分子發(fā)光分析法優(yōu)選ppt資料

分子(fēnzǐ)發(fā)光分析法第一頁(yè)，共99頁(yè)。第二頁(yè)，共99頁(yè)。§5-1概述(ɡàishù)一、分子(fēnzǐ)發(fā)光分析法及其分類某些物質(zhì)的分子(fēnzǐ)吸收一定能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，以光輻射的形式從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，這種現(xiàn)象稱為分子(fēnzǐ)發(fā)光，在此基礎(chǔ)上建立起來(lái)的分析方法為分子(fēnzǐ)發(fā)光分析法較高激發(fā)態(tài)基態(tài)吸收能量受激光輻射退激分子在退激過(guò)程(guòchéng)中以光輻射形式釋放能量第三頁(yè)，共99頁(yè)。根據(jù)分子受激時(shí)所吸收能源及輻射光的機(jī)理不同分為以下(yǐxià)幾類：光致發(fā)光：以光源來(lái)激發(fā)而發(fā)光

電致發(fā)光：以電能來(lái)激發(fā)而發(fā)光生物發(fā)光：以生物體釋放的能量激發(fā)而發(fā)光化學(xué)發(fā)光：以化學(xué)反應(yīng)能激發(fā)而發(fā)光—化學(xué)發(fā)光分析法熒光(yíngguāng)—熒光(yíngguāng)分析法磷光—磷光分析法第四頁(yè)，共99頁(yè)。二、分子發(fā)光(fāɡuānɡ)分析法的特點(diǎn)1.靈敏度高熒光強(qiáng)度隨激發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)(zēngqiáng)而增強(qiáng)(zēngqiáng)（提高激發(fā)光強(qiáng)度，可提高熒光強(qiáng)度）

采用高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)(xìtǒng)可大大提高靈敏度，檢測(cè)限熒光分析法比分光光度法低2~4個(gè)數(shù)量級(jí)激發(fā)發(fā)射熒光強(qiáng)強(qiáng)激發(fā)光物質(zhì)第五頁(yè)，共99頁(yè)。2.選擇性好不同的物質(zhì)用不同的光進(jìn)行激發(fā)，選擇不同的激發(fā)光波長(zhǎng)不同的物質(zhì)發(fā)射的熒光不同，選擇不同的檢測(cè)熒光波長(zhǎng)比較容易排除其它物質(zhì)的干擾，選擇性好3.實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單4.待測(cè)樣品用量少；儀器價(jià)格適中；測(cè)定范圍較廣具發(fā)光強(qiáng)度可定量(dìngliàng)測(cè)定許多痕量的無(wú)機(jī)物和有機(jī)物，廣泛應(yīng)用在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)及農(nóng)牧產(chǎn)品分析、衛(wèi)生檢疫等領(lǐng)域。第六頁(yè)，共99頁(yè)。應(yīng)用還不夠廣泛，尚待拓寬。熒光法比磷光(línɡuānɡ)法應(yīng)用廣泛，但均不如分光光度法廣泛。許多物質(zhì)自身不會(huì)發(fā)射熒光（需衍生），且熒光分析對(duì)環(huán)境極為敏感：溫度、酸度、溶解氧、重金屬等均會(huì)產(chǎn)生影響或干擾。第七頁(yè)，共99頁(yè)?！?-2分子熒光(yíngguāng)和分子磷光

molecularfluorescenceandphosphorescence一、熒光和磷光光譜的產(chǎn)生(chǎnshēng)（一）激發(fā)過(guò)程具有不飽和基團(tuán)的基態(tài)分子光照后，價(jià)電子躍遷產(chǎn)生(chǎnshēng)熒光和磷光

