分子生物學方法鑒定微生物課件

微生物分子生物學鑒定微生物分類學定義：按微生物的親緣關系和進化規(guī)律把它們安排成條理清楚的各種分類單元或分類群的科學。1ppt課件微生物分子生物學鑒定微生物分類學定義：1ppt課件微生物的鑒定主要步驟：純化、測定一系列必要的指標、查找權(quán)威性鑒定手冊鑒定方法分四個水平：細胞的形態(tài)和習性水平：形態(tài)特征、運動、酶反應、營養(yǎng)要求及生長條件等細胞組分水平：細胞壁成分、氨基酸庫、脂類、醌類、光合色素等的分析蛋白質(zhì)水平：氨基酸序列分析、凝膠電泳和血清學反應等基因或DNA水平：核酸分子雜交、（G+C）mol%、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導、16SrRNA寡核苷酸族分分析、DNA或RNA核苷酸序列分析等2ppt課件微生物的鑒定主要步驟：純化、測定一系列必要的指標、查找權(quán)威性類別分子生物學菌種鑒定DNA堿基比例的測定16SrDNA序列分析法

全基因組序列的測定隨著分子生物學的迅速發(fā)展，細菌的分類鑒定從傳統(tǒng)的表型、生理生化分類進入到各種基因型分類水平

核酸分子雜交3ppt課件類別分子生物學DNA堿基比例的測定16SrDNA序列分析法一、DNA的堿基組成(G+C)mol%(G+C)mol%=

A+T+G+CG+CX100%

1)DNA堿基比例的測定是指（G+C）mol%值，簡稱“GC比”，表示DNA分子中鳥嘌呤和胞嘧啶所占的摩爾百分比值。AT間僅形成2個氫鍵，GC間可形成3個氫鍵。GC值根據(jù)樣品的Tm值計算。4ppt課件一、DNA的堿基組成(G+C)mol%A+T+G+CG+CX通過核酸分析鑒定微生物遺傳型生物GC比的特點①親緣關系相近的種，其GC比也相近；反之，GC比相近的兩個種，它們的親緣關系則不一定都很接近。②GC比差距很大的兩個種，其親緣關系必然較遠。③GC比是建立新分類單元時的可靠指標GC比相差<2%時，沒有分類學上的意義；GC比相差在2.5%～4.0%時，為同一種的不同菌株；GC比相差>5%時，為不同種；GC比相差>10%時，為不同屬。5ppt課件通過核酸分析鑒定微生物遺傳型5ppt課件測定DNA堿基組成的方法：由于熱變性溫度法操作簡單、重復性好而最為常用。基本原理：將DNA加熱，兩條單鏈逐漸被打開，從而使DNA溶液260nm紫外吸收明顯增加，稱DNA的增色效應。G+C％增加，所需溫度也較高，當溫度高達一定值時，DNA完全分離成單鏈，此后紫外吸收不再增加。DNA的熱變性過程(即增色效應的出現(xiàn))是在一個狹窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的，紫外吸收增加的中點值所對應的溫度稱為該DNA的熱變性溫度(Tm)。在一定條件下，DNA的Tm值與DNA的G+Cmol%成正比。Tm＝69.3＋0.41（G+Cmol）％6ppt課件測定DNA堿基組成的方法：6ppt課件7ppt課件7ppt課件二、核酸分子雜交DNA-DNA雜交法DNA-rRNA雜交法rRNA-rRNA雜交法雜交同源性:>60%,同種

