾水傾注入需保藏的斜面菌種內(nèi)。加水量需高出斜面頂端1～2厘米，更換無(wú)菌橡皮塞，直立置于4～6℃冰箱內(nèi)貯藏。

2、孢子蒸餾水貯藏：無(wú)菌條件下提取少許孢子，移入試管無(wú)菌蒸餾水內(nèi)，換上橡皮塞，直立置于4～6℃冰箱內(nèi)貯藏。若保存時(shí)間較長(zhǎng)，中途需補(bǔ)充無(wú)菌蒸餾水。使用時(shí)從管內(nèi)挑取菌種塊或蘸取孢子懸液，移接至新的斜面培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)。原試管加塞后仍可繼續(xù)貯藏。第18頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六六）、冷凍真空干燥保藏法

采用低溫、干燥和真空辦法，使菌種的新陳代謝活動(dòng)處于高度靜止?fàn)顟B(tài)，也就是在極低溫度下（-70℃左右）快速冷凍，然后在極低溫度下真空干燥，使菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分保持原來(lái)狀態(tài)。因此，菌種保藏10～20年，仍不降低其原有性能。冷凍干燥是目前應(yīng)用最廣泛、效果較好的一種菌種保藏方法。第19頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六六）、冷凍真空干燥保藏法1、安瓿瓶的準(zhǔn)備：

2、保護(hù)劑的選擇：3、冷凍干燥裝置：4、制備孢子液5、預(yù)凍孢子液：6、減壓干燥7、真空熔封：

第20頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六六）、冷凍真空干燥保藏法

1、安瓿瓶的準(zhǔn)備：安瓿瓶的玻璃應(yīng)能經(jīng)受溫度的突變而不破裂，先用2％鹽酸浸泡12小時(shí)，再用清水洗滌3次，然后用蒸餾水洗凈、烤干；瓶口加棉塞，滅菌后備用。

2、保護(hù)劑的選擇：保護(hù)劑的作用是使細(xì)胞在凍干過程中免受損傷及減少在保藏過程中的死亡。保護(hù)劑種類很多，如牛馬血清、無(wú)菌牛奶等，多數(shù)菌種保藏是脫脂牛奶。

3、冷凍干燥裝置：這個(gè)裝置包括1臺(tái)真空泵、1付麥?zhǔn)险婵沼?jì)、1個(gè)緩沖瓶、1個(gè)真空干燥器（內(nèi)裝五氧化二磷或無(wú)水氯化鈣等干燥劑）和1個(gè)冷凍槽（內(nèi)盛有1:3的食鹽和碎冰塊）。第21頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六六）、冷凍真空干燥保藏法

4、制備孢子液：用接種針挑取孢子接入盛有2～3毫升無(wú)菌脫脂牛奶的試管中，稍加攪動(dòng)即制成懸浮液。用吸管吸取懸浮液注入安瓿瓶。每管分裝約0.2毫升，注意不要濺污上部管壁，防止雜菌污染和熔封時(shí)引起碳化。分裝應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)完成，裝后棉花塞好管口。

5、預(yù)凍孢子液：在冷凍干燥之前，先將孢子液的安瓿瓶，置于低溫冰箱中預(yù)凍1小時(shí)，安瓿瓶放在上述凍結(jié)劑中，只需4～5分鐘，溫度便可達(dá)-70℃。

6、減壓干燥：將預(yù)凍時(shí)附在這瓿瓶管上的冰水揩干，立即放入干燥器中抽真空。第22頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六六）、冷凍真空干燥保藏法7、真空熔封：菌種安瓿瓶經(jīng)減壓干燥后，應(yīng)立即取出安裝在封口用的玻璃抽氣管上，進(jìn)行抽氣熔封管口。邊抽氣，邊用煤氣或酒精燈的細(xì)火焰，對(duì)準(zhǔn)安瓿瓶中央，即可熔斷封口。熔封時(shí)應(yīng)注意火焰，不宜過大。

安瓿瓶菌種啟用時(shí)，在無(wú)菌操作下打開這瓿瓶，加入0.3～0.5毫升的無(wú)菌生理鹽水或1％麥芽汁即可使用。

由于真空干燥保藏的菌種是密封在安瓿瓶里的，因此不僅郵寄運(yùn)輸方便，并且不會(huì)污染雜菌。此法適于能形成孢子的菇類長(zhǎng)期保藏，其設(shè)備和操作均較復(fù)雜。第23頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六

七）、液態(tài)氮超低溫保藏

將要保藏菌種的懸浮液或菌塊，密封于盛有保護(hù)劑的安瓿瓶里，先在控制的條件下致冷，使之緩速預(yù)凍，再置于-150至-196℃液態(tài)氮超低溫冰箱中保藏。優(yōu)點(diǎn)：保存時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)數(shù)年至數(shù)十年；適用范圍廣，對(duì)一些即使不耐低溫菌種，如草菇等，也可在保護(hù)劑的保護(hù)下進(jìn)行超低溫保存；此外，經(jīng)保藏的菌種基本上不發(fā)生變異。第24頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六國(guó)內(nèi)、國(guó)際常用的菌種保藏法我國(guó)常采用的菌種保藏法：斜面低溫保藏

、液體石蠟保藏

、冷凍干燥法、液氮超低溫法。

國(guó)際（ATCC）常采用的方法：冷凍干燥法（5-15年）、液氮超低溫法（20年）。

第25頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六國(guó)內(nèi)主要的菌種保藏機(jī)構(gòu)1、CCTCC中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心

(ChinaCenterforTypeCultureCollection，簡(jiǎn)稱CCTCC):CCTCC保藏的微生物包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、真菌、單細(xì)胞藻類、人和動(dòng)物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、雜交瘤、原生動(dòng)物，地衣，植物組織培養(yǎng)、植物種子、動(dòng)植物病毒、噬菌體、質(zhì)粒和基因文庫(kù)等各類微生物（生物材料/菌種）。/

第26頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六國(guó)內(nèi)主要的菌種保藏機(jī)構(gòu)2、CGMCC普通微生物菌種保藏管理中心:CGMCC的宗旨是廣泛收集國(guó)內(nèi)外的微生物資源，妥善保存，以公開的保藏機(jī)構(gòu)的名義為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、衛(wèi)生健康、環(huán)境保護(hù)、科研教育提供標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)材料,在保證生物安全和保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的前提下，為第三者能夠自由地利用各種微生物材料提供服務(wù)，最大限度的實(shí)現(xiàn)微生物資源的保護(hù)、共享和持續(xù)利用。

第27頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六國(guó)內(nèi)主要的菌種保藏機(jī)構(gòu)3、CICC中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心:

我國(guó)唯一的國(guó)家級(jí)工業(yè)微生物菌種資源保藏管理中心，保藏各種工業(yè)微生物菌種資源包括：細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌和大型真菌，共67個(gè)屬251種，近3000株，庫(kù)藏備份80000余支。/

第28頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)20分，星期六國(guó)內(nèi)主要的菌種保藏機(jī)構(gòu)4、GIMCC廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心:

成立于1987年，隸屬于廣東省微生物研究所