生物化學(xué)-2017核酸雜交

分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)在分子水平上

命現(xiàn)象的科學(xué)生物大分子(核酸、蛋白質(zhì))的結(jié)構(gòu)、功能和生等方面來闡明各種生命現(xiàn)象并加以應(yīng)用（疾?。┘夹g(shù)解決問題的方法及其原理生物大分子（

）獲取與鑒定技術(shù)核酸與蛋白質(zhì)分離純化、文庫、、分子雜交的擴(kuò)增（DNA克隆-重組DNA，PCR)高通量（

）功能研究技術(shù)超表達(dá)，觀察表型、RNAi干擾技術(shù)生物大分子相互作用（酵母雙雜交、CHIP、EMSA)蛋白表達(dá)與抗體蛋白在細(xì)胞中的定位編輯技術(shù)（crispr/cas9，NgAgo-gDNA？）應(yīng)用與

治療生物分子（核酸）雜交技術(shù)

Nucleic

acidhybridization內(nèi)容分子雜交概述核酸探針雜交信號(hào)的檢測核酸分子雜交的類型核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)的影響因素與優(yōu)化技術(shù)第一節(jié)分子雜交概述加熱變性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性變性是指某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程。解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結(jié)合起來,形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復(fù),這稱DNA復(fù)性,也叫退火。復(fù)習(xí)DNA變性的方法：熱變性：溫度升高到90~100℃酸堿變性：pH值低于3或高于10化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、等變性后的理化性質(zhì)變化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加（增色效應(yīng)）復(fù)習(xí)增色效應(yīng)(hyperchromiceffect)：DNA變性時(shí)其溶液OD260增高的現(xiàn)象。DNA解鏈時(shí)的紫外吸收變化復(fù)習(xí)DNA的解鏈曲線(溶解曲線)連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度相對(duì)于

A260值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線解鏈溫度(meltingtemperature，Tm)解鏈過程中，紫外吸光度的變化達(dá)到最大變化值的一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度。復(fù)習(xí)影響Tm值的因素：Tm不是一個(gè)固定的數(shù)值，它與很多因素有關(guān)：外部因素：pH、離子強(qiáng)度。隨著溶劑內(nèi)離子強(qiáng)度上升，Tm值也隨著增大。因素：DNA的堿基比例、DNA的均一性；在相同條件下，DNA內(nèi)G-C配對(duì)含量高，其Tm值也高。復(fù)習(xí)復(fù)性過程單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈局部雙鏈周圍的堿基如不配對(duì)時(shí)，雙鏈重新解離局部雙鏈周圍的堿基如配對(duì)，則形成中心序列形成完整的雙鏈分子影響復(fù)性速度的因素DNA濃度段的大小DN溫度溶液的離子強(qiáng)度DNA順序的復(fù)雜性核酸的分子雜交將帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應(yīng)的同源區(qū)段就會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如果退火的核酸來自不同的生物有機(jī)體，所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。雜化雙鏈

(heteroduplex)核酸分子雜交技術(shù)具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下

按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火形成雙鏈的過程。

雜交的雙方是待測核酸（目的

）和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。探針(序列已知，單鏈)待測核苷酸序列(單鏈)核酸分子雜交技術(shù)1961年,Hall等-------液相雜交探針與靶序列在溶液中雜交，通過平衡密度梯度離心分離雜交體1962年,Bolton等設(shè)計(jì)了第一種簡單的固相雜交方法，稱為DNA-瓊脂技術(shù)。變性DNA固定在瓊脂中，DNA不能復(fù)性，但能與其它互補(bǔ)核酸序列雜交。用放射性標(biāo)記的短DAN或RNA分子與膠中DNA雜交過夜，然后將膠置于柱中進(jìn)行漂洗，去除游離探針，在高溫、低鹽條件下將結(jié)合的探針洗脫，洗脫液的放射性與結(jié)合的探針量呈正比。核酸分子雜交技術(shù)發(fā)展歷程核酸分子雜交技術(shù)發(fā)展歷程組60年代末，Britten等設(shè)計(jì)了另一種分析細(xì)胞的方法。從不同生物體（細(xì)菌、酵母等）內(nèi)分離DNA，用水壓器剪切成長約450核苷酸（nt）的片段。剪切的DNA液，經(jīng)煮沸使dsDNA熱變性成ssDNA。然后冷至約60℃，在此溫度孵育過程中，測定溶液一定時(shí)間內(nèi)的UV260nm的吸光度（減色效應(yīng)）來監(jiān)測互補(bǔ)鏈的復(fù)性程度。第二節(jié)核酸探針（Probe）探針從化學(xué)和生物學(xué)意義上理解，探針是一種分子，它帶有供反應(yīng)后檢測的合適標(biāo)記物，并與特異靶分子反應(yīng)。探針技能，它是指利用標(biāo)記分子對(duì)其它分子的識(shí)別性而實(shí)現(xiàn)對(duì)其它分子進(jìn)行檢測的一種技能含標(biāo)記物的分子-----探針用放射性核素、生物素或熒光