>70%,同一亞種

20%-60%,同一屬按堿基的互補配對原理，用人工方法對兩條不同來源的單鏈核酸進行復性（退火），以構(gòu)建新的雜合雙鏈核酸的技術(shù)8ppt課件二、核酸分子雜交DNA-DNA雜交法按堿基的互補配對原核酸的分子雜交①DNA-DNA雜交基本原理：雙鏈DNA分子加熱可變性，冷卻處理時，又可復性。不僅同一菌株的DNA單鏈可以復性結(jié)合成雙鏈，來自不同菌株的DNA單鏈，只要二者具有同源互補的堿基序列，它們也會在同源序列之間互補結(jié)合形成雙鏈，這就稱之為DNA-DNA分子雜交。不同微生物之間，DNA同源程度越高，其雜交率就越高，若兩個菌株DNA分子序列完全相同，則應100%地雜交結(jié)合。具體測定方法很多，按雜交反應的環(huán)境可分為液相雜交和固相雜交兩大類。在這些方法中，有的需要用同位素標記DNA，有的則用非同位素標記，而"復性速率法"則是通過測定單鏈DNA分子復性結(jié)合的速率來計算DNA的同源性而不需要對DNA分子進行標記。

9ppt課件核酸的分子雜交9ppt課件細菌常用固相雜交法：

（參照菌株）A菌B菌（待測）↓↓

DNADNA↓↓（同位素標記、酶切并解鏈）單鏈單鏈（固定于濾膜上，未標記）↓最適溫度復性雜交↓洗滌↓測定放射強度↓雜交率（以參照菌株自身復性的放射性值為百分之百

）

﹥60%同一個種；﹥70%同一亞種；20～60%同屬不同種對于許多有爭議的種的界定和建立新種起了重要作用

10ppt課件細菌常用固相雜交法：（參照菌株）A菌11ppt課件11ppt課件②

DNA-rRNA雜交rRNA是DNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，在生物進化過程中，其堿基序列的變化比基因組要慢得多，保守得多，它甚至保留了古老祖先的一些堿基序列。因此，當兩個菌株的DNA-DNA雜交率很低或不能雜交時，用DNA-rRNA雜交仍可能出現(xiàn)較高的雜交率，因而可以用來進一步比較關系更遠的菌株之間的關系，進行屬和屬以上等級分類單元的分類。DNA-DNA雜交和DNA-rRNA雜交的原理和方法基本相同，只是在技術(shù)細節(jié)上有些差異，如DNA-rRNA雜交中，用同位素標記的是rRNA而不是DNA等等。12ppt課件②DNA-rRNA雜交12ppt課件③核酸探針廣泛用于微生物鑒定、傳染病診斷、流行病調(diào)查、食品衛(wèi)生微生物檢測以及分子生物學許多領域。所謂核酸探針(probe)是指能識別特異核苷酸序列的、帶標記的一段單鏈DNA或RNA分子。因此，一種核苷酸片斷能否作為探針用于微生物鑒定，最根本的條件是它的特異性，即它能與所檢測的微生物的核酸雜交而不能與其他微生物的核酸雜交。根據(jù)特異性的不同，在微生物鑒定與檢測中的作用也不同，有的探針只用于某一菌型的檢測，有的可能用于某一種、屬、科甚至更大類群范圍的微生物的檢測或鑒定。例如，從一株淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)隱蔽性質(zhì)粒制備的DNA探針，它具有種的特異性，可用來檢測和鑒定這種引起人類性行為傳播疾病的細菌。13ppt課件③核酸探針13ppt課件使用核酸探針來鑒定或檢測微生物的方法，是將探針與所檢測的細菌進行雜交。在細菌鑒定或檢測臨床標本中的細菌時，常用菌落原位雜交法，大致步驟是：將細菌點種于硝酸纖維素膜上進行培養(yǎng)；加溶菌劑使細胞釋放出DNA分子；加變性劑使DNA離解成單鏈并固定于膜上；加入帶標記的核酸探針進行雜交；洗膜后進行顯色或顯影鑒定。用核酸探針來鑒定或檢測微生物，具有準確、快速等優(yōu)點，特別是當用常規(guī)方法難于鑒定和檢測時，往往更顯示其優(yōu)越性。14ppt課件14ppt課件三、rRNA寡核苷酸編目分析利用16SrRNA建立分子進化樹的美國科學家

