如何做好體外診斷試劑的性能評(píng)估

15/15如何做好體外診斷試劑的性能評(píng)估？

產(chǎn)品性能評(píng)估是產(chǎn)品研發(fā)、制定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)等過(guò)程的重要技術(shù)支持研究過(guò)程，并可能對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量造成一定的影響。

目前國(guó)際上對(duì)體外診斷試劑的性能評(píng)估通常是以美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化組織（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitude以下稱(chēng)為CLSI）的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，也是美國(guó)FDA推薦采用的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)CLSI是美國(guó)【臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)】的英文縮寫(xiě)，英文名為ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute。CLSI前身是NCCLS【美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)】，英文名為Nationalcommitteeforclinicallaboratory。美國(guó)CLSI的抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)*作方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)，是國(guó)內(nèi)臨床細(xì)菌檢驗(yàn)遵循的標(biāo)準(zhǔn)。由于制訂該項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)需要投入大量的人力、財(cái)力和物力，所以大多數(shù)國(guó)家都還沒(méi)有能力建立自己的標(biāo)準(zhǔn)而依賴(lài)CLSI的方法和標(biāo)準(zhǔn)。CLSI標(biāo)準(zhǔn)每年更新！EP系統(tǒng)文件，在實(shí)驗(yàn)室工作中常常會(huì)應(yīng)用。所有這些標(biāo)準(zhǔn)和指南對(duì)制定我們臨床檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)型文件會(huì)有很大幫助。

性能評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)體外診斷試劑產(chǎn)品性能評(píng)估包括檢測(cè)限、線(xiàn)性范圍、可報(bào)告范圍、準(zhǔn)確度（回收實(shí)驗(yàn)）、準(zhǔn)確度（方法學(xué)比較）、精密度、干擾實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性、參考區(qū)間共九個(gè)項(xiàng)目。Trueness/Comparability

（準(zhǔn)確度）EP09-A3,

MethodProcedureComparisonandBiasEstimation

UsingPatientSamples;ApprovedGuideline—ThirdEditionEP15-A3,

UserVerificationofPercisionandEstimationof

Bias;ApprovedGuideline—ThirdEdition.Precision

（精密度）EP15-A3,

UserVerificationofPercisionandEstimationof

Bias;ApprovedGuideline—ThirdEdition.EP05-A3,

EvaluationofPrecisionPerformanceofQuantitative

MeasurementProcedures;ApprovedGuideline—ThirdEdition.Linearity

（線(xiàn)性）

EP06-A,

EvaluationoftheLinearityofQuantitativeMeasurementProcedures:AStatisticalApproach;ApprovedGuideline.LimitofDetection/Quantitation

（檢測(cè)限）

EP17-A,

ProtocolsforDeterminationofLimitsofDetectionandLimitsofQuantitation;ApprovedGuideline.ReferenceInterval

（參考區(qū)間）EP28-A3C,

DefiningandVerifyingReferenceIntervalsintheClinicalLaboratory;ApprovedGuideline—ThirdEdition.QualitativeComparability

（定性可比性）EP12-A2,

UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline—SecondEdition.DiagnosticAccuracy

（診斷準(zhǔn)確性）

EP12-A2,

UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline—SecondEdition.QualitativePrecision

（定性精密度）

EP12-A2,

UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline—SecondEdition.

檢測(cè)限（

EP17-A

）概述檢測(cè)限評(píng)估資料是評(píng)價(jià)擬上市產(chǎn)品有效性的重要依據(jù)，也是產(chǎn)品注冊(cè)所需的重要申報(bào)資料之一。空白限值：

Limitof

Blank（

LoB

）檢出限值：Limitof

Detection(LoD)定量限值：

Limitof

Quantitation(LoQ)各種限值之間的關(guān)系最低的是空白限值（LOB）：是不含有待測(cè)物的可能檢測(cè)的最大濃度；其次低的是檢出限值（LOD）：是可能大于LOB的可被檢出的實(shí)際濃度；定量限值（LOQ）：能夠被可靠檢出的最低實(shí)際濃度。（目前接受度很低）LOB≤LOD

≤

LOQ極限建立順序：LoB

→

LoD

→

LoQ

?

