蛋白質(zhì)的復(fù)性(共41張PPT)

蛋白質(zhì)的復(fù)性第一頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性第二頁，共41頁。包含體（inclusionbody,IB）是外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，尤其在大腸桿菌細(xì)胞中高效表達(dá)時(shí)，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在顯微鏡下觀察時(shí)為高折射區(qū)，與細(xì)胞質(zhì)中的其他成分有明顯的區(qū)別。第三頁，共41頁。（1）機(jī)械破碎（高壓勻漿，高速珠磨法）第二十二頁，共41頁。重組遺傳背景清楚，基因表達(dá)易于控制；蛋白質(zhì)復(fù)性的影響因素第三十二頁，共41頁。第三十六頁，共41頁。第二十六頁，共41頁。（1）機(jī)械破碎（高壓勻漿，高速珠磨法）透析法：利用透析或電滲析超濾除去變性蛋白質(zhì)復(fù)性是十分復(fù)雜過程，其中目標(biāo)產(chǎn)品的復(fù)性率非常低，一般不超過20%，其原因在于當(dāng)變性劑穩(wěn)定后，蛋白質(zhì)分子可能重新聚合成二聚體，三聚體或多聚體，甚至形成沉淀物。一般分為以下幾種方法:第二十九頁，共41頁。優(yōu)勢(shì):包含體可避免被水解酶水解方法（3）：所用試劑即可以破菌，又可以溶解包含體。蛋白質(zhì)復(fù)性的主要步驟：利用凝膠過濾層洗，對(duì)重組蛋白進(jìn)行復(fù)性.蛋白質(zhì)復(fù)性

包含體形成的原因包涵體的形成比較復(fù)雜，有些機(jī)理還不清楚；

(1)表達(dá)量過高：包含體的形成與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生成速率有關(guān)，新生成的多肽濃度較高，無充足的時(shí)間進(jìn)行折疊，從而形成非結(jié)晶、無定形的蛋白質(zhì)的聚集體；

(2)包含體的形成還被認(rèn)為與宿主菌的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分、溫度、pH值、離子強(qiáng)度、氧化還原電勢(shì)及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的功能等因素有關(guān)。

(3)大腸桿菌的生長過程在受到某些因素的影響時(shí)，其本身蛋白質(zhì)的表達(dá)也可出現(xiàn)異常，造成蛋白質(zhì)的聚集從而形成包含體。第四頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性包含體形成的原因（4）重組蛋白的氨基酸組成（5）重組蛋白時(shí)大腸桿菌的異源蛋白，缺乏一些蛋白折疊過程中所需要的酶和輔助因子。（6）在細(xì)菌表達(dá)蛋白過程中，蛋白質(zhì)分子間的離子鍵、疏水鍵或共價(jià)鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體的形成。第五頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性

包含體的形成的優(yōu)勢(shì)形成包含體對(duì)克隆基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)具有保護(hù)作用，大腸桿菌可產(chǎn)生蛋白質(zhì)水解酶，可降解不穩(wěn)定的多肽，許多可溶性的重組蛋白質(zhì)對(duì)這些酶敏感，使得利用細(xì)菌作為表達(dá)宿主時(shí)受到限制，然而隔離在包含體內(nèi)的蛋白質(zhì)可免受蛋白酶的降解作用；此外對(duì)宿主菌有毒性的重組蛋白以無活性聚集體的形式存在也可以降低對(duì)宿主菌的毒害作用。優(yōu)勢(shì):包含體可避免被水解酶水解第六頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性包含體的理化特性⑴大部分包含體不能滲透出細(xì)胞，需要人工進(jìn)行細(xì)胞破碎來進(jìn)行釋放產(chǎn)物。⑵大部分包含體在細(xì)胞內(nèi)凝聚成沒有活性的顆粒固體（r-干擾素，白細(xì)胞介素-2，人生長激素）特點(diǎn)：包含體組成基本上由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大部分（占50%以上）是基因工程產(chǎn)品，產(chǎn)物一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，沒有生物學(xué)活性。第七頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性

基因表達(dá)系統(tǒng)一般分為真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)。由于真核表達(dá)系統(tǒng)如酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等產(chǎn)生的重組蛋白價(jià)格高、產(chǎn)量低，而且操作復(fù)雜、產(chǎn)品周期長，而原核表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)成本低、生長快、表達(dá)量高、基因操作方便，因此，目前它們?nèi)允腔蚬こ痰闹饕磉_(dá)系統(tǒng)，特別是大腸桿菌。大腸桿菌的重組菌