電子基態(tài)第一電子激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)動(dòng)能極躍遷振動(dòng)能級(jí)躍遷電子能級(jí)躍遷第八頁(yè)，共99頁(yè)。在光致激發(fā)和去激發(fā)光的過(guò)程中，分子中的價(jià)電子(diànzǐ)（、n電子(diànzǐ)）處于不同的自旋狀態(tài)，通常用電子(diànzǐ)自旋狀態(tài)的多重性來(lái)描述1、光譜項(xiàng)的多重型：M＝2S+1（1）單重態(tài)M=2S+1＝1（自旋相反）S＝0分子能級(jí)=電子能級(jí)(Ee)+振動(dòng)(zhèndòng)能級(jí)(Ev)+轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)(Er)。S0,S1,S2,S3分別代表基態(tài)(jītài),第一,二,三激發(fā)單重態(tài)（2）三重態(tài)M=2S+1＝3（自旋平行）S＝1T1、T2、T3分別表示第一、二、三激發(fā)三重態(tài)第九頁(yè)，共99頁(yè)。2、處于基態(tài)的分子吸收能量(néngliàng)后發(fā)生躍遷：第十頁(yè)，共99頁(yè)。當(dāng)物質(zhì)受光照射(zhàoshè)時(shí)，基態(tài)分子吸收光能產(chǎn)生電子能級(jí)躍遷，由基態(tài)躍遷至更高的單重態(tài)，電子自旋方向沒有改變（相反），凈自旋=0，這種躍遷是符合光譜選律的允許躍遷，S0→S1若分子中電子躍遷過(guò)程中伴隨著自旋方向的改變（平行），由基態(tài)(jītài)單重態(tài)→激發(fā)三重態(tài)，凈自旋0。這種躍遷為禁阻躍遷，S0→T1第十一頁(yè)，共99頁(yè)。平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(wěndìng)(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；S0S2S1T1第十二頁(yè)，共99頁(yè)。第十三頁(yè)，共99頁(yè)。（二）去活過(guò)程(guòchéng)（去激過(guò)程(guòchéng))Deactivation）電子(diànzǐ)處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過(guò)輻射躍遷(發(fā)光)和無(wú)輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛豫無(wú)輻射躍遷激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑(tújìng)，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大。第十四頁(yè)，共99頁(yè)。1、無(wú)輻射去激不伴隨發(fā)光現(xiàn)象的過(guò)程叫無(wú)輻射去激，體系內(nèi)的多余的能量以熱的形式(xíngshì)釋放（1）內(nèi)部轉(zhuǎn)換（IC，InternalConversion）當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)非?？拷灾?yǐzhì)其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，相同的多重態(tài)之間的轉(zhuǎn)換，S2→S1、T2-T1（2）振動(dòng)馳豫（VR，VibrationalRelaxation）同一電子能級(jí)中，從較高振動(dòng)能級(jí)到較低振動(dòng)能級(jí)的過(guò)程。速率(sùlǜ)極大，10-14~10-12s完成。無(wú)論分子被激發(fā)到哪個(gè)激發(fā)單重態(tài)，均通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。第十五頁(yè)，共99頁(yè)。（3）系間竄躍(ISC，IntersystemConversion)不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí),通過(guò)自旋(zìxuán)-軌道耦合改變電子自旋(zìxuán),不同的多重態(tài)之間的非輻射躍遷，禁阻躍遷.S1→T1（4）外部轉(zhuǎn)移（ExternalConversion，EC）指激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子的相互作用而轉(zhuǎn)移能量，使熒光或磷光強(qiáng)度減弱或消滅（猝滅）發(fā)生系間竄躍電子需轉(zhuǎn)向，S1～T1間進(jìn)行，比內(nèi)部轉(zhuǎn)換困難第十六頁(yè)，共99頁(yè)。T1S0ISCVRVRIC吸光吸光S0S1S2VR：振動(dòng)馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍第十七頁(yè)，共99頁(yè)。2.輻射(fúshè)去激—產(chǎn)生熒光和磷光光譜（1）熒光(yíngguāng)當(dāng)電子從第一激發(fā)單重態(tài)S1的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)S0各振動(dòng)能級(jí)（多為S1→S0躍遷）所產(chǎn)生的輻射叫熒光熒光是相同多重態(tài)間的允許躍遷，產(chǎn)生速度快，10-9~10-6s，又叫快速熒光或瞬時(shí)熒光，外部光源停止照射，熒光馬上熄滅由于各種去活化(huóhuà)過(guò)程的存在，無(wú)論開始電子被激發(fā)至什么高能級(jí)，它都經(jīng)過(guò)無(wú)輻射去激消耗能量后到S1的最低振動(dòng)能級(jí)，熒光輻射能通常要比激發(fā)能量低，熒光波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)。熒激>第十八頁(yè)，共99頁(yè)。T1S0ISCVRVRIC吸光吸光熒光圖5-1分子熒光光譜產(chǎn)生過(guò)程示意圖S0S1S2VR：振動(dòng)馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍第十九頁(yè)，共99頁(yè)。（2）磷光(línɡuānɡ)由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)(T1→S0躍遷(yuèqiān)）產(chǎn)生a.電子由S0→T1的可能過(guò)程：（禁阻躍遷(yuèqiān)）S0→激發(fā)→振動(dòng)弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移S→系間跨越T→振動(dòng)弛豫→T1b.從T1S1要改變電子自旋，發(fā)光速度慢，約為10-4~10s，光照停止后，磷光仍可持續(xù)一段時(shí)間c.分子相互碰撞的無(wú)輻射能量塤耗大，所以磷光的波長(zhǎng)更長(zhǎng)磷>熒>激

*易產(chǎn)生熒光n*易產(chǎn)生磷光第二十頁(yè)，共99頁(yè)。T1S0ISCVRVRIC吸光吸光熒光磷光圖5-1分子熒光、磷光光譜(guāngpǔ)產(chǎn)生過(guò)程示意圖S0S1S2VR：振動(dòng)馳豫IC：內(nèi)部(nèibù)轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍VR第二十一頁(yè)，共99頁(yè)。S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫第二十二頁(yè)，共99頁(yè)。二、激發(fā)光譜和熒光、磷光(línɡuānɡ)光譜1、激發(fā)光譜熒光和磷光均為光致發(fā)光，合適(héshì)的激發(fā)光波長(zhǎng)需根據(jù)激發(fā)光譜確定Iex固定em熒光波長(zhǎng)固定測(cè)量(cèliáng)波長(zhǎng)為熒光（或磷光）最大發(fā)射波長(zhǎng)em，然后改變激發(fā)波長(zhǎng)，根據(jù)激發(fā)光波長(zhǎng)ex對(duì)熒光（磷光）強(qiáng)度I作圖得激發(fā)光譜曲線。