建立和驗(yàn)證LoB測(cè)量程序ISO默認(rèn)α=β=5%，5%α值相當(dāng)于空白值分布的95%，作為顯著高于空白的檢測(cè)值的限值，由空白值呈正態(tài)分布，此限值相當(dāng)于：LoB=μB

+1.645σB

注：μB即平均值，σB即SD

樣本數(shù)目：建立需要每個(gè)水平≥60個(gè)結(jié)果，驗(yàn)證每個(gè)水平≥20個(gè)結(jié)果正態(tài)分布數(shù)據(jù)使用公式（1）LoB=μB

+1.645σB

（1）注：μB即平均值，σB即SD偏態(tài)分布數(shù)據(jù)使用公式（2）LoB=PctB100-α

（2）樣本選擇應(yīng)盡可能做到，空白與低水平樣品為天然樣本，或與天然樣本具有可替換性。為確保檢測(cè)具代表性，應(yīng)對(duì)一組樣品作檢測(cè)，而非對(duì)單一樣品進(jìn)行檢測(cè)。鑒于基體差異，最好對(duì)5個(gè)以上樣品作重復(fù)檢測(cè)。作為內(nèi)源性化合物，空白樣品為去除組分的樣品，如：用抗體沉淀、酶降解、活性炭吸收等作為低水平內(nèi)源性化合物，可使用一系列在低范圍濃度的樣品，若有必要，可配制成有分析物的樣品，最好配制一組來(lái)自不同個(gè)體的系列樣品。以綜合標(biāo)準(zhǔn)差估計(jì)來(lái)自樣品組的重復(fù)檢測(cè)變異。建立和驗(yàn)證LoD測(cè)量程序?若低水平樣品檢測(cè)結(jié)果呈正態(tài)分布，其分布的5%（β）百分位數(shù)相當(dāng)于LoB：LoB=μS

-1.645σS

注：μs即平均值，σs即SD即μS

=LoD=LoB

+1.645σS

，從而

LoD=μB

+1.645σB

+1.645σS

樣本數(shù)目：建議選擇4-6個(gè)水平，建立需每個(gè)水平≥60個(gè)結(jié)果，驗(yàn)證需每個(gè)水平≥20個(gè)結(jié)果確定LoB后，一般認(rèn)為L(zhǎng)oD的濃度范圍近似于LoB到4倍LoB間，在此范圍內(nèi)選擇一系列樣品，先測(cè)定一個(gè)實(shí)驗(yàn)性的LoDT；如果測(cè)定的SD滿(mǎn)足目標(biāo)條件，則LoD=LoDT，如果不滿(mǎn)足條件，則選擇更高的濃度重新測(cè)定。正態(tài)分布數(shù)據(jù)使用公式（6）LoDtent=LoB

+cβSDS

（6）注：cβ=1.645/(1-1/(4*f))；f=Ns-K,即自由度非正態(tài)分布數(shù)據(jù)：可嘗試轉(zhuǎn)化為正態(tài)分布，例如取對(duì)數(shù)。如無(wú)法轉(zhuǎn)換，但SD近似常數(shù)，使用公式（7）

LoD=LoB

+D

S，β

（7）注：D

S，β

類(lèi)似cβ，根據(jù)β誤差范圍劃分，一般取95%的數(shù)據(jù)>LoB為置信范圍。如SD不近似常數(shù)，再次選擇濃度水平反復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，直到符合上面的任何條件為止。根據(jù)實(shí)際需要先確定精密度目標(biāo)范圍，一般CV<20%樣本數(shù)目：需要每個(gè)水平≥40個(gè)復(fù)孔結(jié)果，至少選擇3-5個(gè)樣品濃度水平，平行測(cè)定5次。驗(yàn)證LoQ需要n≥25個(gè)復(fù)孔。每個(gè)樣品的40個(gè)復(fù)孔總標(biāo)準(zhǔn)偏差用于建立精密度。

一般總誤差(Total)=偏差+2*SDs可利用合適的參考物質(zhì)建立LoQ，將參考物質(zhì)添加或稀釋以得到真實(shí)濃度。舉例說(shuō)明（某產(chǎn)品為例）產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)

性能考核LOB性能考核LOD不高于1.5U/ml1.5U/ml0.8U/ml（112%）1.2U/ml（50%）1.6U/ml（55%）驗(yàn)證LOD所用稀釋液為SeraconⅡ的血清（添加抗原）驗(yàn)證LOB所用稀釋液為校準(zhǔn)品稀釋液（空白樣本）樣本的制備很重要??

