21微生物的實驗室培養(yǎng)優(yōu)質(zhì).的課件

課題1：微生物的實驗室培養(yǎng)1.了解有關(guān)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識；2.掌握無菌操作技術(shù)；3.了解純化大腸桿菌的基礎(chǔ)知識。到目前為止，幾十項Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎，化學(xué)獎都與微生物學(xué)有關(guān)2.微生物包括五類：病毒細(xì)菌放線菌真菌原生動物

原核生物界

原生生物界真菌界病毒界1.微生物：是一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱．細(xì)菌的外形與大小圖1-1常見的三種細(xì)菌典型形態(tài)A.球菌

B.桿菌C.弧菌芽孢有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細(xì)菌。孢子細(xì)菌、原生動物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖作用的生殖細(xì)胞。能直接發(fā)育成新個體。

單個或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。3.功能：1.定義：菌落鑒定菌種的重要依據(jù)菌落細(xì)菌的菌落特征因種而異放線菌1、結(jié)構(gòu)：單細(xì)胞原核分支狀的菌絲（基內(nèi)菌絲、氣生菌絲）鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素微生物中發(fā)現(xiàn)了幾千種抗生素，其中2/3是由放線菌產(chǎn)生的應(yīng)用:培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。（一）培養(yǎng)基的類型及其應(yīng)用：固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基加入瓊脂較多加入瓊脂較少不加入瓊脂微生物分離,鑒定,計數(shù)，活菌保存觀察微生物的運動，分類，鑒定工業(yè)生產(chǎn)半固體培養(yǎng)基：無動力有動力(彌散)(是否運動)

液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長

根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。

優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。

缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。合成培養(yǎng)基:

天然培養(yǎng)基有血清、血漿和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限；成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析；易發(fā)生支原體污染。天然培養(yǎng)基：血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子；

③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子

⑥轉(zhuǎn)移蛋白

⑦不明成分

人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基:鑒別培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入伊紅-美藍(lán):用于大腸桿菌的鑒別在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑：用于分解尿素細(xì)菌的鑒定分離酵母菌、霉菌等真菌分離固氮菌分離自養(yǎng)型微生物

（二）.培養(yǎng)基：微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)1.基本成分：碳源、氮源、水、無機(jī)鹽⑴碳源無機(jī)碳源：有機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無機(jī)氮源：有機(jī)氮源：N2、NH3、NH4＋、NO3-（為硝化細(xì)菌提供N源和能源）牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含CHON的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源思考：微生物“吃”什么？2.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方

(參考教材附錄內(nèi)容P83)

3.不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如：生長因子（即細(xì)菌生長必需，而自身不能合成的化合物，如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g分析營養(yǎng)構(gòu)成？5.配制原則⑴目的明確：⑵營養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當(dāng)⑶適宜的pH值：有機(jī)碳源異養(yǎng)型：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的選擇原料自養(yǎng)型：不加碳源加入緩沖劑（KH2PO4，K2HPO4）細(xì)菌偏堿，真菌偏酸（CO2碳源）生產(chǎn)科研【典例解析】

例2．關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是（）A.是碳源的物質(zhì)不可能同時是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽D.無機(jī)氮源也能提供能量D

例1．下列敘述正確的是（）A.為微生物的生長繁殖提供營基質(zhì)的是固體培養(yǎng)基B.培養(yǎng)基只有兩類:液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基C.固體培養(yǎng)基中加入少量水及可制成液體培養(yǎng)基D.微生物在固體培養(yǎng)基上生長時，可以形成肉眼可見的菌落D

例3．下表是對四種微生物的能源、碳源、氮源新陳代謝類型的敘述，正確的是（）B（三）無菌技術(shù)1.無菌技術(shù)的概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。無論是隨后將要學(xué)到的倒平板、平板劃線操作，還是平板稀釋涂布法，其操作中的每一步都需要做到“無菌”，即防止雜菌污染。只有熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。

⑴消毒定義：

利用化學(xué)或物理方法，殺死物體表面或內(nèi)部的部份微生物（不含芽胞和孢子）的過程。2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