CarlWoese

60年代末Woese開始采用寡核苷酸編目法對生物進行分類，他通過比較各類生物細胞的核糖體RNA(rRNA)特征序列，認為16SrRNA及其類似的rRNA基因序列作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標最為合適。15ppt課件三、rRNA寡核苷酸編目分析利用16SrRNA建立分子進化樹三、rRNA寡核苷酸編目分析一種通過分析原核或真核細胞中最穩(wěn)定的rRNA寡核苷酸序列同源性程度，以確定不同生物間的親緣關系和進化譜系的方法。是“三域?qū)W說”提出的科學根據(jù)。16ppt課件三、rRNA寡核苷酸編目分析一種通過分析原核或真選用rRNA做生物進化和系統(tǒng)分類的原因rRNA普遍存在,易于提取;rRNA重要恒定的生理功能;在細胞中含量高，易于提??；編碼rRNA的基因在細胞中不像質(zhì)粒DNA那樣會轉(zhuǎn)移，而是十分穩(wěn)定的

；rRNA某些核苷酸序列非常保守，歷經(jīng)進化仍能保持原初相對分子量適中原核生物rRNA：23S（2900）、16S（1540）和5S（120）真核生物rRNA：28S（4000）、18S（2300）和5.8S（160）17ppt課件選用rRNA做生物進化和系統(tǒng)分類的原因rRNA普遍存在,易于核糖體構(gòu)造和組分模式圖原核生物小亞基(30S)大亞基(50S)16SrRNA21種核糖體蛋白23SrRNA34種核糖體蛋白5SrRNA真核生物小亞基(40S)大亞基(60S)18SrRNA33種核糖體蛋白28SrRNA51種核糖體蛋白5.8SrRNA18ppt課件核糖體構(gòu)造和組分模式圖原核生物小亞基大亞基16SrRNA2

原理：用一種RNA水解酶水解rRNA后，產(chǎn)生一系列長短不一的寡核苷酸片段，電泳分離，放射自顯影技術(shù)獲得指紋圖譜，確定不同長度寡核苷酸斑點在電泳譜上的位置，找出圖譜中鏈長在6個核苷酸以上的寡核苷酸片段作序列分析，獲得的結(jié)果進行按不同長度進行編目、列表。通過比較、分析、計算，就可知道各菌株間的親緣關系大小。

若兩種或兩株微生物的親緣關系越近，則其產(chǎn)生的寡核苷酸片段的序列也越接近，反之亦然。rRNA寡核苷酸編目分析19ppt課件原理：rRNA寡核苷酸編目分析19ppt課件實驗過程：將事先用32P標記的被測菌株rRNA提純，用可專一水解G上3’端磷酸酯鍵的T1RNA酶進行水解，于是產(chǎn)生一系列以G為末端的長度不一的寡核苷酸片段，接著把它們進行雙向電泳分離，再用放射自顯影技術(shù)獲得rRNA寡核苷酸群的指紋圖譜，然后將圖譜中鏈長在6個核苷酸以上的寡核苷酸作序列分析，把獲得的結(jié)果按不同長度進行編目、列表。通過比較計算和分析，就可定量地知道各被測菌株間的親緣關系。rRNA寡核苷酸編目分析

20ppt課件實驗過程：rRNA寡核苷酸編目分析

20ppt課件培養(yǎng)微生物提取基因組DNArDNA序列測定分析比較微生物之間的系統(tǒng)發(fā)育關系16SrDNA微生物鑒定流程PCR擴增16SrDNA片段21ppt課件培養(yǎng)微生物提取基因組DNArDNA序列測定分析比較微生物之間從樣品中分離提取總微生物DNA

從樣品中提取微生物遺傳物質(zhì)DNA或RNA，這是進行PCR擴增16S

rRNA的前提。一種方法是直接提取總DNA，對易于培養(yǎng)的微生物可通過培養(yǎng)富集后再進行提取，另一種選擇是提取微生物細胞中的rRNA。RNA的提取技術(shù)相對于

