基因工程試題及答案全集

基因工程試題及答案全集基因工程試題及答案全集基因工程試題及答案全集資料僅供參考文件編號：2022年4月基因工程試題及答案全集版本號：A修改號：1頁次：1.0審核：批準:發(fā)布日期：作業(yè)一：一、名詞解釋：1、基因：是遺傳的物質基礎，是DNA（脫氧核糖核酸）分子上具有遺傳信息的特定核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應的DNA分子片段。2、基因組該指單倍體細胞中包括編碼序列和非編碼序列在內的全部DNA分子3、操縱子:原核生物的幾個功能相關的結構基因往往排列在一起，轉錄生成一個mRNA，然后分別翻譯成幾種不同的蛋白質。這些蛋白可能是催化某一代謝過程的酶，或共同完成某種功能。這些結構基因與其上游的啟動子，操縱基因共同構成轉錄單位，稱操縱子。4、啟動子:是RNA聚合酶結合位點周圍的一組轉錄控制組件，包括至少一個轉錄起始點。在真核基因中增強子和啟動子常交錯覆蓋或連續(xù)。有時，將結構密切聯系而無法區(qū)分的啟動子、增強子樣結構統稱啟動子。5、增強子:是一種能夠提高轉錄效率的順式調控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現的長約200bp的一段DNA，可使旁側的基因轉錄提高100倍，其后在多種真核生物，甚至在原核生物中都發(fā)現了增強子。增強子通常占100～200bp長度，也和啟動子一樣由若干組件構成，基本核心組件常為8～12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。6、基因表達：是指細胞在生命過程中，把儲存在DNA順序中遺傳信息經過轉錄和翻譯，轉變成具有生物活性的蛋白質分子。二、簡答題1、說明限制性內切核酸酶的命名原則要點。答：限制性內切核酸酶采用三字母的命名原則,即屬名+種名+株名的各一個首字母,再加上序號.基本原則:3-4個字母組成,方式是:屬名+種名+株名+序號;首字母:取屬名的第一個字母,且斜體大寫;第二字母:取種名的第一個字母,斜體小寫;第三字母:(1)取種名的第二個字母,斜體小寫;(2)若種名有詞頭,且已命名過限制酶,則取詞頭后的第一字母代替.第四字母:若有株名,株名則作為第四字母,是否大小寫,根據原來的情況而定,但用正體.順序號:若在同一菌株中分離了幾種限制酶,則按先后順序冠以I,Ⅱ,Ⅲ,…等,用正體.2、什么是限制性內切核酸酶的星號活性受哪些因素影向答：Ⅱ類限制酶雖然識別和切割的序列都具有特異性，但是這種特異性受特定條件的限制，即在一定環(huán)境條件下表現出來的特異性。條件的改變，限制酶的特異性就會松動，識別的序列和切割都有一些改變，改變后的活性通常稱第二活性，而將這種因條件的改變會出現第二活性的酶的右上角加一個星號表示，因此第二活性又稱為星號活性。

概括起來，誘發(fā)星活性的因素有如下幾種：

(1)高甘油含量(>5％,

v／v)；

(2)限制性內切核酸酶用量過高(>100U／ugDNA)；

(3)低離子強度(<25

mmol／L)；

(4)高pH以上)；(5)含有有機溶劑，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二價陽離子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。3、影響DNA連接酶催化連接反應的因素有哪些？

答：（1）DNA的純度（2）DNA甲基化的程度（3）酶切消化反應的溫度（4）DNA的分子結構（5）核酸內切限制酶的緩沖液4、什么是Klenow酶有哪些活性在基因工程中有什么作用答：Klenow酶是1974年Klenow用枯草桿菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到兩個片段，其中大片段的分子量為75kDa，它具有5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性，小片段具有5'-3'外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中會降解5'引物的5'-3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。Klenow酶主要有下列用途：(1)修復反應，制備平末端可用Klenow酶修復限制性內切核酸酶或其他方法產生的5'或3'突出末端，制備平末端，這樣可以使原來具有不相容的黏性末端的DNA片段通過平末端重組。如在反應系統中加入放射性同位素標記的脫氧核苷酸，用這種末端填補的方法可以制備3'末端標記的探針。用Klenow酶修復5'突出末端的反應主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填補反應；而修復3'突出末端則是用Klenow酶的3'-5'外切核酸酶的活性，是切割反應。用Klenow酶的切割反應來修復3'突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的選擇。(2)標記DNA3'突出末端(protrudingend)該反應分兩步進行：先用3'-5'的外切核酸酶活性除去3'突出末端，產生3'隱含末端，然后在高濃度的標記底物(-32p-dNTP)存在下，使降解(3'-5')作用與聚合(5'-3')作用達到平衡。這種反應也叫交換或取代反應(exchange／replacementreaction)。不過這一反應用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的3'-5'外切核酸酶活性較強。(3)其他的一些用途：包括用雙脫氧末端終止法進行DNA序列分析、用于cDNA第二鏈的合成、在定點突變中用于合成第二鏈、用引物延伸法(primerextension)制備單鏈DNA探針等。5、細菌堿性磷酸酯酶和小牛腸堿性磷酸酯酶有什么不同在基因工程中有什么用途答：主要差別是：CIP68°C時失活，而BAP(1)dsDNA的5'端脫磷酸，防止DNA的自身連接。但是用CIP處理后，最好將CIP除去后，再進行連接反應。(2)DNA和RNA脫磷酸，然后用于多核苷酸激酶進行末端標記。三、論述題1、如果知道某一基因的功能及其相應的蛋白質的氨基酸序列組成，可以通過何種方法克隆該基因?答：可以通過合成核苷酸探針或設計簡并PCR引物從cDNA文庫或基因組文庫中篩選?；蛘呃孟鄳目贵w從cDNA表達文庫中篩選相應的克隆。作業(yè)二：一、名詞解釋：1、基因工程：在體外將外源基因進行切割并與一定的載體連接，構成重組DNA分子并導入相應受體細胞，使外源基因在受體細胞中進行復制、表達，使目的基因大量擴增或得到相應基因的表達產物或進行定向改造生物性狀。簡單概括，就是將外源目的基因與載體重組后再進入宿主細胞的過程。2、載體：能載帶微量物質共同參與某種化學或物理過程的常量物質，在基因工程重組DNA技術中將DNA片段（目的基因）轉移至受體細胞的一種能自我復制的DNA分子。三種最常用的載體是細菌質粒、噬菌體和動植物病毒。3、轉化：指將質?；蚱渌庠碊NA導入處于感受態(tài)的宿主菌，并使其獲得新的表型的過程。4、感染：利用噬菌體將外源DNA導入宿主細胞的方法。5、轉導：由噬菌體將一個細胞的基因傳遞給另一細胞的過程。它是細菌之間傳遞遺傳物質的方式之一。其具體含義是指一個細胞的DNA或RNA通過病毒載體的感染轉移到另一個細胞中。6、轉染：指真核細胞主動攝取或被動導入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。常用的方法有電穿孔法，磷酸鈣共沉淀法，脂質體融合法等。二、簡答題1、YAC載體具有什么樣的功能性DNA序列？為什么在克隆大片段時，YAC具有優(yōu)越性？答：YAC帶有天然染色體所有的功能元件，包括一個著絲粒，一個DNA復制起點，兩個端粒。YAC能夠容納長達幾百kb的外源DNA，這是質粒和黏粒辦不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時能夠減少完整基因組文庫所需的克隆數目。2、列舉質粒載體必須具備的4個基本特性。答：(1)獨立復制；(2)有選擇標記；(3)有獨特的酶切位點；(4)能轉化但不擴散。3、PCR的基本原理是什么？用PCR擴增某一基因，必須預先得到什么樣的信息？答：)DNA半保留復制的原理，在體外進行DNA的變性、復性和引物延伸。(2)至少要預先知道足夠合成一對引物的靶DNA序列。4、cDNA克隆與基因組克隆有何不同？