激發(fā)：excitated發(fā)射：emission

激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大第二十三頁(yè)，共99頁(yè)。激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經(jīng)校正后二者完全相同！這是因?yàn)榉肿?fēnzǐ)吸收光能的過(guò)程就是分子(fēnzǐ)的激發(fā)過(guò)程。激發(fā)光譜曲線：I～ex吸收(xīshōu)曲線：A～兩者在性質(zhì)上是不同的Iex固定em熒光波長(zhǎng)第二十四頁(yè)，共99頁(yè)。Iem固定(gùdìng)ex激發(fā)光波長(zhǎng)固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系(guānxì)曲線，以I為縱坐標(biāo)，em為橫坐標(biāo)得左圖，即熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜從曲線上找出最大的em2.發(fā)射光譜(guāngpǔ)－熒光光譜(guāngpǔ)(或磷光光譜(guāngpǔ))由于不同物質(zhì)具有不同的特征發(fā)射峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)第二十五頁(yè)，共99頁(yè)。從圖中看出(kànchū)磷＞熒＞激吸收峰熒光峰磷光峰第二十六頁(yè)，共99頁(yè)。第二十七頁(yè)，共99頁(yè)。3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜(fāshèɡuānɡpǔ)的關(guān)系a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)不管激發(fā)波長(zhǎng)如何，分子受激后可到達(dá)(dàodá)不同能層的激發(fā)態(tài)，但通過(guò)去活化（內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫），電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層。c.鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。第二十八頁(yè)，共99頁(yè)。三維熒光(yíngguāng)光譜圖第二十九頁(yè)，共99頁(yè)。c.鏡像規(guī)則(guīzé)基態(tài)(jītài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類似。激發(fā)：基態(tài)→第一(dìyī)激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，振動(dòng)能級(jí)越高，能級(jí)差越大，波長(zhǎng)就越短。發(fā)射熒光：從第一(dìyī)激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)，基態(tài)的振動(dòng)能級(jí)越高，其能量差越小，波長(zhǎng)就越長(zhǎng)。吸收光譜中能級(jí)越高波長(zhǎng)越短，發(fā)射光譜中能級(jí)越高，波長(zhǎng)越長(zhǎng)?；殓R像第三十頁(yè)，共99頁(yè)?；鶓B(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率(jīlǜ)最大，相反躍遷也然。第三十一頁(yè)，共99頁(yè)。第三十二頁(yè)，共99頁(yè)。二、熒光(yíngguāng)、磷光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（內(nèi)因）產(chǎn)生并可觀察到熒光的條件：i）分子具有與輻射頻率相應(yīng)的熒光結(jié)構(gòu)（內(nèi)因）；ii）量子效率足夠大：（一）熒光效率（熒光量子產(chǎn)率、量子效率）衡量物質(zhì)(wùzhì)發(fā)射熒光的能力

熒光量子效率f=發(fā)熒光的分子數(shù)激發(fā)態(tài)分子總數(shù)f是一個(gè)物質(zhì)熒光特性的重要參數(shù)，反映(fǎnyìng)了熒光物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，f越大，熒光越強(qiáng)，在0~1之間第三十三頁(yè)，共99頁(yè)。若以各種躍遷速率常數(shù)來(lái)表示Kf為熒光發(fā)射過(guò)程的速率常數(shù)——取決于物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)∑Ki為非輻射躍遷的速率常數(shù)之和——主要取決于化學(xué)環(huán)境，也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)分析上有應(yīng)用(yìngyòng)價(jià)值的熒光化合物的熒光效率在0.1~1之間第三十四頁(yè)，共99頁(yè)。（二）熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系(guānxì)（內(nèi)因）1、躍遷類型通常，具有*和n*躍遷結(jié)構(gòu)的分子才能吸收紫外可見光，產(chǎn)生熒光

具有π—π*躍遷的量子效率比n—π*躍遷的要大得多（前者ε大、壽命短）總之，躍遷(yuèqiān)是產(chǎn)生熒光的主要躍遷(yuèqiān)類型。第三十五頁(yè)，共99頁(yè)。常選用某些熒光分子作探針(tànzhēn)，通過(guò)探針(tànzhēn)分析熒光的變化研究DNA與小分子及藥物的作用機(jī)理，從而探討致病原因及篩選和設(shè)計(jì)新藥。（5）熒光(yíngguāng)自猝滅具有共軛體系的芳環(huán)或雜環(huán)化合物，電子共軛程度越大，越易產(chǎn)生熒光(yíngguāng);環(huán)越多，共軛程度越大，產(chǎn)生熒光(yíngguāng)波長(zhǎng)越長(zhǎng)（紅移），發(fā)射的熒光(yíngguāng)強(qiáng)度越強(qiáng)（2）磷光(línɡuānɡ)ii）量子效率足夠大：（1）內(nèi)部轉(zhuǎn)換（IC，InternalConversion）由于系間跨越躍遷，分子由單重態(tài)躍遷至三重態(tài)，轉(zhuǎn)入三重態(tài)的分子在室溫下不發(fā)光，易與其它分子碰撞(pènɡzhuànɡ)而使熒光猝滅，若發(fā)射發(fā)射則為磷光?；鶓B(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率(jīlǜ)最大，相反躍遷也然。在氣相中O3能氧化NO、乙烯等產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，原子氧也能氧化NO、SO2、CO等產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。例：8-羥基喹啉為弱熒光體，與Mn+—Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成剛性結(jié)構(gòu)，熒光加強(qiáng)f與熒光效率的影響因素相同，既取決于發(fā)光體本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，也受環(huán)境的影響第七十三頁(yè)，共99頁(yè)。自吸現(xiàn)象(xiànxiàng)：內(nèi)濾光中的一種，化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)端與其吸收光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)端重疊，產(chǎn)生自吸收；氧化劑（H2O2）ex/nmem/nm第六十四頁(yè)，共99頁(yè)。2、共軛效應(yīng)具有共軛體系的芳環(huán)或雜環(huán)化合物，電子共軛程度越大，越易產(chǎn)生熒光(yíngguāng);環(huán)越多，共軛程度越大，產(chǎn)生熒光(yíngguāng)波長(zhǎng)越長(zhǎng)（紅移），發(fā)射的熒光(yíngguāng)強(qiáng)度越強(qiáng)fex/nm

