丙二醛檢測試劑盒(TBA微板法)

丙二醛(MDA)檢測試劑盒(TBA微板法)簡介：動物或植物細胞發(fā)生氧化應激(oxidativestress)時，會發(fā)生脂質氧化。丙二醛(Malondialdehyde,MDA)是一種生物體脂質氧化的天然產物，一些脂肪酸氧化后逐漸分解為一系列包括MDA在內的復雜化合物，此時通過檢測MDA的水平即可檢測脂質氧化的水平，因此MDA的測定被廣泛用作脂質氧化的指標。生物體內的一些其它生化反應也會產生MDA，例如thromboxanesynthase也可以催化產生，但只要在測定時設置適當對照即可觀察到脂質氧化水平的變化。丙二醛(MDA)檢測試劑盒(TBA微板法，MDAAssayKit)又稱脂質氧化(MDA)檢測試劑盒，是采用一種基于MDA和硫代巴比妥酸(thiobarbituricacid,TBA)反應產生紅色產物的顯色反應，隨后通過比色法用于對血漿、血清、尿液、動植物組織或細胞裂解液中MDA進行定量檢測，廣泛用于脂質氧化(lipidperoxidation)水平檢測，特別適用于微量樣本的檢測。丙二醛在較高溫度及酸性環(huán)境中可與TBA發(fā)生反應，形成紅色的MDA-TBA加合物，MDA-TBA加合物在處有最大吸收，據此可以通過比色法進行檢測。另外，MDA-TBA加合物也可以在被激發(fā)產生最大發(fā)射波長，據此也可以進行熒光檢測。本試劑盒僅用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。組成：編號TO1011100T40mg5mlStorage名稱試劑(A):TBA試劑(B):TBA稀釋液試劑(C):抗氧化劑試劑(D):MDA標準品(1mmol/L)使用說明書RT避光RT避光0.5ml0.2ml1份4℃-20℃避光自備材料：1、生理鹽水或PBS2、96孔板或離心管、小試管或3、酶標儀或分光光度計4、水浴鍋或恒溫箱5、離心機操作步驟(僅供參考)：1、樣本處理：①血清、血漿、尿液、腦脊液樣本：從待測樣本中分理出的血清或血漿不應有溶血，直接檢測，如超過線性范圍，用生理鹽水稀釋后檢測。②組織、細胞等樣本：組織或細胞可以使用PBS或LeageneWestern及IP細胞裂解液等進行勻漿或裂解。勻漿或裂解組織時，組織重量占勻漿液或裂解液的比例應適當；對于細胞，每106個細胞使用l裂解液或勻漿液。勻漿或裂解后，離心，取上清用于后續(xù)測定。勻漿或裂解等樣品制備步驟宜進行操作。樣品準備完畢后可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，以便于后續(xù)計算單位蛋白重量組織或細胞內的MDA含量。本試劑盒對于樣品中的常見化學成分的兼容性參考下表：試劑類別緩沖液化學成分是否干擾HEPES(100mM)否Borate(50mM)Phosphate(100mM)Tris(25mM)否否否去垢劑CHAPS(≤1%)否否TritonX-100(≤1%)Tween20(≤1%)抑制劑/螯合劑EDTA(≤1mM)EGTA(≤1mM)Antipain(≤100μg/ml)Chymostatin(≤10μg/ml)Leupeptin(≤10μg/ml)Trypsin(≤10μg/ml)其他否否PMSF(≤200μM)否否否否否否Glycerol(≤10%)是否Sucrose(250mM)2、TBA工作液的配制：稱取適量TBA，用TBA稀釋液配制成濃度為0的TBA工作液。例如取TBA用TBA稀釋液配制，最終濃度即為的TBA工作液。TBA工作液需完全溶解后再使用，可以加熱到促溶，并可通過反復劇烈Vortex促溶。配制好的TBA工作液4℃避光保存，至少3－4個月內有效。3、MDA檢測工作液的配制：臨檢測前，根據待測定的樣品數(含對照)，參考下表新鮮配制適量的MDA檢測工作液。檢測次數TBA工作液抗氧化劑1次50μl3μl10次500μl30μl20次1000μl60μlMDA檢測液總體積150μl203μl1500μl2030μl3000μl4060μl4、稀釋標準品：取適量標準品用恰當溶液稀釋至1、2、5、10、20、50μM(如果進行簡易快速檢測，標準品直接稀釋10μM)。注意：待測樣品為血清、血漿時，標準品宜用生理鹽水稀釋；待測樣品由勻漿液、裂解液、PBS獲得時，標準品宜用相同溶液稀釋。其原則是保證空白管、標準管、測定管具有可比性。配制好的MDA標準品4℃避光保存，至少3－4個月內有效。5、樣品測定:在離心管或其它適當容器內加入勻漿液、裂解液、PBS、生理鹽水等適當溶液作為空白對照(注意：待測樣品為血清、血漿時，標準品宜用生理鹽水稀釋；待測樣品由勻漿液、裂解液、PBS獲得時，標準品宜用相同溶液稀釋。其原則是保證空白管、標準管、測定管具有可比性)。加入上述不同濃度標準品用于制作標準曲線(如果進行簡易快速檢測，直接加入濃度為10μM的標準品)，加入樣品用于測定；隨后加入MDA檢測工作液?？蓞⒖枷卤碓O置檢測反應體系，依次加入試劑：加入物質(μl)空白管標準管－測定管－勻漿液、裂解液、PBS、生理鹽水100等標準品－－100－－待測樣品MDA檢測工作液100200200200混勻,加蓋，水浴煮沸，加熱時務必注意避免液體暴沸濺出。如果使用加熱塊(Heatblock)進行加熱注意用重物壓緊離心管蓋；如果使用沸水浴，則需使用可把蓋子鎖死的離心管或螺旋蓋離心管，或用Parafilm封住離心管口，用針頭刺一小孔。最方便和準確的加熱方法是使用帶有熱蓋并可以加熱的金屬浴或者PCR儀。水浴或流水冷卻至室溫，離心。取上清，蒸餾水調零，用酶標儀檢測吸光值，如果不方便測定吸光度，也可以測定之間的吸光度。計算：對于血漿、血清或尿液等樣品可以直接根據標準曲線)計算；如果進行簡易快速檢測，直接以10μM標準品進行計算)獲得MDA的摩爾濃度，對于細胞、或組織樣品，計算出樣品溶液中的MDA含量后，可以通過單位重量的蛋白含量或組織重量等來表示最初樣品中的MDA含量，例如μmol/mg蛋白或μmol/mg組織。簡易快速血清、血漿、尿液等液體樣品中MDA含量計算公式：MDA濃度(μmol/L)=(OD測定-OD空白)/(OD標準-OD空白)×10簡易快速細胞、組織樣品中MDA含量計算公式：MDA濃度(μmol//mg)=(OD測定-OD空白)/(OD標準-OD空白)×10//蛋白質質量濃度(mg/ml)式中：OD測定=待測樣品的吸光度值OD標準=標準品的吸光度值OD空白=空白對照的吸光度值參考區(qū)間：健康成年人血清MDA：9.58±2.15μmol/L健康成年人血漿MDA：7.31±1.27μmol/L注意事項：1、上述低溫試劑避免反復凍融，以免失效或效率下降。2、參考取樣量：血清、血漿、尿液?。坏兔芏戎鞍讘乙喝?；食用油取；肝臟、心肌、肌肉等，取勻漿。3、測定樣品吸光度值較低時，可將水浴延長，但應同時延長，以免造成批間差異。4、待測樣本如不能