答：基因組克隆包含所有不在cDNA中出現的內含子。5、怎樣將一個平末端DNA片段插入到EcoRI限制位點中去？

答：化學合成一些長為10bp含有EcoRI識別位點的短的DNA片段，然后與待克隆片段兩端連接起來，如果用EcoRI切割這種連接片段，就會產生EcoRI的單鏈末端。這種片段就可以插入到任何EcoRI的限制性內切酶位點中。三、論述題什么是Western印跡？它與Southern印跡有什么不同答：Western印跡是將蛋白質經電泳分離后從凝膠中轉移到固相支持物上，然后用特異性的抗體進行檢測。它與Southern的不同在于探針的性質不同，在Western印跡中使用的探針是抗體(蛋白質)。作業(yè)三：一、名詞解釋1、DNA變性：DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結構松解為無規(guī)則線性結構的現象。變性時維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結構的改變。2、DNA復性：變性DNA在適當條件下,二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現象,它是變性的一種逆轉過程。3、退火：指模板雙鏈DNA經熱變性，螺旋解開成單鏈后，通過緩慢冷卻到55℃左右，使引物(即具有互補堿基的RNA片段)與該模板DNA單鏈重新配對，形成新的雙鏈分子的過程。4、DNA芯片：是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，即可獲得樣品的遺傳信息。由于常用計算機硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。5、錯義突變：堿基替換的結果引起氨基酸順序的變化。6、基因診斷：又稱DNA診斷或分子診斷，通過分子生物學和分子遺傳學的技術，直接檢測出分子結構水平和表達水平是否異常，從而對疾病做出判斷。二、簡答題1、什么是藍白斑篩選法？

答：這種方法是根據組織化學的原理來篩選重組體。主要是在載體的非必要區(qū)插入一個帶有大腸桿菌—半乳糖苷酶的基因片段，攜帶有l(wèi)ac基因片段的載體轉入lac的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚——D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成淺藍色的噬菌斑。外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后，重組的噬菌體將喪失分解X-gal的能力，轉入lac-宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚——D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重組的噬菌體則為藍色噬菌斑。2、什么是基因文庫？

用重組DNA技術將某種生物細胞的總DNA或染色體DNA的所有片斷隨機地連接到基因載體上,然后轉移到適當的宿主細胞中，通過細胞增殖而構成各個片段的無性繁殖系（克?。?，在制備的克隆數目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內的情況下，這一組克隆的總體就被稱為某種生物的基因文庫。3、黏性末端連接法是最常用的連接方法，具有許多優(yōu)點，但是也有一些不足，請指出這些不足之處。答：黏性末端連接法不足之處有：(1)載體易自身環(huán)化；(2)若是用同一種限制性內切核酸酶產生的黏性末端連接又不易定向克??；(3)難插入特定的基因；(4)再者就是大片段DNA的重組率較低，即使用堿性磷酸酶處理了載體，防止了載體的自身環(huán)化，載體也有成環(huán)的傾向；(5)用這種方法產生的重組體往往含有不止一個外源片段或不止一個載體連接起來的串聯重組體，增加篩選工作的困難。4、什么是同聚物加尾連接法用何種方法加尾具有哪些優(yōu)缺點答：所謂同聚物加尾法就是利用末端轉移酶在載體及外源雙鏈DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和載體DNA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸，如dA(dG)和dT(dC),然后在DNA連接酶的作用下漣接成為重組的DNA。這種方法的核心是利用末端轉移酶的功能，將核苷酸轉移到雙鏈DNA分子的突出或隱蔽的3'-OH上。以Mg2+作為輔助因子，該酶可以在突出的3'-OH端逐個添加單核苷酸，如果用Co2+作輔助因子則可在隱蔽的或平末端的3'-OH同聚物加尾法實際上是一種人工黏性末端連接法，具有很多優(yōu)點：．(1)首先不易自身環(huán)化，這是因為同一種DNA的兩端的尾巴是相同的，所以不存在自身環(huán)化。(2)因為載體和外源片段的末端是互補的黏性末端，所以連接效率較高。(3)用任何一種方法制備的DNA都可以用這種方法進行連接。同聚物加尾法也有一些不便之處：(1)方法繁瑣；(2)外源片段難以回收。由于添加了許多同聚物的尾巴，可能會影響外源基因的表達。另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端連接法一樣，重組連接后往往會產生某種限制性內切核酸酶的切點。5、何謂接頭連接法？

答：將人工合成的或來源于現有質粒的一小段DNA分子(在這一小段DNA分子上有某種限制性內切核酸酶的識別序列)，加到載體或外源DNA的分子上，這樣便在載體DNA和外源DNA上制造出新的酶切點。把這一小段含有酶切點的DNA分子稱為連接器分子，這種方法稱為接頭連接法。三、論述題1、什么是基因組文庫(genomiclibrary)