em/nm0.112052780.292863100.46365400苯萘蒽350菲線狀環(huán)結(jié)構(gòu)(jiégòu)比非線狀結(jié)構(gòu)(jiégòu)的熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)第三十六頁(yè)，共99頁(yè)。芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光多環(huán)芳烴是重要(zhòngyào)的環(huán)境污染物，可用熒光法測(cè)定3，4-苯并芘是強(qiáng)致癌物ex=386nm

em=430nm第三十七頁(yè)，共99頁(yè)。3、剛性平面結(jié)構(gòu)(jiégòu)—較穩(wěn)定的平面結(jié)構(gòu)(jiégòu)具有強(qiáng)熒光(yíngguāng)的分子多數(shù)有剛性平面結(jié)構(gòu)，可以減少分子的振動(dòng)，使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減少，也減少了碰撞去活的可能性，熒光(yíngguāng)強(qiáng)度大。熒光素：氧橋把兩個(gè)環(huán)固定在一個(gè)平面(píngmiàn)上，具有平面(píngmiàn)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)熒光物質(zhì)酚酞：無(wú)氧橋把兩個(gè)環(huán)固定，不能很好的共平面，為非熒光物質(zhì)第三十八頁(yè)，共99頁(yè)。例1，2-二苯乙烯反式：平面(píngmiàn)構(gòu)型強(qiáng)熒光體順式：非平面(píngmiàn)構(gòu)型非熒光體第三十九頁(yè)，共99頁(yè)。4、取代(qǔdài)基效應(yīng)——取代基對(duì)熒光物質(zhì)的熒光特征和強(qiáng)度也有很大影響。分成三類：（1）增強(qiáng)熒光的取代基——有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等給電子基團(tuán)由于基團(tuán)的n電子（孤對(duì)電子）的電子云與苯環(huán)上的軌道平行，共享了共軛電子，擴(kuò)大(kuòdà)了共軛體系，使熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)第四十頁(yè)，共99頁(yè)。（2）減弱熒光的取代基——-COOH、-NO2、-COOR、-NO、-SH吸電子基團(tuán),使熒光波長(zhǎng)短移，熒光強(qiáng)度減弱芳環(huán)上被F、Cl、Br、I取代后，使系間竄躍加強(qiáng)，磷光增強(qiáng)，熒光減弱。其熒光強(qiáng)度隨鹵素原子量增加而減弱，磷光相應(yīng)增強(qiáng)，這種效應(yīng)(xiàoyìng)為重原子效應(yīng)(xiàoyìng)。第四十一頁(yè)，共99頁(yè)。重原子(yuánzǐ)效應(yīng)溶液中若含有原子序數(shù)較高的重原子的分子或離子，如溴化物、碘化物等，導(dǎo)致(dǎozhì)容易發(fā)生系間跨越效應(yīng)稱重原子效應(yīng)。其原因是重原子的電子自旋和軌道運(yùn)動(dòng)間的相互作用變大，原子核附近產(chǎn)生磁場(chǎng)，使單重態(tài)向多重態(tài)系間跨越的幾率增加。含重原子的化合物熒光很弱，甚至無(wú)熒光，但磷光增強(qiáng)。第四十二頁(yè)，共99頁(yè)。（3）影響不明顯(míngxiǎn)的取代基——-NH3+、-R、-SO3H等第四十三頁(yè)，共99頁(yè)。（三）金屬(jīnshǔ)螯合物的熒光大多數(shù)無(wú)機(jī)鹽類金屬離子，不能產(chǎn)生(chǎnshēng)熒光，但某些螯合物都能產(chǎn)生(chǎnshēng)很強(qiáng)的熒光，可用于痕量金屬離子的測(cè)定不少有機(jī)配體是弱熒光體或不發(fā)熒光，但與Mn+形成螯合物后變?yōu)槠矫鏄?gòu)型，就會(huì)使熒光加強(qiáng)或產(chǎn)生(chǎnshēng)熒光例：8-羥基喹啉為弱熒光體，與Mn+—Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成剛性結(jié)構(gòu)，熒光加強(qiáng)第四十四頁(yè)，共99頁(yè)。三、影響熒光強(qiáng)度的因素(yīnsù)（外因）1.溶劑的影響同一熒光物質(zhì)在不同的溶劑中可能表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)一般來(lái)說(shuō)，溶劑的極性增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度增大