有多種可選擇的質(zhì)粒；重組遺傳背景清楚，基因表達(dá)易于控制；蛋白表達(dá)量高（可達(dá)總蛋白50％）；但原核表達(dá)系統(tǒng)也有一個(gè)問題，很多外源蛋白在E.coli細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)往往以不溶的，無活性的包含體形式存在。若能解決包含體問題，原核表達(dá)系統(tǒng)就可得到更廣泛的應(yīng)用。第八頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性現(xiàn)就包含體形成的預(yù)防、分離、溶解、復(fù)性作一綜述。1.預(yù)防包含體形成的方法2.包含體的分離、溶解3.包含體的復(fù)性第九頁，共41頁。第十頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性預(yù)防包含體形成的方法1.

形成分子伴侶

分子伴侶是什么

參與協(xié)助新生肽鏈體內(nèi)折疊的一類蛋白質(zhì)，包括：核質(zhì)素，熱休克蛋白60家族（Hsp60），熱休克蛋白70家族（Hsp70），熱休克蛋白90家族（Hsp90）和其他種類的分子伴侶

分子伴侶對(duì)新生肽鏈折疊的促進(jìn)作用

①使前體蛋白處于一種松散折疊的構(gòu)象而具有跨膜、折疊或組裝能力；②在肽鏈折疊過程中通過與折疊中間體上暴露的疏水區(qū)域結(jié)合而防止肽鏈分子間發(fā)生反應(yīng)，阻礙肽鏈進(jìn)入錯(cuò)誤折疊途徑

應(yīng)用分子伴侶的策略

可采用表達(dá)外源基因的同時(shí)，共表達(dá)分子伴侶的策略。例如，GroES和GroEL可顯著提高D-核酮糖-1，5-二磷酸加氧酶/羧化酶（rubisco）的折疊、組裝效率，從而提高可溶性重組蛋白的產(chǎn)量；也能提高可溶性乙酰輔酶A脫氫酶的產(chǎn)量和組裝效率；對(duì)可溶性β-葡萄糖苷酶的表達(dá)也有提高第十一頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性預(yù)防包含體形成的方法

2.通過改變、優(yōu)化培養(yǎng)條件增加表達(dá)產(chǎn)物的可溶性.

為了使外源蛋白在E.coli細(xì)胞中可溶性，人們?cè)谂囵B(yǎng)條件的優(yōu)化方面進(jìn)行了多方面的探索。（I）通過降低培養(yǎng)溫度可以使人干擾素2和干擾素γ的可溶性組分提高。這些蛋白在37℃下表達(dá)時(shí)以包含體形式存在，當(dāng)將培養(yǎng)溫度降到23~30℃時(shí),其可溶性組分可達(dá)30%~90%。第十二頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性預(yù)防包含體形成的方法

2.通過改變、優(yōu)化培養(yǎng)條件增加表達(dá)產(chǎn)物的可溶性.為了使外源蛋白在E.coli細(xì)胞中可溶性，人們?cè)谂囵B(yǎng)條件的優(yōu)化方面進(jìn)行了多方面的探索。（II）利用豐富培養(yǎng)基,可使T4噬菌體的脫氧胞苷酸脫氨酶的基因進(jìn)行可溶性表達(dá)，表達(dá)量占細(xì)胞可溶性蛋白總量的20%，而在最低培養(yǎng)基中，此酶以包含體形式表達(dá)。（III）改變培養(yǎng)基的滲透壓、降低pH值等方法也可以達(dá)到減少包含體的目的。通過優(yōu)化發(fā)酵條件改善基因表達(dá)產(chǎn)物的方法雖然可行，然而也需要對(duì)具體問題進(jìn)行具體分析、實(shí)驗(yàn)。第十三頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性預(yù)防包含體形成的方法

3．通過基因突變技術(shù)，在蛋白分子中產(chǎn)生氨基酸取代，來增加重組蛋白的可溶性。此方法的前提是氨基酸的取代不能使蛋白的活性受到影響。通過氨基酸取代，改變蛋白質(zhì)表面荷電性質(zhì)，減少蛋白分子之間聚集，從而防止包含體的形成。如上所述，多種因素影響外源基因的可溶性表達(dá)。對(duì)于如何獲得天然構(gòu)象和活性的可溶蛋白質(zhì)的技術(shù)方法，目前均無統(tǒng)一的模式，只能通過具體實(shí)驗(yàn)來確定。第十四頁，共41頁。第十五頁，共41頁。第十六頁，共41頁。

