N(as)實時熒光定量PCR課件

實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR1Outline實時熒光定量PCR基本原理實時熒光定量PCR的實驗設計和數(shù)據(jù)處理實時熒光定量PCR在臨床和科研上的應用實時熒光定量PCR實驗實例Outline實時熒光定量PCR基本原理2實時熒光定量PCR基本原理實時熒光定量PCR基本原理3常規(guī)vs實時常規(guī)PCR：借助電泳對擴增反應的終產(chǎn)物進行半定量及定性分析實時熒光定量PCR技術：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對起始模板的定量分析MJResearch常規(guī)vs實時常規(guī)PCR：借助電泳對擴增反應的終產(chǎn)物進行半定量4常規(guī)vs實時優(yōu)缺點比較優(yōu)勢來自：實驗數(shù)據(jù)及定量分析方法熒光實時監(jiān)測產(chǎn)物濃度實時熒光定量PCR常規(guī)PCR熒光實時分析每一次循環(huán)產(chǎn)物凝膠電泳分析終產(chǎn)物精確計算初始模板濃度，靈敏度高，檢測單拷貝模板通過終產(chǎn)物定性分析模板濃度計算機自動紀錄分析檢測方法費時費力常規(guī)vs實時優(yōu)缺點比較實時熒光定量PCR常規(guī)PCR熒光實時分5實驗數(shù)據(jù)指數(shù)擴增期實時熒光PCR熒光曲線圖循環(huán)數(shù)，熒光值指數(shù)擴增期數(shù)學規(guī)律非指數(shù)擴增期擴增產(chǎn)物熒光曲線背景期實驗數(shù)據(jù)指數(shù)擴增期實時熒光PCR熒光曲線圖非指數(shù)擴增期擴增產(chǎn)6PCR的數(shù)學知識理想的PCR反應：Xn=X0×2n非理想的PCR反應：Xn=X0(1+Ex)n方程式兩邊同時取對數(shù)得:

logXn=log(X0(1+Ex)n) 整理方程式得:

logX0=(-log(1+Ex))×n+logXnn：擴增反應的循環(huán)次數(shù)Xn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴增效率PCR的數(shù)學知識理想的PCR反應：n：擴增反應的循環(huán)次數(shù)7閾值與C(t)值閾值(Xn)：熒光擴增曲線指數(shù)增長期設定一個熒光強度標準（PCR擴增產(chǎn)物量的標準）C(t)值(n)：熒光信號（擴增產(chǎn)物）到達閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04閾值與C(t)值閾值(Xn)：熒光擴增曲線指數(shù)增長期設定一個8PCR的數(shù)學知識理想的PCR反應：Xn=X0×2n非理想的PCR反應：Xn=X0(1+Ex)n方程式兩邊同時取對數(shù)得:

logXn=log(X0(1+Ex)n) 整理方程式得:

logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn將C(t)和達到C(t)值時終產(chǎn)物的量Xc(t)帶入上式得： logX0=(-log(1+Ex))*C(t)+logXc(t)初始濃度的對數(shù)與循環(huán)數(shù)呈線性關系n：擴增反應的循環(huán)次數(shù)Xn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴增效率PCR的數(shù)學知識理想的PCR反應：n：擴增反應的循環(huán)次數(shù)9C(t)值的重現(xiàn)性相同模板在同一臺PCR儀上相同條件下重復96次擴增的擴增曲線圖終點處檢測產(chǎn)物量不恒定；C(t)值具重現(xiàn)性C(t)值的重現(xiàn)性相同模板在同一臺PCR儀上相同條件下重復910熒光強度---循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對數(shù)---C(T)循環(huán)數(shù)標準曲線10410310610510210C(t)與初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)與初始模板濃度的對數(shù)值成線性關系熒光強度---循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對數(shù)---C(T)循環(huán)數(shù)標11定量原理濃度的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)就可計算出樣品中所含的模板量定量原理濃度的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關系，根據(jù)樣品擴增達到域值12熒光化學監(jiān)測熒光化學物質(zhì)反應產(chǎn)物濃度熒光監(jiān)測方法分類非特異性SYBRGreenI特異性MolecularBeaconTaqMan熒光化學監(jiān)測熒光化學物質(zhì)反應產(chǎn)物濃度13SYBRGreenI結(jié)合雙鏈DNA分子小溝延伸結(jié)束，形成雙鏈DNA，SYBRGreen結(jié)合到雙螺旋小溝中，當受到適合光源激發(fā)，發(fā)射出熒光，反映產(chǎn)物濃度優(yōu)點使用方便，無需復雜的設計無序列特異性，可用于不同模板便宜，靈敏缺點與非特異性產(chǎn)物結(jié)合，干擾實驗結(jié)果SYBRGreenI結(jié)合雙鏈DNA分子小溝14MolecularBeacon頸環(huán)結(jié)構(gòu)，與特異產(chǎn)物配對熒光素，淬滅劑FRET（熒光諧振能量傳遞）優(yōu)點對目標序列有很高的特異性低背景缺點設計復雜只能用于一個特定目標價格較高MolecularBeacon頸環(huán)結(jié)構(gòu)，與特異產(chǎn)物配對15TaqMan水解型熒光素，淬滅劑FRET（熒光諧振能量傳遞）識別特異性產(chǎn)物優(yōu)點對目標序列特異性高設計相對MolecularBeacon簡單缺點只適用于一個目標價格較高探針5‘端不能是G（切下后淬滅）TaqMan水解型16熒光化學監(jiān)測方式總結(jié)化學試劑工作原理有否淬滅劑信號檢測主要應用范圍SYBRGreenI結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中否延伸熔解曲線分析定量和檢測目標基因MolecularBeacon發(fā)夾型雜交探針有復性SNP分析定量和檢測目標基因TaqMan水解型雜交探針（5‘-3’外切）有任何步驟SNP分析定量和檢測目標基因熒光化學監(jiān)測方式總結(jié)化學試劑工作原理有否淬滅劑信號檢測主要應17小結(jié)實時熒光定量PCR各種熒光監(jiān)測方法的原理實時熒光數(shù)據(jù)結(jié)果的初步分析C(t)值線性關系小結(jié)實時熒光定量PCR18實時熒光定量PCR的實驗設計和數(shù)據(jù)處理絕對定量與相對定量實時熒光定量PCR的實驗設計和數(shù)據(jù)處理絕對定量與相對定量19絕對定量與相對定量絕對定量：精確的計算初始反應的模板濃度（DNA，RNA）病毒DNA或RNA的拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)相對定量：計算初始反應模板的相對含量差異表達分析芯片評估轉