DNA的提取較為復雜，一般多采用提取細胞總

DNA，但也可根據(jù)情況選擇提取

rRNA。22ppt課件從樣品中分離提取總微生物DNA

從樣品中提取微生物遺傳物質(zhì)DPCR擴增16S

rRNA基因片段

聚合酶鏈式反應

(PCR)，又稱體外基因放大技術(shù)，是將DNA樣本與寡核苷酸引物、三磷酸脫氧核苷和耐熱的TaqDNA聚合酶在一種適當?shù)木彌_液中混合，然后進行循環(huán)的擴增反應。由于PCR技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，現(xiàn)在一般采用16SrRNA引物PCR擴增總DNA中的rRNA序列，或通過反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA序列后再進行分析。采用PCR技術(shù)的優(yōu)點在于不僅一次性從混合DNA或RNA樣品中擴增出16SrRNA序列，而且方便了后面的克隆和測序。但也同樣會出現(xiàn)PCR所固有的缺點，尤其是采用16SrRNA保守序列的通用引物對多種微生物混合樣品進行擴增，可能出現(xiàn)嵌合產(chǎn)物(Chimericproduct)和擴增偏嗜性現(xiàn)象，影響結(jié)果的分析。

PCR擴增步驟如下：（1）雙鏈DNA（模板）加熱變性為單鏈；

（2）引物與模板DNA單鏈結(jié)合；(

3)

引物延伸（擴增）。

23ppt課件PCR擴增16S

rRNA基因片段

聚合酶通過

16S

rRNA基因片段分析對微生物進行分類鑒定16S

rRNA基因片段的分析方法主要包括以下4種：一是將

PCR擴增后微生物16SrDNA序列，提交到GeneBank采用BLAST程序與已知序列進行相似性分析。GenBank將按照與測得序列的相似性高低列出已知序列名單、相似性程度以及這些序列相對應的微生物種類。與16SrRNA數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較，確定其在進化樹中的位置二是通過16S

rRNA種屬特異性的探針與

PCR產(chǎn)物雜交以獲得微生物組成信息。此外,探針也可以直接與樣品進行原位雜交檢測，通過原位雜交不僅可以測定微生物的形態(tài)特征和豐度，而且能夠分析它們的空間分布。三是對

PCR產(chǎn)物進行限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR－RFLP)，通過觀察酶切電泳圖譜、數(shù)值分析，確定微生物基因的核糖體型，再同核糖體庫中的數(shù)據(jù)進行比較分析樣品中微生物組成或不同微生物的種屬關系，用以揭示微生物RFLP的多樣性。四是對PCR擴增產(chǎn)物進行梯度凝膠電泳分析，直接觀察其多樣性24ppt課件通過

16S

rRNA基因片段分析對微生物進行分類鑒定16S

通過T1RNA酶的水解，一般可使rRNA形成含有1～20個核苷酸單位的寡核苷酸片段。如果形象地把只含一個核苷酸的片段稱為“字母”的話，則含兩個以上核苷酸的片段就成了“單詞”。將含有6個“字母”以上的所有“單詞”一一測定其核苷酸序列，最后可把它們編成一部“詞典”。于是，兩個茵株rRNA的相似性就可通過查閱“詞典”來作比較。比較的具體方法是計算它們間的締合系數(shù)（associatedcoefficient）或相關系數(shù)SAB值：25ppt課件通過T1RNA酶的水解，一般可使rRNA形成含有1～

上式中，NAB是A、B兩被測菌株所共同具有的“單詞”的“字母”數(shù)，而NA和NB則是兩株菌分別具有的“單詞”的“字母”數(shù)。根據(jù)SAB值進行數(shù)值分析，就可推知它們之間的親緣關系。它的作用很大，至今Woese及其同事已對400多株細菌和放線菌進行過分析，并從其中發(fā)現(xiàn)了生命的第三種形式——古細菌，提出了生物界級分類中的“三域?qū)W說”