構建基因組文庫，涉及哪些基本過程它同遺傳學上的基因庫有什么不同答：基因組文庫是用基因工程的方法，人工構建的含有某一生物基因組DNA的各種片段的克隆群。一般以改造的噬菌體DNA或黏粒作為載體，包括下列過程：(1)高分子量染色體DNA的制備；(2)體外重組連接；(3)包裝蛋白的制備；(4)重組體的體外包裝；(5)將重組DNA導人寄主細胞；(6)篩選?；蚪M文庫同遺傳學上所講的基因庫是完全不同的概念。基因庫(genepool)是指在進行有性生殖的某一群體中，能進行生殖的個體所含總的遺傳信息。在基因組文庫的構建中，由于使用的載體不同，分為噬菌體載體和黏粒載體構建的基因組文庫、YAC文庫、BAC文庫等。作業(yè)四：一、名詞解釋1、DNA重組：是由于不同DNA鏈的斷裂和連接而產生DNA片段的交換和重新組合，形成新DNA分子的過程。2、克?。嚎茖W家把人工遺傳操作動物繁殖的過程叫克隆，這門生物技術叫克隆技術，其本身的含義是無性繁殖，即由同一個祖先細胞分裂繁殖而形成的純細胞系，該細胞系中每個細胞的基因彼此相同。3、DNA克隆：應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質——同源或異源、原核或真核、天然或人工的DNA與載體DNA相結合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子，繼而通過轉化或轉染宿主細胞、篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增、提取獲得大量同一DNA分子，即DNA克隆。4、目的基因：把需要研究的基因稱為目的基因。（一般把需要分析的基因稱靶基因，在基因克隆過程中有時兩者均稱為插入基因，有時三者含義相近。）5、基因載體：基因載體是把基因導入細胞的工具，他的作用是①運載目的基因進入宿主細胞，②使之能得到復制和進行表達。6、質粒：質粒（plasmid）是細菌擬核裸露DNA外的遺傳物質，為雙股閉合環(huán)形的DNA,存在于細胞質中，質粒編碼非細菌生命所必須的某些生物學性狀，如性菌毛、細菌素、毒素和耐藥性等。質粒具有可自主復制、傳給子代、也可丟失及在細菌之間轉移等特性，與細菌的遺傳變異有關。二、簡答題1、常用的工具酶有哪些其主要用途是什么答：限制性內切核酸酶,DNA聚合酶和Klenow大片段,DNA連接酶,堿性磷酸酶,末端脫氧核苷酸轉移酶.限制性內切核酸酶,能夠識別特異的DNA堿基序列，DNA堿基序列往往呈回文對稱結構；DNA聚合酶a位于細胞核內，也許是復合物，有催化細胞增生的作用；Klenow大片段它也可以通過基因工程得到，分子量為76kDa。DNA連接酶負責雙鏈DNA中相鄰3`-OH與5`-磷酸基團之間的磷酸二酯鍵的形成。堿性磷酸酯酶的作用是從DNA或RNA的三磷酸核苷酸上除去5`磷酸根殘基。末端轉移酶的作用是將脫氧核糖核苷酸通過磷酸二酯鍵加到DNA分子的3`-OH末端。2、重組DNA技術常包括哪些基本步驟答：①獲得目的基因；②與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子；③用重組DNA分子轉化受體細胞，并能在受體細胞中復制和遺傳；④對轉化子篩選和鑒定。在具體工作中選擇哪條技術路線；⑤對獲得外源基因的細胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達出所需要的產物。主要取決于基因的來源、基因本身的性質和該項遺傳工程的目的。3、常用的目的基因的獲取方法有哪些答：直接獲取從基因文庫中提取目的基因，使用PCR擴增技術獲得目的基因;人工合成.4、常用的目的基因與載體的連接方法有哪些答：外源DNA片段同載體分子連接的方法，即DNA分子體外重組技術，主要是依賴于核酸內切限制酶和DNA連接酶的作用．一般說來在選擇外源DNA同載體分子連接反應程序時，需要考慮到下列三個因素：（1）實驗步驟要盡可能地簡單易行；（2）連接形成的"接點”序列，應能被一定的核酸內切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段；（3）對轉錄和轉譯過程中密碼結構的閱讀不發(fā)生干擾。5、解釋質粒，為什么質?？勺鳛榛蜉d體。答：質粒是細菌擬核裸露DNA外的遺傳物質。質粒：（1）具有較小的分子量。經驗表明，為了避免在DNA的純化過程中發(fā)生鏈的斷裂，克隆載體的分子大小最好不要超過10Kb。pBR322質粒這種小分子量的特點，不僅易于自身DNA的純化，而且可容納較大的外源DNA片段；（2）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號，能指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞以及外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。三、論述題1、何謂限制性核酸內切酶？寫出大多數限制性核酸內切酶識DNA序列的結構特點。答：限制性核酸內切酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特異性核苷酸序列并由此特異切割DNA雙鏈結構的水解酶.是在DNA分子內部切割，水解磷酸二酯鍵的核酸內切酶。能夠識別特異的DNA堿基序列，DNA堿基序列往往呈回文對稱結構；并具有特異切割位點。作業(yè)五：一、名詞解釋1、限制性核酸內切酶：是由細菌產生的一類能特異識別雙鏈DNA中的特定堿基序列，并在識別位點切割磷酸二酯鍵的核酸內切酶(簡稱限制酶)。2、基因文庫：將所有的重組DNA分子都導入宿主細胞進行擴增，得到分子克隆的混合體，這樣一個混合體稱為基因文庫。3、cDNA文庫：從組織細胞中分離得到純化的mRNA，然后以mRNA為模板，利用逆轉錄酶合成其互補DNA，再復制成雙鏈cDNA片段，與適當載體連接后導入受體菌內，擴增，構建cDNA文庫。4、RFLP：RFLP標記是發(fā)展最早的DNA標記技術。RFLP是指基因型之間限制性片段長度的差異，這種差異是由限制性酶切位點上堿基的插入、缺失、重排或點突變所引起的。5、核酸探針：是指與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子?？贵w-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生長因子-受體的相互作用都可以看作是探針與靶分子的相互作用。6、轉錄：轉錄是遺傳信息由DNA轉換到RNA的過程。作為蛋白質生物合成的第一步，轉錄是mRNA以及非編碼RNA（tRNA、rRNA等）的合成步驟。二、簡答題：1、試回答影響限制性內切核酸酶切割效率的因素？

答：外因：是可以預見的，如反應條件（緩沖液、反應溫度、反應時間、終止酶切的方法）、底物的純度（是否有雜質、是否有鹽酚的污染）、何時加酶、操作是否恰當、反應體積等等;內因：星星活性、末端長度、位點偏愛、甲基化底物、底物的構象。2、何為載體一個理想的載體應具備那些特點答：將外源DNA或基因攜帶入宿主細胞（hostcell）的工具稱為載體載體具備的特點：①在宿主細胞內必須能夠自主復制（具備復制原點）②必須具備合適的酶切位點，供外源DNA片段插入，同時不影響其復制③有一定的選擇標記，用于篩選④最好具有較高的拷貝數，便于制備。3、什么叫基因工程（GeneEngineering），試從理論和技術兩個方面談談GeneEngineering誕生的基礎？