2.溫度的影響——低溫下測(cè)定，提高靈敏度因?yàn)檩椛滠S遷的速率基本(jīběn)不隨溫度變，而非輻射躍遷隨溫度升高顯著增大。大多數(shù)熒光物質(zhì)都隨溶液溫度升高熒光效率下降，熒光強(qiáng)度減弱。溫度對(duì)磷光影響更大第四十五頁(yè)，共99頁(yè)。3.pH的影響(yǐngxiǎng)大多數(shù)含有酸性或堿性基團(tuán)的芳香族化合物的熒光(yíngguāng)性質(zhì)受溶液pH的影響很大共軛酸堿對(duì)是具有不同熒光(yíngguāng)性質(zhì)的兩種型體，具有各自的熒光(yíngguāng)效率和熒光(yíngguāng)波長(zhǎng)例：苯酚(běnfēn)離子化后，熒光消失pH≈1有熒光pH≈13無(wú)熒光第四十六頁(yè)，共99頁(yè)。但兩個(gè)苯環(huán)相連(xiānɡlián)的化合物，又表現(xiàn)出相反的性質(zhì)，分子形式無(wú)熒光，離子化后顯熒光例：—苯酚(běnfēn)有熒光(yíngguāng)無(wú)熒光另外，表面活性劑也會(huì)影響熒光強(qiáng)度和特性第四十七頁(yè)，共99頁(yè)。4.內(nèi)濾光作用(zuòyòng)和自吸現(xiàn)象自吸現(xiàn)象(xiànxiàng)：內(nèi)濾光中的一種，化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)端與其吸收光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射(fāshè)的熒光，如色氨酸中的重鉻酸鉀；第四十八頁(yè)，共99頁(yè)。5、溶解氧的影響(yǐngxiǎng)溶液中的氧分子可使熒光溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度降低甚至熄滅。其原因較為復(fù)雜(fùzá)。溶解氧幾乎對(duì)所有的有機(jī)熒光物質(zhì)均有不同程度的熄滅作用，對(duì)芳香烴尤為顯著。第四十九頁(yè)，共99頁(yè)。6、熒光(yíngguāng)猝滅——熒光物質(zhì)與溶劑或其它物質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，或發(fā)生碰撞(pènɡzhuànɡ)后使熒光強(qiáng)度下降或熒光效率f下降稱為熒光猝滅。使熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑氧分子及產(chǎn)生重原子效應(yīng)的溴化物、碘化物等都是常見的熒光猝滅劑猝滅類型有：第五十頁(yè)，共99頁(yè)。（1）碰撞猝滅（動(dòng)態(tài)(dòngtài)猝滅）處于單重態(tài)的熒光分子M*與猝滅劑分子Q碰撞(pènɡzhuànɡ)，使M*以無(wú)輻射躍遷方式回到基態(tài)，產(chǎn)生猝滅。M非輻射躍遷M+熱碰撞猝滅第五十一頁(yè)，共99頁(yè)。（2）靜態(tài)(jìngtài)猝滅（組成化合物的猝滅）部分熒光物質(zhì)與猝滅劑生成非熒光的配合物。這一過(guò)程往往還會(huì)引起(yǐnqǐ)物質(zhì)吸收光譜的改變。第五十二頁(yè)，共99頁(yè)。（3）轉(zhuǎn)入(zhuǎnrù)三重態(tài)的猝滅由于系間跨越躍遷，分子由單重態(tài)躍遷至三重態(tài)，轉(zhuǎn)入三重態(tài)的分子在室溫下不發(fā)光，易與其它分子碰撞(pènɡzhuànɡ)而使熒光猝滅，若發(fā)射發(fā)射則為磷光。第五十三頁(yè)，共99頁(yè)。（4）發(fā)生電子(diànzǐ)轉(zhuǎn)移反應(yīng)的猝滅猝滅劑與熒光分子相互作用時(shí)發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移引起的猝滅。如：甲基藍(lán)溶液的熒光被Fe2+離子猝滅I-、Br-，S2O32-等易于(yìyú)給出電子的陰離子，使奎寧、羅丹明等熒光猝滅。第五十四頁(yè)，共99頁(yè)。（5）熒光(yíngguāng)自猝滅單重態(tài)激發(fā)態(tài)的分子在發(fā)生熒光之前和未激發(fā)的熒光物質(zhì)碰撞，濃度(nóngdù)較高時(shí)常發(fā)生。第五十五頁(yè)，共99頁(yè)。四、熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度(nóngdù)的關(guān)系用強(qiáng)度為I0的入射光，照射到液池內(nèi)的熒光物質(zhì)時(shí)，產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度If用儀器測(cè)得，在熒光濃度很稀(A<0.05)時(shí)，熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光強(qiáng)度If與濃度有下面(xiàmian)的關(guān)系If=fIa=f（I0-I）Ia為吸收(xīshōu)的輻射強(qiáng)度I0為入射光強(qiáng)度熒光池I0IIf熒光強(qiáng)度檢測(cè)器If=f（I0-I010-A

）

=fI0

（1-10-A

）I=I010-A將上式展開第五十六頁(yè)，共99頁(yè)。當(dāng)A﹤0.05時(shí)，方括號(hào)中其它(qítā)各項(xiàng)與第一項(xiàng)相比可忽略不計(jì)，上式簡(jiǎn)化If=2.3fI0A=2.3fI0εbc當(dāng)A﹤0.05時(shí)，If與f、I0、和c有關(guān)(yǒuguān)，對(duì)一給定物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)和強(qiáng)度一定時(shí)，f、I0、ε和b為常數(shù)，合并為KIf=KC