26ppt課件上式中，NAB是A、B兩被測菌株所共同具有的“單詞”的“字三域?qū)W說及其發(fā)展1980（Woese）16sRNA共同的祖先古細菌域：產(chǎn)甲烷細菌、極端嗜鹽菌、極端嗜酸熱菌真細菌域：除古細菌原界以外的細菌真核生物域：原生生物、真菌、動物、植物27ppt課件三域?qū)W說及其發(fā)展1980（Woese）1嗜熱菌真細菌原界紫色細菌G+細菌綠色非硫細菌藍細菌黃桿菌極端嗜鹽菌甲烷細菌極端嗜酸熱菌動物纖毛蟲真菌植物鞭毛蟲微孢蟲原始祖先RNA?真核原界古細菌原界28ppt課件嗜熱菌真細菌原界紫色細菌G+細菌綠色非硫細菌藍細菌黃桿菌極端內(nèi)共生假說現(xiàn)今一切生物都有一個共同的遠祖進化而來。小細胞先分化出細菌和古生菌。古生菌分支上的細胞喪失細胞壁后，先后吞噬了α變形細菌（相當于G-細菌）和藍細菌，并形成了內(nèi)共生，從而使兩者進化成與宿主細胞難分難解的細胞器—線粒體和葉綠體，于是宿主最終也就發(fā)展成了各類真核生物。29ppt課件內(nèi)共生假說現(xiàn)今一切生物都有一個共同的遠祖進化而來。小細胞先30ppt課件30ppt課件四、微生物基因組全序列的測定是當前國際生命科學領域中掌握某微生物的全部遺傳信息的最佳途徑。從1990年起，在人類基因組計劃（HGP）強有力的推動下，微生物全基因組測序一馬當先，進展極快，全球形成“爭測微生物的基因組”的熱鬧形勢。DNA是除少數(shù)RNA病毒以外的一切微生物的遺傳信息載體。每一種微生物都有其自身獨特而穩(wěn)定的基因組DNA序列，不同菌種間基因組序列的差異程度，代表著它們之間親緣關系的疏密。對那些與人類健康、生活和生產(chǎn)關系重大的微生物，進行全基因組DNA序列測定，是當前生物科學領域中掌握某微生物全部遺傳信息的最佳途徑，也是微生物現(xiàn)代分類鑒定中更細致和更精確的遺傳性狀指標。31ppt課件四、微生物基因組全序列的測定是當前國際生命科學領域中掌握某微Thanks!32ppt課件Thanks!32ppt課件微生物分子生物學鑒定微生物分類學定義：按微生物的親緣關系和進化規(guī)律把它們安排成條理清楚的各種分類單元或分類群的科學。33ppt課件微生物分子生物學鑒定微生物分類學定義：1ppt課件微生物的鑒定主要步驟：純化、測定一系列必要的指標、查找權(quán)威性鑒定手冊鑒定方法分四個水平：細胞的形態(tài)和習性水平：形態(tài)特征、運動、酶反應、營養(yǎng)要求及生長條件等細胞組分水平：細胞壁成分、氨基酸庫、脂類、醌類、光合色素等的分析蛋白質(zhì)水平：氨基酸序列分析、凝膠電泳和血清學反應等基因或DNA水平：核酸分子雜交、（G+C）mol%、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導、16SrRNA寡核苷酸族分分析、DNA或RNA核苷酸序列分析等34ppt課件微生物的鑒定主要步驟：純化、測定一系列必要的指標、查找權(quán)威性類別分子生物學菌種鑒定DNA堿基比例的測定16SrDNA序列分析法