(zhuǎn)基因生物的檢測基因型檢測絕對定量與相對定量絕對定量：精確的計算初始反應的模板濃度（D20實時熒光PCR絕對定量方法標準品，標準曲線已知濃度的相應DNA模板，按不同濃度稀釋根據(jù)實時PCR反應得到相應的C(t)，構(gòu)建標準曲線樣品與標準品同時進行PCR反應得到未知濃度樣品的C(t)值unknown104103實時熒光PCR絕對定量方法標準品，標準曲線unknown1021SYBRGreenI方法SYBRGreenI方法22反應體系的建立按照常規(guī)PCR方法配制反應體系，并加入SYBR染料程序1.95c5min2.95c20sec3.60c20sec4.72c20sec5.ReadPlate6.Goto2repeat397.72c5min8.4cforever9.End問題：PCR的不特異性產(chǎn)物；SYBRGreenI的非特異結(jié)合解決：熔鏈曲線分析，決定讀板溫度Meltingcurveanalysis反應體系的建立按照常規(guī)PCR方法配制反應體系，并加入SYBR23熔鏈曲線分析逐步提高溫度，讀取熒光值，得到溫度與熒光值的關系曲線溫度熒光強度TmTm值：DNA解鏈一半時的溫度-dIdTTm熔鏈曲線分析逐步提高溫度，讀取熒光值，得到溫度與熒光值的關系24熔鏈曲線分析決定讀板溫度Non-specificproductspecificproductspecificproduct熔鏈曲線分析決定讀板溫度Non-specificprodu25優(yōu)化的程序1.95c5min2.95c20sec3.60c20sec4.72c20sec5.ReadPlate6.85c1sec7.ReadPlate8.Goto2repeat399.72c5min10.Meltingcurveanalysis11.End優(yōu)化的程序1.95c5min26使用實時熒光定量PCR進行絕對定量的優(yōu)勢敏感性高檢測低拷貝數(shù)樣品：單拷貝區(qū)分小差異樣品：24，48，96，……大范圍拷貝數(shù)樣品同時檢測100—1010省時有效使用實時熒光定量PCR進行絕對定量的優(yōu)勢敏感性高27實時熒光相對定量相對定量的目的比較基因在不同情況下的表達差異（倍數(shù)關系）相對定量的問題解決樣品材料不均一造成的差別解決加樣過程中的差別內(nèi)標基因內(nèi)標通常是b-actin、GAPDH基因等看家基因它們在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響較小對目的基因進行均一化：目的基因拷貝／每一個內(nèi)標基因拷貝實時熒光相對定量相對定量的目的28實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR29Outline實時熒光定量PCR基本原理實時熒光定量PCR的實驗設計和數(shù)據(jù)處理實時熒光定量PCR在臨床和科研上的應用實時熒光定量PCR實驗實例Outline實時熒光定量PCR基本原理30實時熒光定量PCR基本原理實時熒光定量PCR基本原理31常規(guī)vs實時常規(guī)PCR：借助電泳對擴增反應的終產(chǎn)物進行半定量及定性分析實時熒光定量PCR技術：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對起始模板的定量分析MJResearch常規(guī)vs實時常規(guī)PCR：借助電泳對擴增反應的終產(chǎn)物進行半定量32常規(guī)vs實時優(yōu)缺點比較優(yōu)勢來自：實驗數(shù)據(jù)及定量分析方法熒光實時監(jiān)測產(chǎn)物濃度實時熒光定量PCR常規(guī)PCR熒光實時分析每一次循環(huán)產(chǎn)物凝膠電泳分析終產(chǎn)物精確計算初始模板濃度，靈敏度高，檢測單拷貝模板通過終產(chǎn)物定性分析模板濃度計算機自動紀錄分析檢測方法費時費力常規(guī)vs實時優(yōu)缺點比較實時熒光定量PCR常規(guī)PCR熒光實時分33實驗數(shù)據(jù)指數(shù)擴增期實時熒光PCR熒光曲線圖循環(huán)數(shù)，熒光值指數(shù)擴增期數(shù)學規(guī)律非指數(shù)擴增期擴增產(chǎn)物熒光曲線背景期實驗數(shù)據(jù)指數(shù)擴增期實時熒光PCR熒光曲線圖非指數(shù)擴增期擴增產(chǎn)34PCR的數(shù)學知識理想的PCR反應：Xn=X0×2n非理想的PCR反應：Xn=X0(1+Ex)n方程式兩邊同時取對數(shù)得:

logXn=log(X0(1+Ex)n) 整理方程式得:

logX0=(-log(1+Ex))×n+logXnn：擴增反應的循環(huán)次數(shù)Xn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴增效率PCR的數(shù)學知識理想的PCR反應：n：擴增反應的循環(huán)次數(shù)35閾值與C(t)值閾值(Xn)：熒光擴增曲線指數(shù)增長期設定一個熒光強度標準（PCR擴增產(chǎn)物量的標準）C(t)值(n)：熒光信號（擴增產(chǎn)物）到達閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04閾值與C(t)值閾值(Xn)：熒光擴增曲線指數(shù)增長期設定一個36PCR的數(shù)學知識理想的PCR反應：Xn=X0×2n非理想的PCR反應：Xn=X0(1+Ex)n方程式兩邊同時取對數(shù)得:

logXn=log(X0(1+Ex)n) 整理方程式得:

logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn將C(t)和達到C(t)值時終產(chǎn)物的量Xc(t)帶入上式得： logX0=(-log(1+Ex))*C(t)+logXc(t)初始濃度的對數(shù)與循環(huán)數(shù)呈線性關系n：擴增反應的循環(huán)次數(shù)Xn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴增效率PCR的數(shù)學知識理想的PCR反應：n：擴增反應的循環(huán)次數(shù)37C(t)值的重現(xiàn)性相同模板在同一臺PCR儀上相同條件下重復96次擴增的擴增曲線圖終點處檢測產(chǎn)物量不恒定；C(t)值具重現(xiàn)性C(t)值的重現(xiàn)性相同模板在同一臺PCR儀上相同條件下重復938熒光強度---循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對數(shù)---C(T)循環(huán)數(shù)標準曲線10410310610510210C(t)與初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)與初始模板濃度的對數(shù)值成線性關系熒光強度---循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對數(shù)---C(T)循環(huán)數(shù)標39定量原理濃度的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)就可計算出樣品中所含的模板量定量原理濃度的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關系，根據(jù)樣品擴增達到域值40熒光化學監(jiān)測熒光化學物質(zhì)反應產(chǎn)物濃度熒光監(jiān)測方法分類非特異性SYBRGreenI特異性MolecularBeaconTaqMan熒光化學監(jiān)測熒光化學物質(zhì)反應產(chǎn)物濃度41SYBRGreenI結(jié)合雙鏈DNA分子小溝延伸結(jié)束，形成雙鏈DNA，SYBRGreen結(jié)合到雙螺旋小溝中，當受到適合光源激發(fā)，發(fā)射出熒光，反映產(chǎn)物濃度優(yōu)點使用方便，無需復雜的設計無序列特異性，可用于不同模板便宜，靈敏缺點與非特異性產(chǎn)物結(jié)合，干擾實驗結(jié)果SYBRGreenI結(jié)合雙鏈DNA分子小溝42MolecularBeacon頸環(huán)結(jié)構(gòu)，與特異產(chǎn)物配對熒光素，淬滅劑FRET（熒光諧振能量傳遞）優(yōu)點對目標序列有很高的特異性低背景缺點設計復雜只能用于一個特定目標價格較高MolecularBeacon頸環(huán)結(jié)構(gòu)，與特異產(chǎn)物配對43TaqMan水解型熒光素，淬滅劑FRET（熒光諧振能量傳遞）識別特異性產(chǎn)物優(yōu)點對目標序列特異性高設計相對MolecularBeacon簡單缺點只適用于一個目標價格較高探針5‘端不能是G（切下后淬滅）TaqMan水解型44熒光化學監(jiān)測方式總結(jié)化學試劑工作原理有否淬滅劑信號檢測主要應用范圍SYBRGreenI結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中否延伸熔解曲線分析定量和檢測目標基因MolecularBeacon發(fā)夾型雜交探針有復性SNP分析定量和檢測目標基因TaqMan水解型雜交探針（5‘-3’外切）有任何步驟SNP分析定量和檢測目標基因熒光化學監(jiān)測方式總結(jié)化學試劑工作原理有否淬滅劑信號檢測主要應45小結(jié)實時熒光定量PCR各種熒光監(jiān)測方法的原理實時熒光數(shù)據(jù)結(jié)果的初步分析C(t)值線性關系小結(jié)實時熒光定量PCR46實時熒光定量PCR的實驗設計和數(shù)據(jù)處理絕對定量與相對定量實時熒光定量PCR的實驗設計和數(shù)據(jù)處理絕對定量與相對定量47絕對定量與相對定量絕對定量：精確的計算初始反應的模板濃度（DNA，RNA）病毒DNA或RNA的拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)相對定量：計算初始反應模板的相對含量差異表達分析芯片評估轉(zhuǎn)基因生物的檢測基因型檢測絕對定量與相對定量絕對定量：精確的計算初始反應的模板濃度（D48實時熒光PCR絕對定量方法標準品，標準曲線已知濃度的相應DNA模板，按不同濃度稀釋根據(jù)實時PCR反應得到相應的C(t)，構(gòu)建標準曲線樣品與標準品同時進行PCR反應得到未知濃度樣品的C(t)值unknown104103實時熒光PCR絕對定量方法標準品，標準曲線unknown1049SYBRGreenI方法SYBRGreenI方法50反應體系的建立按照常規(guī)PCR方法配制反應體系，并加入SYBR染料程序1.95c5min2.95c20sec3.60c20sec4.72c20sec5.ReadPlate6.Goto2repeat397.72c5min8.4cforever9.End問題：PCR的不特異性產(chǎn)物；SYBRGree