線(xiàn)性范圍概述線(xiàn)性范圍評(píng)估資料是評(píng)價(jià)擬上市產(chǎn)品有效性的重要依據(jù)，也是產(chǎn)品注冊(cè)所需的重要申報(bào)資料之一。參考《EP6-A

定量測(cè)量方法的線(xiàn)性評(píng)價(jià)》。基本要求無(wú)論是建立或驗(yàn)證線(xiàn)性范圍，所選用的濃度水平應(yīng)可覆蓋整個(gè)預(yù)期測(cè)定范圍并包括與臨床有關(guān)的重要評(píng)價(jià)濃度，如最小測(cè)定濃度或線(xiàn)性范圍的最低限、不同的醫(yī)學(xué)決定水平、最大測(cè)定濃度或線(xiàn)性范圍的高限等。目前驗(yàn)證線(xiàn)性范圍，將測(cè)定范圍加寬至130%，在此范圍內(nèi)選擇6個(gè)濃度水平。實(shí)驗(yàn)過(guò)程建立線(xiàn)性范圍：需測(cè)定9-11個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定3-4次。驗(yàn)證標(biāo)稱(chēng)線(xiàn)性參數(shù)：需測(cè)定4-6個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定3-4次。結(jié)果處理依據(jù)6個(gè)樣本的實(shí)測(cè)濃度以及稀釋比例進(jìn)行線(xiàn)性做回歸分析，計(jì)算回歸系數(shù)。根據(jù)回歸方程計(jì)算6個(gè)樣本的理論濃度，計(jì)算實(shí)測(cè)濃度與理論濃度的偏差。具體標(biāo)準(zhǔn)參照各試劑盒性能指標(biāo)。舉例說(shuō)明（CA125）

產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)性能考核范圍1.5U/mL～5000U/mL1.05U/ml～6500U/mL

評(píng)估資料性能考核

CA125-L7定標(biāo)品稀釋液L1L6L10.1%99.9%100%0%L20.5%99.5%80%20%L35.0%95%60%40%L415%85%40%60%L530%70%20%80%L660%40%0%100%??檢測(cè)值理論值偏差

產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)

是否通過(guò)

6.61-17.97-24.58不超過(guò)±30U/mL是778.9883.3-13.4%不超過(guò)±15%是21352146.3-0.53%不超過(guò)±15%是31673309.3-4.30%不超過(guò)±15%是467944724.62%不超過(guò)±15%是5602

線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r=0.9967線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r≥0.99是

準(zhǔn)確度概述準(zhǔn)確度評(píng)估資料是評(píng)價(jià)擬上市產(chǎn)品有效性的重要依據(jù)，也是產(chǎn)品注冊(cè)所需的重要申報(bào)資料之一。定量檢測(cè)方法的回收實(shí)驗(yàn)是評(píng)估準(zhǔn)確度的方法之一，用于評(píng)估定量檢測(cè)方法準(zhǔn)確測(cè)定加入純分析物的能力，結(jié)果用回收率表示。評(píng)價(jià)依據(jù)國(guó)際（或國(guó)家）標(biāo)準(zhǔn)品或自制定值樣本比對(duì)準(zhǔn)確度樣本進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)臨床樣本比對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程將國(guó)際（或國(guó)家）標(biāo)準(zhǔn)品或自制定值樣本稀釋成理論濃度，與實(shí)測(cè)濃度進(jìn)行偏差分析自制回收率樣本1和2，將1和2按照比例進(jìn)行混合，得到回收率樣本3，根據(jù)實(shí)測(cè)濃度計(jì)算回收率不同濃度臨床樣本40個(gè)，每天隨機(jī)選取8個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)試，持續(xù)5天，進(jìn)行相關(guān)性分析??準(zhǔn)確度（CEA）

回收率

產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)