答：基因工程：在體外將核酸分子插入病毒、質?；蚱渌d體分子，構成遺傳物質的新組合，并使之參入到原來沒有這類分子的宿主細胞內，而能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖。理論基礎：近幾十年來，由于受到分子生物學、分子遺傳學發(fā)展的影響，基因分子生物學的研究取得了前所未有的進步。而這些學科的綜合成就，又為基因工程的誕生奠定了堅實的理論基礎：①在40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質，從而明確了遺傳的物質基礎問題；②在50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結構模型和半保留復制機理，解決了基因的自我復制和傳遞的問題；③在50年代末期和60年代，相繼提出了"中心法則"和操縱子學說，并成功地破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達問題。技術基礎：①60年代-70年代，限制性核酸內切酶和DNA連接酶解決了對DNA分子進行體外的切割和連接；②基因克隆載體的出現③大腸桿菌轉化體系的建立④60年代發(fā)展的瓊脂糖凝膠電泳和Southern轉移雜交技術對DNA片段的分離和檢測十分有用。4、抗性基因是目前使用的最廣泛的選擇標記，常用的抗生素抗性有哪幾種并舉兩例說明其原理答：氨芐青霉素抗性基因ampr、四環(huán)素抗性基因tetr、氯霉素抗性基因Cmr、卡那霉素和新霉素抗性基因kanr①氨芐青霉素抗性基因ampr:青霉素可抑制細胞壁肽聚糖的合成，與有關的酶結合并抑制其活性，抑制轉肽反應.氨芐青霉素抗性基因編碼一個酶，該酶可分泌進入細菌的周質區(qū)，抑制轉肽反應并催化b-內酰胺環(huán)水解（水解青霉素），從而解除了氨芐青霉素的毒性。②四環(huán)素抗性基因tetr：四環(huán)素可與核糖體30S亞基的一種蛋白質結合，從而抑制核糖體的轉位。四環(huán)素抗性基因編碼一個由399個氨基酸組成的膜結合蛋白，可阻止四環(huán)素進入細胞。5、YAC載體具有什么樣的功能性元件為什么它在克隆大片段時具有很大的優(yōu)越性答：YAC帶有天然染色體所有的功能元件，包括自主復制序列ARS，一個著絲粒，兩個端粒，選擇標記，篩選模型。優(yōu)越性：YAC能夠容納長達幾百Kb的外源DNA，這是質粒和粘粒辦不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時能夠減少完整基因組文庫所需的克隆數目。YAC有靈活性，可作為質粒在中增殖；與大片段連接時，可導入酵母，作為真正染色體在酵母復制中有絲分裂。三、論述題1、分析比較瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳的異同點？

答：同：①原理相同。瓊脂糖、聚丙烯酰胺均為無反應活性的穩(wěn)定支持介質，可降低對流運動，故使電場中的分子電泳遷移率僅與分子的摩擦系數成反比。在一定電場強度下，DNA分子的遷移率取決于核酸分子的大小和構象。②凝膠濃度的高低影響凝膠介質孔隙大小；濃度越高，空隙越小，其分辨能力也就越強；反之，濃度降低，空隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。異：瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為之間；而聚丙烯酰胺分辨DNA片段的范圍為1-1000bp，分離小片段效果最好，分辨率極高，相差1bp的DNA也可分開。分子克隆技術:指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術克?。菏侵笍囊粋€共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上相同的DNA分子、細胞或個體所組成的特殊的生命群體載體：攜帶外源DNA進入宿主細胞的工具?；瘜W本質：DNA1.運送外源基因高效轉入受體細胞2.為外源基因提供復制能力或整合能力3.為外源基因的擴增或表達提供條件?；蚬こ痰暮x：按照預先設計好的藍圖，利用現代分子生物學技術，特別是酶學技術，對一種生物（供體）的遺傳物質（DNA）直接進行體外重組操作與改造，并轉移到另外一種生物（受體）中去，從而實現受體生物的定向改造與改良。黏性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結構，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環(huán)化起來DNA連桿，是指用化學方法合成的一段由10～12個核苷酸組成的、具有一個或數個限制酶識別位點的寡核苷酸片段。DNA接頭它是一類由人工合成的一頭具有某種限制性內切酶粘末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸片段。當它的平末端與平末端的外源DNA片段連接之后，便會使后者成為具黏性末端的新的DNA分子，而易于連接重組。載體：攜帶外源DNA進入宿主細胞，并為其提供復制和功能基因表達調控系統的工具。目的基因：基因工程中克隆的目標DNA分子SD序列：mRNA中起始密碼子上游8-13個核苷酸處有一段富含嘌呤核苷酸的順序，它可以與30S亞基中的16SrRNA3’端富含嘧啶的尾部互補，形成氫鍵結合，有助于mRNA的翻譯從起始密碼子處開始啟動子：DNA分子與RNA聚合酶特異結合的部位，也是轉錄開始的部位基因組文庫：某種生物的基因組的全部遺傳信息通過克隆載體貯存在一個受體菌的群體之中，這個群體即為該生物的基因組文庫。cDNA：以mRNA為模板合成的互補脫氧核糖核苷酸序列。cDNA文庫：某種生物基因組轉錄的的全部mRNA經反轉錄產生的各種cDNA分別與克隆載體重組，貯存在一個受體菌的群體中，這個群體就稱為cDNA文庫。轉化：受體菌直接吸收供體菌的DNA片斷而獲得后者部分遺傳性狀的現象。