蛋白質(zhì)復(fù)性蛋白質(zhì)復(fù)性的主要步驟：破碎細(xì)胞分離出包含體溶解包含體目標(biāo)構(gòu)建的構(gòu)型復(fù)原對(duì)復(fù)性蛋白進(jìn)行純化獲得高純度的蛋白。包含體顆粒內(nèi)并不一定多是表達(dá)產(chǎn)物，也可能含有其他雜物，核酸，脂類，雜蛋白等.第十七頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性主要蛋白質(zhì)復(fù)性的基本步驟和聯(lián)合實(shí)驗(yàn)如下：（1）機(jī)械破碎（高壓勻漿，高速珠磨法）離心法提取出包含體加變性劑溶解除變性劑復(fù)性。（2）機(jī)械破碎膜分離可溶性蛋白變性溶解包含體除變性劑復(fù)性。（3）化學(xué)破碎（加變性劑）離心除細(xì)胞碎片出除變性劑復(fù)性。第十八頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性

路線1的特點(diǎn)：

方法（1）：利用了包含體與細(xì)胞破碎片的密度差，用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性性蛋白質(zhì)分開，獲得包含體，再對(duì)包含體溶解后，復(fù)性，擺脫大量的雜蛋白，核酸，熱原，內(nèi)毒素等雜質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：分離步驟簡單；缺點(diǎn)：經(jīng)幾次離心后，才能除去大部分細(xì)胞碎片，加工時(shí)間長。第十九頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性第二十頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性

路線2的特點(diǎn)：

方法（2）：應(yīng)用膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)，但載留細(xì)胞碎片和包含體。優(yōu)點(diǎn)：可進(jìn)行封閉式操作，不污染環(huán)境，也不受環(huán)境污染，耗能少。缺點(diǎn)：膜的堵塞和濃度極化常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留，這項(xiàng)技術(shù)問題較多。

第二十一頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性

路線3的特點(diǎn)：方法（3）：所用試劑即可以破菌，又可以溶解包含體。將兩道工序合為一道，節(jié)省了設(shè)備和時(shí)間，比前兩者更適合實(shí)驗(yàn)室操作。

缺點(diǎn)：混有雜質(zhì)，不易分離。第二十二頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性包含體復(fù)性的方法

包含體蛋白質(zhì)的復(fù)性是指使包含體內(nèi)的變性蛋白質(zhì)恢復(fù)其天然三維空間結(jié)構(gòu)從而具有生物學(xué)活性的過程.一般分為以下幾種方法:

1.

通過變性-復(fù)性的方法獲得正確構(gòu)象和生物活性的重組蛋白.這是一種較通用的方法.第二十三頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性包含體復(fù)性的方法將通過細(xì)胞破碎,離心分離,多步清洗得到的”純凈”包含體,在強(qiáng)變性劑(5~8mol/L尿素或5~8mol/L的鹽酸胍)中變性增溶,再將變性蛋白質(zhì)稀釋到適當(dāng)?shù)膹?fù)性緩沖液中,或通過對(duì)復(fù)性緩沖液透洗\濃縮,最終得到重折疊的重組蛋白.在溶液中變性-復(fù)性方法的關(guān)鍵是優(yōu)化折疊液和操作步驟,特別是對(duì)分子內(nèi)含多個(gè)二硫鍵的蛋白質(zhì)更是如此.在此過程中,影響復(fù)性蛋白產(chǎn)率的因素有:第二十四頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性包含體復(fù)性的方法影響復(fù)性蛋白產(chǎn)率的因素：

(1)復(fù)性蛋白的濃度,為防止蛋白質(zhì)分子間發(fā)生聚集,復(fù)性蛋白的濃度要盡量稀,一般控制在25-75ug/mL為好.(2)復(fù)性緩沖液要保持適當(dāng)?shù)难趸€原條件.一般GSSG（氧化型谷胱甘肽）和GSH之比為1為好.(3)復(fù)性緩沖液的pH要通過實(shí)驗(yàn)來確定最適值.(4)復(fù)性溶液中要加入適當(dāng)?shù)膌abilizing試劑,如L精氨酸,可提高復(fù)性產(chǎn)率.