定量分析(dìngliàngfēnxī)依據(jù)第五十七頁(yè)，共99頁(yè)。熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，If=KC只有在濃度低時(shí)使用，熒光物質(zhì)測(cè)定的是微量或痕量組分，靈敏度高濃度高時(shí)，If與C不呈線形關(guān)系，有時(shí)C增大，If反而降低(jiàngdī)因?yàn)楣絒]中后面影響，有時(shí)發(fā)生熒光猝滅效應(yīng)If=

fI0

（1-10-A

）=fI0

（1-10-εbc

）第五十八頁(yè)，共99頁(yè)。（一）熒光分析儀器——主要(zhǔyào)由光源、單色器、液槽、檢測(cè)器和顯示器組成與分光光度計(jì)有兩點(diǎn)不同①兩個(gè)單色器②檢測(cè)器與激發(fā)(jīfā)光互成直角光源第一單色器激發(fā)單色器液池檢測(cè)器第二單色器發(fā)射單色器檢測(cè)器放大器及記錄器exemI0I五、熒光(yíngguāng)和磷光分析儀器第五十九頁(yè)，共99頁(yè)。第六十頁(yè)，共99頁(yè)。1、光源(guāngyuán)激發(fā)光源(guāngyuán)一般要求比吸收測(cè)量中的光源(guāngyuán)有更大的發(fā)射強(qiáng)度；適用波長(zhǎng)范圍寬熒光光度計(jì)中常用高壓汞燈和氙弧燈利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源；常用(chánɡyònɡ)其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm的譜線最強(qiáng)應(yīng)用最廣泛的一種光源，可發(fā)射250~800nm很強(qiáng)的連續(xù)光源第六十一頁(yè)，共99頁(yè)。激光(jīguāng)誘導(dǎo)熒光LIF，laserinductivefluorescence第六十二頁(yè)，共99頁(yè)。2、單色器大多數(shù)熒光光度計(jì)一般采用兩個(gè)光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜第一(dìyī)單色器作用：激發(fā)單色器，分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長(zhǎng)ex。第二單色器作用：發(fā)射單色器，濾掉一些雜散光和雜質(zhì)所發(fā)射的干擾光，用來(lái)選擇測(cè)定用的熒光波長(zhǎng)em。在選定的em下測(cè)定熒光強(qiáng)度，定量分析第六十三頁(yè)，共99頁(yè)。3、樣品(yàngpǐn)池盛放測(cè)定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能(zhīnénɡ)用手拿棱或最上邊4、檢測(cè)器熒光的強(qiáng)度一般較弱，要求檢測(cè)器有較高的靈敏度，熒光光度計(jì)采用光電倍增管熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度可大大提高熒光強(qiáng)度5、讀出裝置記錄儀記錄或打印機(jī)打印出結(jié)果，掃描激發(fā)光譜和發(fā)射光譜第六十四頁(yè)，共99頁(yè)。同步熒光(yíngguāng)光譜1971年Lloyd首先提出(tíchū)用同步掃描技術(shù)來(lái)繪制光譜圖，即同時(shí)掃描激發(fā)單色器和發(fā)射單色器波長(zhǎng)的條件下測(cè)繪光譜圖。所得的熒光強(qiáng)度I和波長(zhǎng)曲線為同步熒光光譜。第六十五頁(yè)，共99頁(yè)。同步掃描(sǎomiáo)技術(shù)根據(jù)激發(fā)(jīfā)和發(fā)射單色器在掃描過(guò)程中彼此間所保持的關(guān)系，同步掃描可分為固定波長(zhǎng)差()和固定能量差及可變波長(zhǎng)三種：1、固定波長(zhǎng)差同步掃描熒光法＝ex-em＝常數(shù)2、固定能量差同步掃描熒光法使發(fā)射單色器與激發(fā)(jīfā)單色器之間保持一個(gè)恒定的波數(shù)差3、可變波長(zhǎng)同步掃描熒光法使兩單色器在掃描過(guò)程中以不同的速率同時(shí)進(jìn)行掃描第六十六頁(yè)，共99頁(yè)。同步掃描技術(shù)可簡(jiǎn)化光譜，譜帶變窄，減少光譜重疊(chóngdié)，提高分辨率。