轉化子（transformant）：通過轉化方式而形成的雜種后代。感受態(tài)：指受體細胞最易接受外源DNA片斷并能實現轉化的一種生理狀態(tài)。轉染：將重組λDNA分子直接導入受體細胞的過程。轉導：通過λ噬菌體顆粒感染宿主細胞的途徑把外源DNA分子轉移到受體細胞內的過程重組子的篩選：經過各種方法將外源DNA分子導入受體，獲得所需目的重組子的過程選擇：轉化子的初步篩選：通過某種外加壓力（如：抗生素）的辨別作用，呈現具有重組DNA分子的特定克隆子的一種方法。篩選：進一步檢測目的重組子：通過某種特定的方法，從受體細胞群體或基因文庫中，鑒定出目的重組子的過程。啟動子：DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列SD序列：核糖體結合位點終止子：在一個基因的3’端或是一個操縱子的3’端往往還有一特定的核苷酸序列，它有終止轉錄的功能，這一DNA序列稱為轉錄終止子融合蛋白：是指蛋白質的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼。轉染：將重組λDNA分子直接導入受體細胞的過程。轉導：通過λ噬菌體顆粒感染宿主細胞的途徑把外源DNA分子轉移到受體細胞內的過程重組子：含有重組DNA分子的轉化子轉化子：導入外源DNA分子后穩(wěn)定存在的受體細胞供體、受體、載體是DNA重組技術的三大基本元件DNA體外重組的基本步驟1.目的基因的獲?。簭膹碗s的生物基因組中，經過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。2.重組體的制備：將目的基因的DNA片斷插入到能自我復制并帶有選擇性標記的載體分子上。3.重組體的轉化：將重組體（載體）轉入適當的受體細胞中。4.克隆鑒定：篩選轉化成功的細胞克?。ê心康幕颍?.目的基因表達：使導入寄主細胞的目的基因表達出我們所需要的基因產物?；蚬こ痰幕静僮鞑襟E：1.目的基因的獲取從復雜的生物基因組中，經過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。2.重組體的制備將目的基因的DNA片斷插入到能自我復制并帶有選擇性標記。3.重組體的轉化將重組體（載體）轉入適當的受體細胞中。4.克隆鑒定篩選轉化成功的細胞克?。ê心康幕颍?.目的基因表達使導入寄主細胞的目的基因表達出我們所需要的基因產物載體應具備的條件：1.具有對受體細胞的可轉移2.具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點3.長度盡可能小，以提高其載裝能力4.具有多種單一的酶切位點5.具有合適的選擇性標記。限制性內切酶的命名原則前3個字母代表來源的生物,隨后1個字母或阿拉伯數字代表菌株,最后1個羅馬字母代表發(fā)現或鑒定的次序staractivity高濃度的酶（>100U/g）、高濃度的甘油（>5%）、低離子強度（<25mM）、極端pH值(>等，會使一些核酸內切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的staractivity現象.抑制staractivity的措施①減少酶的用量，避免過量酶切，減少甘油濃度②保證反應體系中無有機溶濟或乙醇③提高離子強度到100～150mM④降低反應pH至⑤使用Mg2+作為二價陽離子DNA連接酶需要在一條DNA鏈的3’-末端具有一個游離的羥基(-OH)，和在另一條DNA鏈的5’體外連接DNA片段的方式黏性末端同種內切酶產生的黏性末端的連接，同尾酶產生的黏性末端的連接，不同黏性末端的連接。平末端的直接連接，末端修飾后的連接，加上連桿（linker），使之形成黏性末端后，再用DNA連接酶連接，DNA接頭(adapter)連接法。平末端DNA片段的連接（1）直接用T4DNA連接酶連接；（2）先用末端核苷酸轉移酶，給平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA連接酶進行連接；（3）用連桿連接平末端DNA分子；（4）DNA接頭連接法。載體應具備的條件1.具有針對受體細胞的親緣性或親和性2.具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點3.具有多種單一的酶切位點4.具有合適的選擇性標記自我復制表達，外源基因的插入不影響其功能的發(fā)揮，易于從宿主細胞分離出來5.分子量盡可能小，以提高其載裝能力質粒DNA的復制類型嚴謹型質粒松弛型質粒天然質粒的缺陷（1）分子量大，拷貝數低（2）篩選標志不理想構建質?？寺≥d體的基本策略1能在受體中進行有效的復制（有復制起始位點）。2含多克隆位點3含有供選擇克隆子的標記基因，如：常用的標記基因：Apr，Kmr，Smr，Tcr基因等4DNA分子盡可能小和較高的拷貝數。5根據特殊需要，組裝各種“元件”，構建不同用途的質?？寺≥d體。質?？寺≥d體的構建1選擇合適的出發(fā)質粒2正確獲得構建質?？寺≥d體的元件3組裝合適的選擇標記基因4選用合適的啟動子5構建過程力求簡單DNA插入而導致基因失活的現象，稱之為插入失活效應。藍白斑篩選Ampicillin抗性和lacZ的肽互補（藍白斑）相結合。-半乳糖苷酶能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個深藍色的物質5-溴-4-氯靛藍Ti質粒介導轉化的過程①根癌農桿菌對植物細胞的識別和附著②根癌農桿菌對植物信號物質的感受③根癌農桿菌Ti質粒上的vir基因以及染色體上操縱子的活化④vir區(qū)基因被激活，virD基因編碼的核酸內切酶分別將T-DNA的RB序列和LB序列切出單鏈切口，釋放出T-DNA的單鏈線性拷貝，T-DNA復合體的產生⑤T-DNA復合體在RB序列的引導下定向地穿過農桿菌的細胞膜、細胞壁、進入植物細胞壁并整合到植物的染色體基因組中TA克隆的優(yōu)點不需使用含限制酶序列的引物，不需把PCR產物做平端處理，不需在PCR擴增產物上加接頭，即可直接進行克隆。