全基因組序列的測定隨著分子生物學的迅速發(fā)展，細菌的分類鑒定從傳統(tǒng)的表型、生理生化分類進入到各種基因型分類水平

核酸分子雜交35ppt課件類別分子生物學DNA堿基比例的測定16SrDNA序列分析法一、DNA的堿基組成(G+C)mol%(G+C)mol%=

A+T+G+CG+CX100%

1)DNA堿基比例的測定是指（G+C）mol%值，簡稱“GC比”，表示DNA分子中鳥嘌呤和胞嘧啶所占的摩爾百分比值。AT間僅形成2個氫鍵，GC間可形成3個氫鍵。GC值根據(jù)樣品的Tm值計算。36ppt課件一、DNA的堿基組成(G+C)mol%A+T+G+CG+CX通過核酸分析鑒定微生物遺傳型生物GC比的特點①親緣關系相近的種，其GC比也相近；反之，GC比相近的兩個種，它們的親緣關系則不一定都很接近。②GC比差距很大的兩個種，其親緣關系必然較遠。③GC比是建立新分類單元時的可靠指標GC比相差<2%時，沒有分類學上的意義；GC比相差在2.5%～4.0%時，為同一種的不同菌株；GC比相差>5%時，為不同種；GC比相差>10%時，為不同屬。37ppt課件通過核酸分析鑒定微生物遺傳型5ppt課件測定DNA堿基組成的方法：由于熱變性溫度法操作簡單、重復性好而最為常用?；驹恚簩NA加熱，兩條單鏈逐漸被打開，從而使DNA溶液260nm紫外吸收明顯增加，稱DNA的增色效應。G+C％增加，所需溫度也較高，當溫度高達一定值時，DNA完全分離成單鏈，此后紫外吸收不再增加。DNA的熱變性過程(即增色效應的出現(xiàn))是在一個狹窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的，紫外吸收增加的中點值所對應的溫度稱為該DNA的熱變性溫度(Tm)。在一定條件下，DNA的Tm值與DNA的G+Cmol%成正比。Tm＝69.3＋0.41（G+Cmol）％38ppt課件測定DNA堿基組成的方法：6ppt課件39ppt課件7ppt課件二、核酸分子雜交DNA-DNA雜交法DNA-rRNA雜交法rRNA-rRNA雜交法雜交同源性:>60%,同種

>70%,同一亞種

20%-60%,同一屬按堿基的互補配對原理，用人工方法對兩條不同來源的單鏈核酸進行復性（退火），以構(gòu)建新的雜合雙鏈核酸的技術(shù)40ppt課件二、核酸分子雜交DNA-DNA雜交法按堿基的互補配對原核酸的分子雜交①DNA-DNA雜交基本原理：雙鏈DNA分子加熱可變性，冷卻處理時，又可復性。不僅同一菌株的DNA單鏈可以復性結(jié)合成雙鏈，來自不同菌株的DNA單鏈，只要二者具有同源互補的堿基序列，它們也會在同源序列之間互補結(jié)合形成雙鏈，這就稱之為DNA-DNA分子雜交。不同微生物之間，DNA同源程度越高，其雜交率就越高，若兩個菌株DNA分子序列完全相同，則應100%地雜交結(jié)合。具體測定方法很多，按雜交反應的環(huán)境可分為液相雜交和固相雜交兩大類。在這些方法中，有的需要用同位素標記DNA，有的則用非同位素標記，而"復性速率法"則是通過測定單鏈DNA分子復性結(jié)合的速率來計算DNA的同源性而不需要對DNA分子進行標記。