合適的可減少光譜重疊(chóngdié)：酪氨酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜相似，發(fā)射光譜嚴(yán)重重疊(chóngdié)，但<15nm的同步光譜只顯示酪氨酸特征光譜；>60nm時(shí)，只顯示色氨酸的特征光譜，實(shí)現(xiàn)分別測(cè)定。第六十七頁(yè)，共99頁(yè)。六、熒光(yíngguāng)光譜法與紫外-可見分光光度法比較（一）相同點(diǎn)（二）不同點(diǎn)第六十八頁(yè)，共99頁(yè)。磷光分析法phosphorescence與熒光相比，磷光的特點(diǎn)：1、磷光壽命比熒光長(zhǎng)2、磷光輻射的波長(zhǎng)(bōcháng)比熒光長(zhǎng)（一）磷光強(qiáng)度：Ip＝KC（二）溫度對(duì)磷光強(qiáng)度的影響試樣需在液氮溫度（77K）或液氦（4K）下測(cè)定第六十九頁(yè)，共99頁(yè)。（三）磷光分析儀器(yíqì)與熒光分析儀器相似，主要差異如下：1.試樣室試樣需在液氮溫度（77K）或液氦（4K）下測(cè)定－低溫磷光（將液池放在盛放液氮的杜瓦瓶?jī)?nèi)）固體表面室溫磷光分析需特制試樣室2.磷光鏡有些物質(zhì)既可產(chǎn)生熒光，又能產(chǎn)生磷光。用機(jī)械(jīxiè)切光裝置——磷光鏡區(qū)別熒光和磷光。利用熒光壽命短，磷光壽命長(zhǎng)消除熒光干擾。第七十頁(yè)，共99頁(yè)。磷光儀器在熒光儀樣品池上增加磷光配件：低溫杜瓦瓶和斬光片。如右圖所示。斬光片的作用是利用(lìyòng)其分子受激所產(chǎn)生的熒光與磷光的壽命不同獲取磷光輻射第七十一頁(yè)，共99頁(yè)。（四）室溫磷光低溫?zé)晒庑璧蜏貙?shí)驗(yàn)裝置且受到溶劑選擇的限制，1974年后發(fā)展了室溫磷光（RTP）。1）固體基質(zhì)室溫磷光在室溫下以固體基質(zhì)（如纖維素等）吸附磷光體，增加分子剛性、減少三重態(tài)猝滅等非輻射躍遷，從而提高磷光量子效率。2）膠束增穩(wěn)室溫磷光利用表面(biǎomiàn)活性劑在臨界濃度形成具多相性的膠束，改變磷光體的微環(huán)境、增加定向約束力，從而減小內(nèi)轉(zhuǎn)換和碰撞等去活化的幾率，提高三重態(tài)的穩(wěn)定性。3）敏化溶液室溫磷光第七十二頁(yè)，共99頁(yè)。（二）熒光(yíngguāng)分析法的應(yīng)用1.無(wú)機(jī)化合物的分析無(wú)機(jī)化合物中，能直接產(chǎn)生熒光并應(yīng)用于測(cè)定(cèdìng)的為數(shù)不多，但與有機(jī)化合物生成發(fā)熒光的有機(jī)配合物后，進(jìn)行熒光分析的元素達(dá)70多種，其中較常采用熒光法測(cè)定(cèdìng)的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素能夠同金屬離子形成熒光(yíngguāng)配合物的有機(jī)試劑絕大多數(shù)是芳香族化合物，形成五元環(huán)或六元環(huán)的螯合物，分子的剛性平面結(jié)構(gòu)增大，變?yōu)閺?qiáng)熒光(yíngguāng)體熒光(yíngguāng)猝滅法也是熒光(yíngguāng)分析中經(jīng)常采用的方法。可采用熒光(yíngguāng)猝滅法間接測(cè)定的離子有：F-、S2-、Co2+、Ni2+、Cu2+等第七十三頁(yè)，共99頁(yè)。2.有機(jī)(yǒujī)化合物的分析脂肪族有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，本身能發(fā)熒光的很少，一般需要與某些試劑反應(yīng)(fǎnyìng)后才能進(jìn)行熒光分析芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)熒光；可直接用熒光法測(cè)定。對(duì)于具有致癌活性的多環(huán)芳烴——熒光分析法是最主要的測(cè)定方法可測(cè)定結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大量有機(jī)物質(zhì)(wùzhì)，如：各種維生素、葉綠素、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和輔酶以及各種藥物、毒物和農(nóng)藥等第七十四頁(yè)，共99頁(yè)。3、基因(jīyīn)研究及檢測(cè)遺傳物質(zhì)DNA自身的熒光效率很低，一般檢測(cè)不到其熒光。常選用某些熒光分子作探針(tànzhēn)，通過(guò)探針(tànzhēn)分析熒光的變化研究DNA與小分子及藥物的作用機(jī)理，從而探討致病原因及篩選和設(shè)計(jì)新藥。典型的熒光探針(tànzhēn)分子：溴化乙錠（EB）、吖啶類染料。第七十五頁(yè)，共99頁(yè)。例：3，4–

苯并芘為強(qiáng)致癌物質(zhì)煤炭、石油、天然氣等燃料不完全燃燒以及吸煙、焚燒垃圾都會(huì)產(chǎn)生3，4–苯并芘，汽車尾氣也是主要來(lái)源食品加工過(guò)程也會(huì)產(chǎn)生3，4–苯并芘，尤其(yóuqí)是煙熏、油炸、烘烤食品第七十六頁(yè)，共99頁(yè)。例：VB2——又稱核黃素，是一種生長(zhǎng)促進(jìn)劑，常存在于動(dòng)物(dòngwù)肝臟、肉類、蛋黃、豆類、花生、蘑菇和海藻中。在低濃度情況下，I=KC，I與C呈線性關(guān)系，在pH6~7熒光最強(qiáng)在430~440nm藍(lán)光照射下，發(fā)出綠色熒光，em=535nm下測(cè)I，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定缺VB2會(huì)得口角炎、舌炎(shéyán)、唇炎、脂溢性皮炎維生素B2第七十七頁(yè)，共99頁(yè)。（三）磷光分析法應(yīng)用(yìngyòng)能產(chǎn)生磷光的物質(zhì)數(shù)量很少，磷光分析不及熒光(yíngguāng)分析普遍，但磷光分析法已在藥物分析、臨床及環(huán)境分析領(lǐng)域得到一定的應(yīng)用。低溫磷光分析已應(yīng)用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多環(huán)芳烴及含O、S、N的雜環(huán)化合物分析固體表面室溫磷光分析法已成為多環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物的快速、靈敏的分析手段。農(nóng)藥、生物堿、植物生長(zhǎng)激素的分析煙堿、降煙堿、新煙堿等分析第七十八頁(yè)，共99頁(yè)。第七十九頁(yè)，共99頁(yè)。§5-3化學(xué)發(fā)光分析法