標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。核酸探針技術(shù)DNA探針最常用，長度在幾百堿基對(duì)以上的單鏈或雙鏈DNA組DNA探針：如

DNAcDNA探針：互補(bǔ)于mRNA的DNA分子,最常用寡核苷酸探針：10-50bp，

、點(diǎn)突變RNA探針特異性強(qiáng)，但RNA極易降解，不宜操作核酸探針的種類DNA探針的特點(diǎn)：探針多已克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，

方法簡便。不易降解（相對(duì)RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。能用于同位素和非同位素標(biāo)記。DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法等探針標(biāo)記標(biāo)記物是什么？怎樣加上去？（探針標(biāo)記法）如何檢測雜交信號(hào)檢測探針標(biāo)記物理想探針標(biāo)記物應(yīng)具備的特性：高度靈敏性不影響堿基配對(duì)的特異性不影響探針分子的主要理化性質(zhì)對(duì)酶促反應(yīng)活性無影響或影響不大檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性放射性標(biāo)記物非放射性標(biāo)記物放射性標(biāo)記物----放射性核素放射性核素能產(chǎn)生射線,將核素標(biāo)記在核酸所必需的NTP或dNTP上，通過一定方法摻入到DNA或RNA中去制成探針，與待測的核酸雜交后，核素產(chǎn)生的或射線可使底片感光的特性，通過放射自顯影的方法進(jìn)行檢測。產(chǎn)生射線的核素：32P、3H、35S,如：[32P]dATP產(chǎn)生射線的核素：125I常用的放射性核素32P：產(chǎn)生射線，靈敏度高，分辨率強(qiáng)，是最常用的放射性標(biāo)記物，但半衰期短（14.3天），位和位標(biāo)記。35S：分辨率高、半衰期長（87.1天），敏感度低放射性標(biāo)記物的缺點(diǎn)放射性污染成本高：半衰期短，不能長期保存半抗原：地高辛配體：生物素是親和素的配體熒光素：異硫

酸熒光素、

等化學(xué)發(fā)光探針：標(biāo)記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光，生物素?；膲A性磷酸酶可使發(fā)光底物發(fā)光常用的非放射性標(biāo)記物地高辛甙元又稱異羥基洋地黃毒甙元，是一種類固醇半抗原分子采用人工方法可以將地高辛的線型間隔臂與dUTP連接起來,形成DIG-11-dUTPDIG-11-dUTP-----通過一定方法摻入到DNA中去制成探針----雜交----加抗地高辛-酶的復(fù)合物----加底物顯色靈敏度較高：0.1pg特異性較生物素高是較理想的非放射性標(biāo)記物地高辛甙元生物素：1-2pg生物素化核苷酸----通過酶觸反應(yīng)摻入到DNA中去制成探針----雜交----生物素-抗生物素蛋白-酶的復(fù)合物----加底物顯色生物素化核苷酸：bio-16-dUTPbio-11-dUTP光敏生物素：生物素與光敏基團(tuán)結(jié)合----光敏生物素-----光敏生物素與核酸探針混合----在強(qiáng)光的作用下----光敏基團(tuán)與核酸共價(jià)結(jié)合---生物素標(biāo)記的探針生物素化的核苷酸和光敏生物素生物素光敏基團(tuán)優(yōu)點(diǎn)無放射性污染成本低、操作簡單缺點(diǎn)敏感性、特異性均低于放射性核素非放射性標(biāo)記物探針標(biāo)記方法體內(nèi)標(biāo)記法：將核素標(biāo)記的化合物作為代謝的底物，在細(xì)胞