回收A90.39108%

85%～115%回收B2.55回收C13.85

測(cè)值定值偏差WHO-110.12101.20%WHO-2100.11000.07%

精密度概述精密度評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的主要目的是評(píng)價(jià)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的單個(gè)儀器所用的方法以及儀器的精密度。直觀的，精密度是無(wú)限制的長(zhǎng)期使用某一儀器的變異性。通常，設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，如果所有的因素都可以影響室內(nèi)精密度評(píng)價(jià)而不用考慮每一因素或成分的相對(duì)大小，這就足夠了。描述與時(shí)間相關(guān)的精密度組成部分的名詞包括：重復(fù)性、批內(nèi)精密度、日內(nèi)精密度、日間精密度、室內(nèi)精密度。實(shí)驗(yàn)過(guò)程配置低、中、高樣本，連續(xù)進(jìn)行20天重復(fù)測(cè)試，計(jì)算變異系數(shù)目前KHB試劑盒質(zhì)檢：重復(fù)性樣本各測(cè)試10次，計(jì)算變異系數(shù)注意問(wèn)題樣品一定要穩(wěn)定，且應(yīng)與新鮮的臨床病人標(biāo)本性能接近，穩(wěn)定的冷凍混合血清是首選樣本中的分析物含量應(yīng)在該項(xiàng)目的醫(yī)學(xué)決定水平處，盡可能做兩個(gè)水平以上的精密度實(shí)驗(yàn)采用冷凍保存的樣品一定要注意內(nèi)含分析物的穩(wěn)定，要嚴(yán)格控制冷凍、混勻的*作精密度（CEA）

????產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)

性能考核L性能考核M性能考核HCV不大于8%4.5%4.8%3.4%M樣本由L和H同體積混合而成

干擾實(shí)驗(yàn)概述干擾物質(zhì)是體外診斷試劑使用過(guò)程中造成測(cè)量誤差的一個(gè)主要原因，針對(duì)體外診斷試劑進(jìn)行的干擾實(shí)驗(yàn)是指通過(guò)實(shí)驗(yàn)查找出對(duì)體外診斷試劑測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生影響的物質(zhì)的過(guò)程。干擾實(shí)驗(yàn)評(píng)估資料是評(píng)價(jià)擬上市產(chǎn)品有效性的重要依據(jù)，也是產(chǎn)品注冊(cè)所需的重要申報(bào)資料之一

干擾物質(zhì)來(lái)源常見(jiàn)的異常標(biāo)本，例如溶血、黃疸及脂血；普通的處方藥及非處方藥；患者群體中異常的生化代謝物；患者群體中常見(jiàn)的治療藥物；干擾測(cè)量程序的藥物（包括代謝物）；已報(bào)道干擾相似測(cè)量程序的物質(zhì)；標(biāo)本處理過(guò)程中的添加物，例如抗凝劑、防腐劑；采集及處理過(guò)程中接觸標(biāo)本的物質(zhì)，例如血清分離設(shè)備、導(dǎo)管、標(biāo)本收集容器及塞子；

影響某些實(shí)驗(yàn)的膳食物質(zhì)，例如咖啡因，β-

胡蘿卜素，罌粟籽干擾實(shí)驗(yàn)的評(píng)估干擾物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，一般是通過(guò)測(cè)定對(duì)照或基礎(chǔ)樣本池中待測(cè)物的濃度計(jì)算得出的。在某些情況下，對(duì)照樣本池中可能含有一定量的內(nèi)源性干擾物質(zhì)，如膽紅素、血紅蛋白、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)。在一些測(cè)量程序中，采用標(biāo)本前處理、樣本空白、血清基質(zhì)校正物和因子校正等手段以減少這些干擾物質(zhì)在平均濃度下的影響，只有當(dāng)患者樣本中干擾物質(zhì)濃度高于或低于平均水平時(shí)，由于干擾物質(zhì)引起的誤差才會(huì)顯現(xiàn)出來(lái)?；诖耍袃煞N評(píng)估干擾物質(zhì)的基本方法，每一種方法都有它的優(yōu)點(diǎn)及內(nèi)在局限性，當(dāng)兩種方法同時(shí)使用時(shí)，可提供相互補(bǔ)充的信息。一種方法是將可疑干擾物質(zhì)加入樣本以評(píng)價(jià)干擾效果，另一種方法是測(cè)量個(gè)別有代表性病人標(biāo)本，相對(duì)于高特異性可比較的測(cè)量程序評(píng)價(jià)被分析測(cè)量程序產(chǎn)生的偏倚。

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備基礎(chǔ)樣本池：從一些未服用藥物的健康個(gè)體獲得新鮮標(biāo)本，以此反應(yīng)標(biāo)本基質(zhì)。若不能獲得新鮮標(biāo)本，可使用冷凍或凍干的標(biāo)本代替，但應(yīng)保證實(shí)驗(yàn)材料充分接近