TA克隆注意事項1.要獲得目的基因的TA克隆，PCR產物的特異性要好。2.PCR產物在TA克隆前要通過純化。3.在PCR產物回收、純化過程中防止外來DNA污染。真核生物的啟動子：真核生物有三種類型的RNA聚合酶，每一種都有對應的啟動子。聚合酶I只轉錄rRNA，故只有一種啟動子。聚合酶II轉錄mRNA，其啟動子最為復雜；聚合酶III轉錄tRNA和5SrRNA，其啟動子大都是位于轉錄的DNA序列之內，稱為下游啟動子。目的基因的獲得:直接分離法;PCR擴增;構建基因組文庫法;構建cDNA文庫法;化學合成法直接分離法:限制酶酶切法(DNA分子已測序/目的基因已定位)基因組文庫的構建(DNA未測序或未定位)：采用限制酶切割構建基因組文庫篩選目的基因克隆基因文庫構建的一般步驟：（1）染色體DNA大片段的制備①酶切法②物理切割法（2）載體與基因組DNA大片段的連接①粘性末端直接連接②人工接頭法（3）轉導受體（4）篩選重組子cDNA：以mRNA為模板合成的互補脫氧核糖核苷酸序列。cDNA文庫：某種生物基因組轉錄的的全部mRNA經反轉錄產生的各種cDNA分別與克隆載體重組，貯存在一個受體菌的群體中，這個群體就稱為cDNA文庫。cDNA文庫與基因組文庫的區(qū)別在于cDNA文庫是有時效性的。cDNA文庫的特點優(yōu)點：分離的目的基因可直接用于表達；比DNA文庫小的多，容易構建缺點：只與編碼序列有關；不能反映內含子；不能反映啟動子、終止子以及與核糖體識別的序列構建cDNA文庫的一般步驟：（1）總RNA（totalRNA）提取（2）mRNA的分離純化①原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。②mRNA的分離純化Column（柱）（3）cDNA的合成①cDNA第一鏈合成②降解mRNA模板③cDNA第二鏈合成（cDNA第二鏈合成的方法有四種，自身引導合成法，置換合成法，引導合成法和引物－銜接頭合成法。）（4）cDNA與載體連接：（5）噬菌體顆粒的包裝及轉染或質粒的轉化（導入宿主中繁殖）基因的化學合成：寡核苷酸單鏈的化學合成；探針的化學合成；連接子和接頭的合成；基因的半合成；全長基因化學合成目的基因的分離：目的序列已知：一般采用PCR技術或分子雜交技術分離克隆目的基因目的序列未知：差異表達序列；無差異表達的目的序列，可采用文庫篩選法、功能蛋白分離法、序列克隆法基因克隆的方法：一、目的基因的功能克隆二、序列克隆法三、差別雜交法四、減法雜交技術五、mRNA差別顯示技術功能克?。焊鶕阎虻漠a物推斷出其相應核苷酸序列，再根據此序列合成寡核苷酸探針，從cDNA文庫或基因組文庫中調取目的基因表型克隆：如差異篩選法、差減雜交（SH）、mRNA差別顯示技術（DDRT-PCR）、代表性差異分析（RAD）、抑制型差減雜交（SSH）等無基因序列及表達功能信息，但具有基因遺傳圖，轉座子標簽等條件，常用圖位克隆和轉座子標簽法克隆目的基因的功能克隆：在純化相應的編碼蛋白后構建cDNA文庫或基因組文庫，然后從文庫中篩選目的基因1、根據特異蛋白分離目的基因分離、純化目的蛋白測定特異的氨基酸順序推測編碼該蛋白的核苷酸序列人工合成一段寡核苷酸探針從cDNA文庫或基因組文庫中篩選編碼基因分離、純化目的蛋白目的蛋白免疫動物，制備抗體從cDNA表達文庫中篩選目的基因根據特異蛋白分離目的基因局限性：特異蛋白已鑒定并分離純化某些基因產物，難以分離純化非所有基因有蛋白質產物遺傳密碼的簡并性2、功能互補法克隆基因：利用被克隆的外源片段與宿主細胞染色體DNA具有功能互補。篩選營養(yǎng)缺陷型互補基因序列克隆法：根據已知基因序列或同源基因序列分離目的基因；采用核酸探針雜交篩選或用PCR技術進行分離差別雜交法：組織特異性表達或特定發(fā)育階段表達的基因；受生長因子調節(jié)的基因；經特殊處理誘導表達的基因應用前提：基因在兩種不同的細胞群體中的差異性表達（一個細胞群體中正常表達，另一個細胞群體中目的基因不表達）?；具^程：制備兩種細胞群體的的mRNA提取物；以兩種總mRNA或cDNA為探針；以表達目的基因的細胞群體構建cDNA文庫局限性：靈敏度比較低，不適于低豐度mRNA目的基因分離需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量的噬菌斑差別雜交重復性較差不同濾膜間DNA保有量不均一雜交信號強度不一致重新點雜交減法雜交技術：又稱差減雜交、扣除雜交、減數雜交、消減雜交本質：盡量去除兩種樣品中普遍共同存在的基因序列，從而使目的基因序列得到有效的富集，從而提高基因篩選分離的敏感性mRNA減法雜交；基因組減法雜交感受態(tài)細胞的制備：1、挑取平板上的大腸桿菌單菌落接種于2mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃2、按1％的接種量接種于3mL新鮮LB培養(yǎng)液，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600為可見霧狀3、倒至的eppendorf管中,4℃下12,000rpm離心1min4、加入1mL預冷的無菌·L-1CaCl2溶液渦旋，4℃下12,000rpm離心30秒,5、沉淀以50-100μL預冷的·L-1CaCl2重懸，4℃保存?zhèn)溆茫?d大腸桿菌的轉化方法：2＋誘導大腸桿菌轉化法CaCl2的誘導原因：在0℃的CaCl2低滲溶液中，細菌細胞發(fā)生膨脹，Ca2Ca2＋能與加入的DNA分子結合，形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基－磷酸鈣復合物，黏附在胞膜的外表面；42℃對照試驗：轉化處理過程中，可能感染雜菌，導致假陽性2.電穿孔轉化法基本原理：利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細胞膜上進行電穿孔，形成可逆的瞬間通道，促進外源DNA的有效吸收。影響因素：電場強度，電脈沖時間，外源DNA濃度3.三親本雜交接合轉化大腸桿菌重組DNA分子導入植物細胞（1）農桿菌介導的Ti質粒載體轉化法作用機制：將待轉移的目的基因組入農桿菌中的Ti質粒載體；農桿菌識別敏感植物，將Ti質粒的T-DNA轉移到植物細胞內部基本程序：選擇合適的外植體；農桿菌的接種操作；洗菌并篩選培養(yǎng)常用方法：1.創(chuàng)傷植株感染法2.共培養(yǎng)感染法：葉盤轉化法；植物愈傷組織共培養(yǎng)轉化法；植物懸浮細胞共培養(yǎng)轉化法；原生質體共培養(yǎng)轉化法（2）DNA的直接轉移法：多聚物介導法；電穿孔轉化法；激光微束穿孔轉化法；顯微注射法；超聲波介導轉化法；基因槍法；脂質體介導法；花粉管通道法重組DNA分子導入哺乳動物細胞病毒介導的轉染：病毒顆粒轉導法生化轉染：磷酸鈣轉染法；DEAE－葡聚糖轉染法；聚陽離子－DMSO轉染法；脂質體介導法物理轉染：顯微注射法；電穿孔法常見的篩選重組子方法1遺傳表型直接篩選：抗藥性篩選；插入失活篩選法；插入表達篩選法；顯色互補篩選法2PCR法鑒定3酶切法鑒定4雜交法鑒定：Southernblot；Northernblot；Westernblot等5測序原核生物基因表達的特點①只有一種RNA聚合酶識別原核細胞的啟動子，催化所有RNA的合成。②基因的表達是以操縱子為單位的。③原核生物無核膜，所以轉錄與翻譯是偶聯的，也是連續(xù)進行的。④原核基因一般不含有內含子，在原核細胞中缺乏真核細胞的轉錄后加工系統。⑤原核生物基因的控制主要在轉錄水平，這種控制要比對基因產物的直接控制要慢。⑥mRNA的核糖體結合位點上，含有一個S-D序列，而真核基因則缺乏此序列。啟動子的特性：列特異性；向性；置特異性；屬特異性幾種類型的原核表達載體非融合蛋白：不與細菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表達蛋白優(yōu)點：它具有非常接近于真核細胞體內蛋白質的結構，因此表達產物的生物學功能也就更接近于生物體內天然蛋白質。缺點：易被細菌蛋白酶破壞。融合蛋白：由一條短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白質結合在一起。優(yōu)點：大大增加，不易被細菌蛋白酶降解；于分離純化影響基因表達效率的因素：啟動子的強度、DNA轉錄起始序列、密碼子的選擇、mRNA分子的二級結構、轉錄的終止、質粒的拷貝數以及質粒的穩(wěn)定性和寄主細胞的生理特征等提高基因表達效率的途徑：1.采用強啟動子；35和-10區(qū)之間保持的距離（16～19bp）2.確定合適的SD序列后面的幾個堿基成分及起始密碼子上游的堿基成分3.起始密碼子和S-D序列之間的距離必須接近到一定程度（7個核苷酸時最合適）4.在基因內部的適當位置上存在著轉錄的終止區(qū)，就能夠保證使質粒的拷貝數(也就是基因的表達效率)控制在一個正常的水平上。5.提高基因的拷貝數（將基因克隆到松弛型的質粒載體上）6.輕細胞的代謝負荷：（1）誘導表達：細菌的生長與外源基因的表達分開，是減輕宿主細胞代謝負荷的最為常用的一個方法(2)表達載體的誘導復制：將宿主菌的生長和質粒的復制分開7.高表達蛋白的穩(wěn)定性，防止其降解(1)克隆一段原核序列，表達融合蛋白(2)采用某種突變菌株，保護表達蛋白不被降解(3)表達分泌蛋白基因工程的應用：醫(yī)藥業(yè)：疾病的預防;病的診斷;病的治療農業(yè)及食品工業(yè):提高作物抗性;良作物品質;長果實貨架期;用農作物生產藥物畜牧業(yè);工食品環(huán)境:環(huán)境檢測;環(huán)境凈化第一章基因工程的概念第一節(jié)基因工程誕生的理論基礎