⑵滅菌的定義：

以化學(xué)或物理方法消滅物體內(nèi)外所有微生物，包括所有細(xì)菌的繁殖體、芽孢、霉菌及病毒，而達(dá)到完全無菌之過程。

滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。1.煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min2.巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3.化學(xué)藥劑消毒法：用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒；氯氣消毒水源4.紫外線消毒……⑴消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法1.灼燒滅菌2.干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3.高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min。⑵滅菌的方法：1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。⑴培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿⑵玻棒、試管、燒瓶和吸管⑶實驗操作者的雙手

答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染答：⑴、⑵需要滅菌；⑶需要消毒。旁欄思考例5．下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是（）A.防止雜菌污染B.消滅雜菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌D.滅菌必須在接種前B例6．下列關(guān)于消毒和滅菌的說法，不正確的是（）A.滅菌是指殺死環(huán)境中的一切微生物的細(xì)胞、芽胞和孢子B.消毒和滅菌實質(zhì)上是相同的C.接種環(huán)用灼燒的方法滅菌D.常用消毒方法有煮沸法、紫外線法、化學(xué)藥品法B例7．高溫滅菌的原理是（）A.每種微生物生長的最適溫度是一定的B.微生物對于高溫環(huán)境不適應(yīng)C.高溫破壞的細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸D.高溫降低了環(huán)境中氧的濃度C（四）微生物實驗室培養(yǎng)的基本操作程序①器具的滅菌→②培養(yǎng)基的配制→③培養(yǎng)基的滅菌→④倒平板→⑤微生物接種→⑥恒溫箱中培養(yǎng)→⑦菌種的保存1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計算：培養(yǎng)基用量依配方計算各成分的用量2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙、少量水加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→瓊脂→補(bǔ)水定容4.調(diào)pH、分裝、封口：5.滅菌：6.倒平板：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿分散成單個細(xì)胞,形成單個菌落倒平板約50℃防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論

答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。例8.制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的步驟是（）A.計算、稱量、倒平板、溶化、滅菌B.計算、稱量、溶化、倒平板、滅菌C.計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板D.計算、稱量、滅菌、溶化、倒平板C例9.有關(guān)倒平板操作錯誤的是（）A.將滅過菌的培養(yǎng)基放在火焰旁的桌面上B.使打開的錐形瓶的瓶口迅速通過火焰C.將培養(yǎng)皿打開，培養(yǎng)皿蓋倒放在桌面上D.等待平板冷卻凝固后需要倒過來放置C二.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿菌：⑴平板劃線法：菌種劃3個平板1個不劃線1.純化大腸桿菌的方法：平板劃線法和稀釋涂布平板法接種環(huán)防止劃破培養(yǎng)基（重復(fù)實驗）（空白對照）平板劃線接種第一區(qū)域第二區(qū)域第三區(qū)域第四區(qū)域第五區(qū)域平板劃線法

平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體。2：每次劃線前灼燒接種環(huán)的目的：3：劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)的目的：平板劃線接種答案：避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)基答案：殺死上次劃線結(jié)束后殘留的菌種答案：及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免污染環(huán)境和操作者。1：第一步灼燒接種環(huán)的目的：4.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。5.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。稀釋涂布平板法原理：將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，并將不同稀釋度菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)稀釋倍數(shù)足夠高時，即可獲得單個細(xì)菌形成的標(biāo)準(zhǔn)菌落。6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：菌液微量移液器浸⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：b.涂布平板：不超過0.1ml各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照滴灼涂稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍注意：移液管需要經(jīng)過滅菌。操作時，試管口和移液管離火焰1~2cm處.問題討論涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？

應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。3．平板劃線法和稀釋涂布平板法的比較⑴平板劃線法：二.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿菌：1.接種：⑵稀釋涂布平板法：2.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h后，觀察并記錄稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍（三）菌種的保藏：1.臨時保藏：試管固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)長成菌落4℃冰箱保存2.長期保存：菌種易被污染、變異甘油管藏1ml甘油（滅菌）＋1ml菌液－20℃擱置斜面四、課題成果評價

（一）培養(yǎng)基的制作是否合格