第二十五頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性包含體復(fù)性的方法影響復(fù)性蛋白產(chǎn)率的因素：

(5)復(fù)性溫度也是一個(gè)影響因素,一般在低溫下(4-10℃)進(jìn)行.(6)為防止聚集發(fā)生,復(fù)性時(shí),可采取分步加入變性蛋白的操作方法.

在溶液中變性-復(fù)性方法受各種因素的影響,且對(duì)不同蛋白質(zhì)所需的最適條件可能又不相同,因此對(duì)于一個(gè)特定重組蛋白的復(fù)性要通過實(shí)驗(yàn)找出最適條件.第二十六頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性包含體復(fù)性的方法影響復(fù)性蛋白產(chǎn)率的因素：（7）復(fù)性輔助因子變性劑、糖、氨基酸、表面活性劑（8）稀釋倍數(shù)第二十七頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性的影響因素

濃度

增加蛋白質(zhì)的濃度有利于聚集的進(jìn)行溫度

蛋白質(zhì)的復(fù)性一般在室溫下進(jìn)行，溫度過高（＞40℃）蛋白質(zhì)的聚集將十分嚴(yán)重

pH值

通常復(fù)性在弱堿性條件下（pH8）進(jìn)行，但要注意避免與蛋白的pI值相近折疊促進(jìn)劑

L-Arg,PEG,去污劑,尿素和鹽酸胍第二十八頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性

復(fù)性操作方法：

2.稀釋和透析復(fù)性稀釋法：將溶液稀釋，導(dǎo)致變性劑的濃度降低，蛋白質(zhì)開始復(fù)性。透析法：利用透析或電滲析超濾除去變性劑，使蛋白質(zhì)開始復(fù)性。缺點(diǎn)：透析時(shí)間長，易形成蛋白質(zhì)沉淀。第二十九頁，共41頁。第三十頁，共41頁。第三十一頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性

蛋白質(zhì)復(fù)性存在問題：蛋白質(zhì)復(fù)性是十分復(fù)雜過程，其中目標(biāo)產(chǎn)品的復(fù)性率非常低，一般不超過20%，其原因在于當(dāng)變性劑穩(wěn)定后，蛋白質(zhì)分子可能重新聚合成二聚體，三聚體或多聚體，甚至形成沉淀物?，F(xiàn)有提高蛋白質(zhì)復(fù)性收率有：反膠束法復(fù)性，單克隆抗體協(xié)助復(fù)性及保護(hù)復(fù)性等。第三十二頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性紅血球碳酐復(fù)性中鹽酸胍濃度與蛋白質(zhì)濃度對(duì)復(fù)性的影響第三十三頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性

紅血球碳酐復(fù)性中鹽酸胍濃度與蛋白質(zhì)濃度對(duì)復(fù)性的影響圖中有復(fù)性區(qū)、多聚體區(qū)和絮凝沉淀區(qū)。降低鹽酸胍濃度或增加蛋白質(zhì)濃度都易使系統(tǒng)進(jìn)入多聚體區(qū)和絮凝區(qū)。要減少復(fù)性的損失，就必須使操作處于復(fù)性界限之上。第三十四頁，共41頁。第三十五頁，共41頁。第三十六頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性

復(fù)性操作方法：

3.色譜復(fù)性（1）凝膠過濾色譜為代表的非吸附型色譜。（2）吸附型色譜復(fù)性，其中常用的金屬螯合色譜復(fù)性，親合色譜復(fù)性，離子交換色譜復(fù)性。第三十七頁，共41頁。色譜法復(fù)性色譜復(fù)性方法原理復(fù)性蛋白凝膠色譜（SEC）蛋白質(zhì)Stokes半徑的差異和凝膠排阻作用溶菌酶，牛碳酸酐酶，E.coli宿主整合因子，rhETS-1，RNaseA，t-PA，Heterodimericplatelet-derivedgrowthfactor疏水色譜（HIC）蛋白質(zhì)與介質(zhì)的疏水性相互結(jié)合rhIFN-γ，rhIFN-β，重組人粒細(xì)胞集落刺激因子rhGC-CSF離子交換色譜（IEC）蛋白質(zhì)與介質(zhì)間存在電荷作用力Papilomavirus(HPV)，E7MS2fusionprotein，重組白細(xì)胞分泌抑制因子rSLPI，抗原疫苗蛋白親和色譜（AFC）蛋白與配體的特異性親和吸附重組人朊病毒rhPrion，牛碳酸酐酶，IgG第三十八頁，共41頁。蛋白質(zhì)復(fù)性

復(fù)性操作方法：