一.確定了遺傳信息的攜帶者是DNA而不是蛋白質。明確了遺傳的物質基礎問題

1.肺炎雙球菌轉化實驗

1944年Avery，確定了基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質。

2.噬菌體轉染實驗

1952年AlfredHershy和MarshaChase進一步證明遺傳物質是DNA

二.揭示了DNA分子的雙螺旋結構模型和半保留復制機理，解決了基因的自我復制和傳遞的問題。

1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結構和半保留復制機制。

三.提出了“中心法則”和操縱子學說，并成功地破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達問題

1958年Crick又提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”

1964年MarshallNirenberg和GobindKhorana等終于破譯了64個遺傳密碼

和在1961年提出了操縱子學說

第二節(jié)基因工程誕生的技術基礎

DNA分子的體外切割與連接

1.限制性內切酶（restrictionenzymes）

WernerArber理論預見限制酶

1968年.Smith等分離出第一種限制性核酸內切酶

DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片斷

3人于1978年獲得Nobel生理或醫(yī)學獎

2.DNA連接酶（ligase）1967年5個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現了DNA連接酶

二.DNA分子的核苷酸序列分析

1975年F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert發(fā)明了DNA快速測序技術,1980年Nobel化學獎

三.載體的構建

1972年前后使用小分子量的細菌質粒和噬菌體作載體。在細菌細胞里的大量擴增

四.轉化技術

1970年M.Mandel和A.Higa發(fā)現經過氯化鈣處理的大腸桿菌容易吸收噬菌體DNA。1972年S.Cohen發(fā)現這種處理過的細菌同樣能吸收質粒DNA

五.瓊脂糖凝膠電泳和southern轉移雜交技術

1960s發(fā)明了瓊脂糖凝膠電泳，可將不同長度的DNA分離開;DNA印跡技術由Southern于1975創(chuàng)建,稱為Southern印跡技術

二.基因工程的定義和特征

1.定義

在體外將核酸分子插入病毒、質?；蚱渌d體分子，構建遺傳物質的新組合，并使之滲入到原先沒有這類分子的寄生細胞內，而能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖在體外對不同生物的遺傳物質（基因）進行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細菌質粒、病毒或噬菌體DNA)，轉入微生物、植物或動物細胞內進行無性繁殖，并表達出基因產物酶學基礎1拷貝數就是指某目的基因（可以是質粒）在某一生物群體或個體中存在的個數.單拷貝就是該基因在基因組中只有一個,多則指有多個。(一)在細菌細胞中，某種特定質粒的數目。根據復制特性，質粒分嚴緊型和松弛型兩類，前者在細胞中只含1～2個，而后者含10～15個以上。恒定的拷貝數與質粒復制控制系統、宿主細胞遺傳背景及生長條件有關。質粒復制控制系統首先通過調節(jié)復制的起始點來控制拷貝數，調節(jié)因素包括阻遏蛋白、反義RNA和某些順向重復序列。有些質粒還有其他控制系統，如有分配功能的par系統和確保質粒穩(wěn)定遺傳的ccd系統。一旦質粒上與調控有關的基因或位點突變，可使拷貝數明顯增加或減少。(二)。工具酶：進行DNA操作經常要用到的“工具”——酶

四大工具酶：核酸酶nucleases連接酶ligase聚合酶polymerase修飾酶modificationenzyme

第一節(jié)限制性內切酶【命名、識別位點、切割過程、末端特征（粘端、平端）、酶活單位及定義】限制性內切酶：指能識別特定的DNA序列，在一定的條件下，可在識別位置上或附近對DNA進行切割的酶。二.限制性內切酶的命名與種類

按照國際命名法，限制性內切核酸酶屬于水解酶類。由于限制性酶的數量眾多，而且越來越多，并且在同一種菌中發(fā)現幾種酶。為了避免混淆，1973年Smith和Nathans對內切酶的命名提出建議，1980年，Roberts對限制性酶的命名進行分類和系統化。

限制性酶采用三字母的命名原則，即屬名+種名+株名的個一個首字母，再加上序號，

A、第一個字母大寫，表示該酶來源的細菌屬名的第一個字母

B、第二、三個字母小寫，表示該酶來源的細菌的種名的前2個字母

C、第四個字母大寫代表不同的變種/品系

小寫代表不同的菌株和型

D、最后羅馬字母，代表同一菌株中不同的限制性內切酶

注意限制性內切酶的正確寫法：

1、前3個字母一定斜體2、字母與羅馬數字間空格如：EcoRIPstI

I類限制性內切核酸酶

Ⅰ類酶不僅是一種核酸內切酶,同時在酶分子上還具有甲基化酶和ATPase的活性，所以是具有多種酶活性的復合酶類。作用時除了需要Mg2+作輔助因子外,還要求ATP和S腺苷甲硫氨酸(SAM)的存在。Ⅰ類酶具有特異的識別序列，大約15個堿基對。

Ⅰ類酶雖然能夠在一定序列上識別DNA分子,并能同DNA分子作用,因其識別DNA后,要朝一個方向或兩個方向移動一段距離(通常為1000個堿基左右)，并且要形成一個環(huán)才能切割DNA(圖),所以識別位點和切割位點不一致，產生的片段較大。

III類限制性內切核酸酶

III類限制性內切核酸酶也是基因工程中不常用的酶，分子量和亞基組成類似于Ⅰ類酶,作用方式基本同Ⅱ類酶。如EcoP1是由兩個亞基組成，一個亞基(M亞基)負責位點識別和修飾。另一個亞基(R亞基)具有核酸酶的活性(圖3-5)。切割DNA時需要ATP,Mg2+,也能被SAM激活，但并非必需。Ⅱ類限制性內切核酸酶