代謝時(shí)使

核素?fù)饺氲叫?/p>

的核酸分子中，如3H-胸苷可摻入到DNA中，3H-尿苷可摻入到RNA中探針體外標(biāo)記法化學(xué)標(biāo)記法標(biāo)記物分子上的活性

與探針分子上的某些

反應(yīng)，標(biāo)記物直接結(jié)合到探針分子上酶促標(biāo)記法標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記核苷酸，然后利用酶促法將標(biāo)記的核苷酸摻入到探針上探針的酶促標(biāo)記法缺口翻譯法（nick

translation）或切口平移隨機(jī)引物法（random

priming)末端標(biāo)記法(end-labeling)其他PCR標(biāo)記法cDNA探針的標(biāo)記（反轉(zhuǎn)錄

單鏈cDNA探針）RNA探針的標(biāo)記（體外轉(zhuǎn)錄的方法）小片段323個(gè)氨基酸5

核酸外切酶活性大片段/Klenow

片段

604個(gè)氨基酸

DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N

端C

端木瓜蛋白酶DNA-pol

ⅠKlenow片段是

DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。切口平移法（nicktranslation)利用DNase

I在DNA雙鏈上造成單鏈切口利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的53核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5末端逐步切除在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互補(bǔ)的DNA單鏈為模板依次將dNTP連接到切口的3末端-OH上，

新的DNA鏈，同時(shí)將標(biāo)記的核苷酸摻入到新的DNA鏈中缺口平移法的特點(diǎn)快速、簡便、標(biāo)記的探針均一、特異性高僅適用于較長的雙連DNADNA多聚酶必須是E.ColiDNA多聚酶的全酶DNA酶I的濃度一定要適宜隨機(jī)引物法（random priming

)原理是隨機(jī)引物能與各種單鏈DNA模板結(jié)合，作為新鏈的引物，在DNA聚合酶E.coli

DNA聚合酶I的Klenow大片段的催化下，按53方向

一新的DNA鏈，其核苷酸序列與模板DNA完全互補(bǔ)。時(shí)，帶標(biāo)記的核苷酸摻入到新

的DNA分子中隨機(jī)引物法的特點(diǎn)：能進(jìn)行雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA探針的標(biāo)記操作簡單方便，避免因DNaseI處理濃度掌握不當(dāng)所帶來的一系列問題標(biāo)記活性高，標(biāo)記活性可達(dá)108cpm/μgDNA以上可直接在低

瓊脂糖溶液中進(jìn)行標(biāo)記末端標(biāo)記法將標(biāo)記物導(dǎo)入線型DNA或RNA的3’末端或5’末端的一類標(biāo)記法，可分為5’末端標(biāo)記法3’末端標(biāo)記法T4聚合酶替代法5’末端標(biāo)記法最常用的標(biāo)記物是[γ32P]ATP。T4多聚核苷酸激酶能特異地將[γ32P]ATP中的32P轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5’—OH末端，而大多數(shù)DNA或RNA的5’端都因磷酸化而含有磷酸基團(tuán)。因此標(biāo)記前要先用堿性磷酸酶去掉磷酸基團(tuán)。末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal

deoxynucleotidyl

traferase，TdT)催化標(biāo)記的dNTP加到單鏈或雙鏈DNA的3’末端上3’末端標(biāo)記法T4聚合酶替代法：在缺乏核苷酸的情況下，利用DNA聚合酶從3’→5’端對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行水解，產(chǎn)生帶凹缺的3’端DNA分子，加入4種核苷酸，DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性受抑，在5’→3’聚合酶活性的作