41ppt課件核酸的分子雜交9ppt課件細菌常用固相雜交法：

（參照菌株）A菌B菌（待測）↓↓

DNADNA↓↓（同位素標記、酶切并解鏈）單鏈單鏈（固定于濾膜上，未標記）↓最適溫度復性雜交↓洗滌↓測定放射強度↓雜交率（以參照菌株自身復性的放射性值為百分之百

）

﹥60%同一個種；﹥70%同一亞種；20～60%同屬不同種對于許多有爭議的種的界定和建立新種起了重要作用

42ppt課件細菌常用固相雜交法：（參照菌株）A菌43ppt課件11ppt課件②

DNA-rRNA雜交rRNA是DNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，在生物進化過程中，其堿基序列的變化比基因組要慢得多，保守得多，它甚至保留了古老祖先的一些堿基序列。因此，當兩個菌株的DNA-DNA雜交率很低或不能雜交時，用DNA-rRNA雜交仍可能出現(xiàn)較高的雜交率，因而可以用來進一步比較關系更遠的菌株之間的關系，進行屬和屬以上等級分類單元的分類。DNA-DNA雜交和DNA-rRNA雜交的原理和方法基本相同，只是在技術(shù)細節(jié)上有些差異，如DNA-rRNA雜交中，用同位素標記的是rRNA而不是DNA等等。44ppt課件②DNA-rRNA雜交12ppt課件③核酸探針廣泛用于微生物鑒定、傳染病診斷、流行病調(diào)查、食品衛(wèi)生微生物檢測以及分子生物學許多領域。所謂核酸探針(probe)是指能識別特異核苷酸序列的、帶標記的一段單鏈DNA或RNA分子。因此，一種核苷酸片斷能否作為探針用于微生物鑒定，最根本的條件是它的特異性，即它能與所檢測的微生物的核酸雜交而不能與其他微生物的核酸雜交。根據(jù)特異性的不同，在微生物鑒定與檢測中的作用也不同，有的探針只用于某一菌型的檢測，有的可能用于某一種、屬、科甚至更大類群范圍的微生物的檢測或鑒定。例如，從一株淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)隱蔽性質(zhì)粒制備的DNA探針，它具有種的特異性，可用來檢測和鑒定這種引起人類性行為傳播疾病的細菌。45ppt課件③核酸探針13ppt課件使用核酸探針來鑒定或檢測微生物的方法，是將探針與所檢測的細菌進行雜交。在細菌鑒定或檢測臨床標本中的細菌時，常用菌落原位雜交法，大致步驟是：將細菌點種于硝酸纖維素膜上進行培養(yǎng)；加溶菌劑使細胞釋放出DNA分子；加變性劑使DNA離解成單鏈并固定于膜上；加入帶標記的核酸探針進行雜交；洗膜后進行顯色或顯影鑒定。用核酸探針來鑒定或檢測微生物，具有準確、快速等優(yōu)點，特別是當用常規(guī)方法難于鑒定和檢測時，往往更顯示其優(yōu)越性。46ppt課件14ppt課件三、rRNA寡核苷酸編目分析利用16SrRNA建立分子進化樹的美國科學家

CarlWoese

60年代末Woese開始采用寡核苷酸編目法對生物進行分類，他通過比較各類生物細胞的核糖體RNA(rRNA)特征序列，認為16SrRNA及其類似的rRNA基因序列作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標最為合適。47ppt課件三、rRNA寡核苷酸編目分析利用16SrRNA建立分子進化樹三、rRNA寡核苷酸編目分析一種通過分析原核或真核細胞中最穩(wěn)定的rRNA寡核苷酸序列同源性程度，以確定不同生物間的親緣關系和進化譜系的方法。是“三域?qū)W說”提出的科學根據(jù)。48ppt課件三、rRNA寡核苷酸編目分析一種通過分析原核或真選用rRNA做生物進化和系統(tǒng)分類的原因rRNA普遍存在,易于提取;rRNA重要恒定的生理功能;在細胞中含量高，易于提取；編碼rRNA的基因在細胞中不像質(zhì)粒DNA那樣會轉(zhuǎn)移，而是十分穩(wěn)定的

；rRNA某些核苷酸序列非常保守，歷經(jīng)進化仍能保持原初相對分子量適中原核生物rRNA：23S（2900）、16S（1540）和5S（120）真核生物rRNA：28S（4000）、18S（2300）和5.8S（160）49ppt課件選用rRNA做生物進化和系統(tǒng)分類的原因rRNA普遍存在,易于核糖體構(gòu)造和組分模式圖原核生物小亞基(30S)大亞基(50S)16SrRNA21種核糖體蛋白23SrRNA34種核糖體蛋白5SrRNA真核生物小亞基(40S)大亞基(60S)18SrRNA33種核糖體蛋白28SrRNA51種核糖體蛋白5.8SrRNA50ppt課件核糖體構(gòu)造和組分模式圖原核生物小亞基大亞基16SrRNA2

原理：用一種RNA水解酶水解rRNA后，產(chǎn)生一系列長短不一的寡核苷酸片段，電泳分離，放射自顯影技術(shù)獲得指紋圖譜，確定不同長度寡核苷酸斑點在電泳譜上的位置，找出圖譜中鏈長在6個核苷酸以上的寡核苷酸片段作序列分析，獲得的結(jié)果進行按不同長度進行編目、列表。通過比較、分析、計算，就可知道各菌株間的親緣關系大小。