Chemiluminescence,CL一、概述化學(xué)發(fā)光是吸收化學(xué)反應(yīng)所釋放化學(xué)能而使分子發(fā)光所建立的分析方法化學(xué)發(fā)光與熒光(yíngguāng)的主要區(qū)別：受激發(fā)時(shí)所需的能量來(lái)源不同，需要化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中所提供的化學(xué)能第八十頁(yè)，共99頁(yè)。化學(xué)發(fā)光分析具有(jùyǒu)以下特點(diǎn)靈敏度高——例：用熒光素酶和三磷酸腺苷ATP的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可測(cè)定低至2×10-17mol·L-1ATP線性范圍寬——一般(yībān)有5~6個(gè)數(shù)量級(jí)儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低廉分析速度快，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化局限性：可供發(fā)光用的試劑有限發(fā)光機(jī)理有待進(jìn)一步研究第八十一頁(yè)，共99頁(yè)。二、化學(xué)發(fā)光分析(fēnxī)的基本原理（一）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的基本條件發(fā)光反應(yīng)必須滿足以下條件1.化學(xué)反應(yīng)必須產(chǎn)生足夠的化學(xué)能化學(xué)發(fā)光基于化學(xué)反應(yīng)提供足夠的能量A+B→C*+D產(chǎn)物接受反應(yīng)能被激發(fā)(jīfā)C*→C+h在可見光區(qū)觀察化學(xué)發(fā)光，需170~300kJ·mol-1激發(fā)(jīfā)能。具有過(guò)氧化物中間產(chǎn)物的氧化還原反應(yīng)可滿足要求。化學(xué)反應(yīng)多是在有O3、H2O2等參加的氧化還原反應(yīng)中2.要有有利的化學(xué)反應(yīng)歷程。3.處于激發(fā)(jīfā)態(tài)分子能夠以輻射躍遷的方式返回基態(tài)第八十二頁(yè)，共99頁(yè)。（二）化學(xué)發(fā)光效率(xiàolǜ)和發(fā)光強(qiáng)度1、化學(xué)發(fā)光效率(xiàolǜ)CL激發(fā)態(tài)分子(fēnzǐ)的化學(xué)效率激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率r取決于發(fā)光所依據(jù)的化學(xué)反應(yīng)本身f與熒光效率的影響因素相同，既取決于發(fā)光體本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，也受環(huán)境的影響第八十三頁(yè)，共99頁(yè)。2、化學(xué)(huàxué)發(fā)光強(qiáng)度具有高效率的化學(xué)發(fā)光是生物體中，亦稱生物發(fā)光。如：螢火蟲發(fā)光反應(yīng)的效率幾乎(jīhū)接近100%，非生物體的化學(xué)發(fā)光效率一般不超過(guò)1%?；瘜W(xué)發(fā)光強(qiáng)度ICL（t）與反應(yīng)速度、化學(xué)發(fā)光效率有如下關(guān)系對(duì)下列(xiàliè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)A+B→C*+D

C+hICL隨時(shí)間和反應(yīng)物消耗的變化逐漸減小第八十四頁(yè)，共99頁(yè)。A+B→C*+DA為待測(cè)物質(zhì)，C為發(fā)光物質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)物B的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)過(guò)量于待測(cè)物濃度時(shí)，B的濃度可認(rèn)為是常數(shù)。因此(yīncǐ)，發(fā)光反應(yīng)可視為一級(jí)反應(yīng)t時(shí)刻的發(fā)光強(qiáng)度與該時(shí)刻的分析物濃度(nóngdù)成正比化學(xué)發(fā)光總強(qiáng)度與分析物濃度(nóngdù)呈線性關(guān)系。常用發(fā)光總強(qiáng)度來(lái)定量分析發(fā)光(fāɡuānɡ)總強(qiáng)度第八十五頁(yè)，共99頁(yè)。三、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(fǎnyìng)的類型1.液相化學(xué)發(fā)光——研究和應(yīng)用的比較廣泛的有：魯米諾、光澤精、沒食子酸、洛粉堿、過(guò)氧草酸鹽等。魯米諾是最常用的發(fā)光試劑，它可以測(cè)定Cl2、HClO、ClO-、H2O2、O2和NO2，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)時(shí)量子效率為0.01~0.05魯米諾（3–氨基苯二甲酰環(huán)肼）在堿性(jiǎnxìnɡ)溶液中和H2O2等氧化劑反應(yīng)生成最大波長(zhǎng)為425nm的光輻射第八十六頁(yè)，共99頁(yè)。氧化劑（H2O2

）425nm反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)能被產(chǎn)物氨基鄰苯二甲酸根吸收，處于激發(fā)狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)發(fā)射(fāshè)熒光可檢測(cè)低至10-9mol·L-1的H2O2第八十七頁(yè)，共99頁(yè)。魯米諾H2O2的化學(xué)反應(yīng)，可以被一些(yīxiē)痕量的過(guò)渡金屬元素所催化，使發(fā)出的光大大增強(qiáng)，由此可測(cè)定Co（Ⅱ）,Cu（Ⅱ）,Ni（Ⅱ）,Cr（Ⅲ），F(xiàn)e（ⅡⅢ），Ag（Ⅰ），Au（Ⅲ），Mn(Ⅱ)，Hg（Ⅱ）Os（ⅢⅣⅤ），Ru（Ⅵ），V（Ⅳ），Ir（Ⅳ）等金屬離子，檢測(cè)限由0.01~40