用下，DNA分子開始修復(fù)，帶有標(biāo)記的核苷酸就摻人到修復(fù)的3’端片段中。探針的純化乙醇沉淀法無水乙醇可以沉淀DN段，可去除dNTP和蛋白質(zhì)凝膠過濾柱層析法利用凝膠的分子篩作用，將大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根離子及寡核苷酸（<80bp)等物質(zhì)分離，常用凝膠基質(zhì)是

Sephadex

G-50微柱離心法其原理與上述凝膠過濾柱層析法相同，不同的是上述采用洗脫的方式純化探針，而此法則是利用離心的方式來純化探針第三節(jié)雜交信號(hào)檢測放射性核素探針的檢測放射自顯影利用放射線在X線片上成影作用來檢測雜交信號(hào)，稱為放射自顯影。放射性同位素所發(fā)射出來的帶電離子(β粒子)作用于感

光材料的鹵化銀晶體，從而產(chǎn)生潛影，這種潛影可用顯影液顯示，成為可見的"像"非放射性核素探針的檢測偶聯(lián)反應(yīng)顯色反應(yīng)非放射性核素探針的檢測偶聯(lián)反應(yīng)半抗原——通過抗原-抗體反應(yīng)與顯色體系偶聯(lián)。地高辛-抗地高辛-酶的復(fù)合物配體——親和法與顯色體系偶聯(lián)：生物素-抗生物素蛋白-酶（Avidin-plex

，ABC）顯色反應(yīng)：通過連接在抗體或生物素蛋白的顯色物質(zhì)如酶、熒光素等進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測。酶學(xué)檢測：酶促反應(yīng)使底物形成有色產(chǎn)物。最常用辣根過氧化物酶（

HRP

）堿性磷酸酶（AKP

）酸性磷酸酶β–半乳糖苷酶AKP靈敏度和分辨率較HRP高約10倍左右，但HRP的優(yōu)點(diǎn)為價(jià)廉、穩(wěn)定。地高辛標(biāo)記探針的檢測抗地高辛抗體－堿性磷酸酶復(fù)合物＋底物（BCIP+NBT)紫色的不溶性化合物生物素標(biāo)記探針的檢測辣根過氧化物酶＋

底物（ＤＡＢ）抗生物素蛋白生物素棕褐色不溶性的化合物顯色反應(yīng)：熒光檢測：異硫

酸熒光素（FITC）和

，可被紫外線激發(fā)出熒光而被檢測到。主要應(yīng)用于原位雜交?；瘜W(xué)發(fā)光法：在化學(xué)反應(yīng)過程中伴隨的發(fā)光反應(yīng)。目前常用的是（

HRP）催化

（luminol）伴隨的發(fā)光反應(yīng)。適合于Southern、Northern及斑點(diǎn)雜交。電子密度標(biāo)記：利用重金屬的高電子密度、在電子顯微鏡下進(jìn)行檢測，適合于細(xì)胞原位雜交。第四節(jié)核酸分子雜交類型按核酸分子雜交環(huán)境大致分為:液相雜交待測核酸和探針都存在于雜交液中，堿基互補(bǔ)的單鏈核酸分子在液體中配對(duì)形成雜交分子的過程。雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為和誤差較高。RNA酶保護(hù)分析法核酸酶S1保護(hù)分析法固相雜交---最常用固相雜交：根據(jù)支持物的不同又可分為：濾膜雜交（印跡雜交）Southern

印跡法Northern

印跡法Western

印跡法斑點(diǎn)雜交菌落原位雜交組織原位雜交理想的固相支持物（濾膜）應(yīng)具備的特性具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力不影響與探針的雜交反應(yīng)與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固具有良好的機(jī)械性能非特異吸附少常用的濾膜硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)（在高離子強(qiáng)度下，單連DNA和RNA的能力：80-100ug/cm2）雜交信號(hào)本底低。缺點(diǎn)是DNA分子結(jié)合不牢固尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高化學(xué)活化膜：段有同等優(yōu)點(diǎn)：DNA與膜共價(jià)結(jié)合；對(duì)不同大小的DN結(jié)合能力；缺點(diǎn)：結(jié)合能力較上述兩種膜低大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都必須通過毛細(xì)管或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上而且是按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地“吸印”上去的，這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。印跡雜交技術(shù)印跡雜交操作基本流程印跡轉(zhuǎn)移將分離的核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上雜交將具有核酸印跡的濾膜與帶有標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交Southern