若兩種或兩株微生物的親緣關系越近，則其產(chǎn)生的寡核苷酸片段的序列也越接近，反之亦然。rRNA寡核苷酸編目分析51ppt課件原理：rRNA寡核苷酸編目分析19ppt課件實驗過程：將事先用32P標記的被測菌株rRNA提純，用可專一水解G上3’端磷酸酯鍵的T1RNA酶進行水解，于是產(chǎn)生一系列以G為末端的長度不一的寡核苷酸片段，接著把它們進行雙向電泳分離，再用放射自顯影技術(shù)獲得rRNA寡核苷酸群的指紋圖譜，然后將圖譜中鏈長在6個核苷酸以上的寡核苷酸作序列分析，把獲得的結(jié)果按不同長度進行編目、列表。通過比較計算和分析，就可定量地知道各被測菌株間的親緣關系。rRNA寡核苷酸編目分析

52ppt課件實驗過程：rRNA寡核苷酸編目分析

20ppt課件培養(yǎng)微生物提取基因組DNArDNA序列測定分析比較微生物之間的系統(tǒng)發(fā)育關系16SrDNA微生物鑒定流程PCR擴增16SrDNA片段53ppt課件培養(yǎng)微生物提取基因組DNArDNA序列測定分析比較微生物之間從樣品中分離提取總微生物DNA

從樣品中提取微生物遺傳物質(zhì)DNA或RNA，這是進行PCR擴增16S

rRNA的前提。一種方法是直接提取總DNA，對易于培養(yǎng)的微生物可通過培養(yǎng)富集后再進行提取，另一種選擇是提取微生物細胞中的rRNA。RNA的提取技術(shù)相對于

DNA的提取較為復雜，一般多采用提取細胞總

DNA，但也可根據(jù)情況選擇提取

rRNA。54ppt課件從樣品中分離提取總微生物DNA

從樣品中提取微生物遺傳物質(zhì)DPCR擴增16S

rRNA基因片段

聚合酶鏈式反應

(PCR)，又稱體外基因放大技術(shù)，是將DNA樣本與寡核苷酸引物、三磷酸脫氧核苷和耐熱的TaqDNA聚合酶在一種適當?shù)木彌_液中混合，然后進行循環(huán)的擴增反應。由于PCR技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，現(xiàn)在一般采用16SrRNA引物PCR擴增總DNA中的rRNA序列，或通過反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA序列后再進行分析。采用PCR技術(shù)的優(yōu)點在于不僅一次性從混合DNA或RNA樣品中擴增出16SrRNA序列，而且方便了后面的克隆和測序。但也同樣會出現(xiàn)PCR所固有的缺點，尤其是采用16SrRNA保守序列的通用引物對多種微生物混合樣品進行擴增，可能出現(xiàn)嵌合產(chǎn)物(Chimericproduct)和擴增偏嗜性現(xiàn)象，影響結(jié)果的分析。

PCR擴增步驟如下：（1）雙鏈DNA（模板）加熱變性為單鏈；

（2）引物與模板DNA單鏈結(jié)合；(

3)

引物延伸（擴增）。

55ppt課件PCR擴增16S

rRNA基因片段

聚合酶通過

16S

rRNA基因片段分析對微生物進行分類鑒定16S

rRNA基因片段的分析方法主要包括以下4種：一是將

PCR擴增后微生物16SrDNA序列，提交到GeneBank采用BLAST程序與已知序列進行相似性分析。GenBank將按照與測得序列的相似性高低列出已知序列名單、相似性程度以及這些序列相對應的微生物種類。與16SrRNA數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較，確定其在進化樹中的位置二是通過16S

rRNA種屬特異性的探針與

PCR產(chǎn)物雜交以獲得微生物組成信息。此外,探針也可以直接與樣品進行原位雜交檢測，通過原位雜交不僅可以測定微生物的形態(tài)特征和豐度，而且能夠分析它們的空間分布。三是對

PCR產(chǎn)物進行限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR－RFLP)，通過觀察酶切電泳圖譜、數(shù)值分析，確定微生物基因的