blottingDNA印跡與雜交1975年，英國Edwen

Southern創(chuàng)建定義：檢測DNA雜交方法，即將DNA電泳分離、轉(zhuǎn)印到固相支持物上，用探針進(jìn)行檢測的方

法。應(yīng)用：

組DNA的定性和定量分析、

診斷、分子克隆、法醫(yī)學(xué)等Southern

blotting的主要步驟（8步）待測DNA樣品的

、酶切待測DNA樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳凝膠中DNA的變性：堿變性Southern轉(zhuǎn)膜(印跡)：毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法探針Southern雜交(預(yù)雜交、雜交)洗膜（除去游離探針）雜交信號(hào)檢測標(biāo)記的探針1、待測DNA樣品的

、酶切DNA的提取原理：裂解細(xì)胞，使DNA

，交替使用酚、氯仿兩種蛋白質(zhì)變性劑，有效去除蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)程序：酚——酚-氯仿——氯仿。步驟解析2.待測DNA樣品的電泳分離瓊脂糖凝膠電泳3.凝膠中DNA的變性：堿變性凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的單鏈DNA，中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液。4.Southern轉(zhuǎn)膜(印跡)待測定核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（如纖維素膜）上，即印跡。Southern印跡的常用方法（1）毛細(xì)管虹吸印跡法其基本原理是：利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的DN

段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的DN 段移出凝膠而滯留在膜上。重物玻璃板吸水紙濾紙凝膠鹽橋毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法（

Southern轉(zhuǎn)印）（2）電轉(zhuǎn)法利用電場的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。轉(zhuǎn)移快（3）真空轉(zhuǎn)移法此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個(gè)真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時(shí)帶動(dòng)核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。較毛細(xì)管虹轉(zhuǎn)移更為有效，快捷各種轉(zhuǎn)移方法的比較毛細(xì)管虹吸法操作簡便，不需要特殊轉(zhuǎn)移儀器，但轉(zhuǎn)移效率低,（擴(kuò)散法為70%，毛細(xì)管法80%）耗時(shí)多。電轉(zhuǎn)移法效率高，耗時(shí)少，需特殊轉(zhuǎn)移儀，對(duì)轉(zhuǎn)移條件要求較嚴(yán)。真空轉(zhuǎn)移法效率高，耗時(shí)最少，需特殊真空轉(zhuǎn)移儀。6、Southern雜交預(yù)雜交：固相膜可結(jié)合DNA,包括探針

封閉固相膜上多余的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液（常用非特異性DNA或蛋白質(zhì)）雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測DNA雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交5.

探針建立雜交條件需要考慮的因素離子強(qiáng)度：一般，探針長500bp，G+C含量為５０％，離子強(qiáng)度為５x

SSC；雜交液中不含甲酰胺，Tm值為93.4Ｃ，雜交溫度68

Ｃ，含甲酰胺，Tm值為68.4

Ｃ，雜交溫度42.4

Ｃ雜交溫度：雜交反應(yīng)在低于Tm值15-25

Ｃ溫度下進(jìn)行減少非特異性雜交反應(yīng)：預(yù)雜交7.洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的

DNA離子強(qiáng)度：0.1x

SCC洗膜溫度：低于

Tm值

5-12

C探針長500bp，G+C含量42%,離子強(qiáng)度0.1xSSC,不含甲跣胺，Tm值為67Ｃ，則洗膜溫度為55-62

Ｃ.8.

雜交信號(hào)的檢測Northern印跡雜交Northernblot印跡雜交是指待測RNA樣品經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到固定支持物上，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行固-液相雜交?；驹砗突具^程與Southern

blot基本相同鑒別RNA探針可用DNA或RN

段待測樣品為總RNA或mRNANorthern印跡與Southern印跡的不同點(diǎn)變性：>RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑（凝膠中加保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性轉(zhuǎn)膜