這類酶的分子量較小.一般在2-4萬道爾頓,通常由2-4個相同的亞基所組成。它們的作用底物為雙鏈DNA,極少數Ⅱ類酶也可作用于單鏈DNA,或DNA/RNA雜種雙鏈。這類酶的專一性強,它不僅對酶切點鄰近的兩個堿基有嚴格要求,而且對更遠的堿基也有要求,因此,Ⅱ類酶既具有切割位點的專一性,也具有識別位點的專一性,一般在識別序列內切割。切割的方式有平切和交錯切,產生平末端的DNA片段或具有突出粘性末端的DNA片段(5'或3'粘性末端)。作用時需要Mg2+作輔助因子,但不需要ATP和SAM。Ⅱ類酶與對應的甲基化酶在蛋白亞基上尚未發(fā)現有什么關系,第一個被分離的Ⅱ類酶是HindⅡ。

a.識別位點：絕大多數的II型核酸內切限制酶，都能夠識別由4～8個核苷酸組成的特定的核苷酸序列。我們稱這樣的序列為核酸內切限制酶的識別序列。而II型限制酶就是從其識別序列內切割DNA分子的，因此識別序列又稱為核酸內切限制酶的切割位點或靶序列。

有些識別序列是連續(xù)的(如GATC)，

有些識別序列則是間斷的(如GANTC)，N是代表任意一種核苷酸堿基

切割位點的一個共同特點是，它們具有雙重旋轉對稱的結構形式，換言之，這些核苷酸對的順序是呈回文結構。

這段序列有兩個基本的特征，第一是能夠在中間劃一個對稱軸，兩側的序列兩兩對稱互補配對，第二個特點是兩條互補鏈的5’到3’的序列組成相同，即將一條鏈旋轉1800，則兩條鏈重疊。

b.

切割類型

檢驗了非常大量的實驗事例之后發(fā)現，由核酸內切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割類型，通常是屬于下述兩種獨特的排列方式之一：

（1）兩條鏈上的斷裂位置是交錯地、但又是對稱地圍繞著一個對稱軸排列，這種形式的斷裂結果形成具有粘性末端的DNA片段；

（2）兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結構的中心，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片段。

c.產生的末端特征：Ⅱ類限制性內切酶的切割產物有平末端和粘性末端(cohesiveend)。

粘性末端是指DNA分子的兩端具有彼此互補的一段突出的單鏈部分,這一小段單鏈部分和同一分子的另一端或其它分子末端的單鏈部分如果互補的話，則能通過互補堿基之間的配對,形成雙鏈。并在DNA連接酶的作用下,使同一DNA分子的兩端連接成環(huán)狀,或使兩個分子連成一大的線狀分子。

已知有兩種不同類型的限制酶都可以產生粘性末端，但一種是形成具有3’粘性末端，例如PstI酶就是屬于這種類型；另一種則是形成具有5’粘性末端，例如EcoRI酶便是此種類型的一個代表。粘性末端能夠通過互補堿基間的配對而重新環(huán)化起來，平末端的DNA片段則不易于重新環(huán)化。酶活性單位：1單位限制性內切酶（1U）通常定義：在建議使用的Buffer及溫度下，在20l（50l）反應體系中反應1小時，使1g入星活性（starctivity）在非最適的反應條件下，酶的識別特異性降低，產生非特異性帶，這種酶切特異性降低的現象，稱為星活性。所謂非最適的反應條件：過量酶、低鹽濃度、過量甘油、高pH（以上）、有機溶劑ex：酒精（EcoRI對酒精敏感）、SDS、苯酚、氯仿等。五.影響限制性核酸內切酶活性的因素

1、DNA樣品的純度：

蛋白質、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等將影響DNA樣品的純度。

如果DNA樣品難以純化時，可以采取下列方法進行酶切：

加大酶的用量，1mgDNA用10U酶(但是不能超總體積1/10

加大反應總體積

延長反應時間

2、DNA樣品的甲基化程度：

核酸內切限制酶是原核生物限制—修飾體系的組成部分，因此識別序列中特定核苷酸的甲基化作用，便會強烈地影響酶的活性。

為避免產生這樣的問題，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大腸桿菌菌株制備質粒DNA。

可以利用不同的限制性內切酶對甲基化敏感程度不同，研究不同條件下DNA的甲基化程度。

3、緩沖液性質：

標準緩沖液的組份包括：氯化鎂、氯化納或氯化鉀、Tris-HCl,?-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常發(fā)揮，是絕對地需要二價的陽離子，通常是Mg2+。不正確的NaCl或Mg2+濃度，不僅會降低限制酶的活性，而且還可能導致識別序列特異性的改變。

緩沖液Tris—HCl的作用在于使反應混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳數值的范圍之內。對絕大多數限制酶來說，在pH=7．4的條件下，其功能最佳。

巰基試劑對于保持某些核酸內切限制酶的穩(wěn)定性是有用的，而且還可保護其免于失活。但它同樣也可能有利于潛在污染雜質的穩(wěn)定性。

有一部分核酸內切限制酶對于鈉離子或鉀離子濃度變化反應十分敏感，而另一部分核酸內切限制酶則可適應較廣的離子強度的變化幅度。

4、酶切反應的溫度

DNA酶切反應的溫度，是影響核酸內切限制酶活性的另一個重要因素。不同的核酸內切限制酶，具有不同的最適反應溫度，而且彼此之間有相當大的變動范圍。大多數核酸內切限制酶的標準反應溫度都是37℃。

但也有許多例外的情況，它們要求37℃以外的其它反應溫度。其中有些核酸內切限制酶的最適反應溫度低于標準的37℃，例如SmaI是25℃、ApaI是30℃。

有些核酸內切限制酶的最適反應溫度則高于標準的37℃，例如MaeI是45℃、BclI是50℃、MaelII是55℃；還有些核酸內切限制酶的最適反應溫度可高達60℃以上。

消化反應的溫度低于或高于最適溫度，都會影響核酸內切限制酶的活性，甚至最終導致完全失活。

酶切的方式：1、完全酶切：內切酶在DNA上的所有識別位點都被切開。

2、不完全酶切：只有有限數量的酶切位點被切開，可以通過縮短保溫時間、降低反應溫度或減少酶的用量可達到局部消化的目的。

第二節(jié)連接酶（ligase)連接酶的作用機理與反應條件：1、作用機理：

（1）ATP（NAD+)提供激活的AMP

（2）ATP與連接酶形成共價“連接酶-AMP”復合物，并釋放出焦磷酸PPi。

（3）AMP與連接酶的賴氨酸e-氨基相連。

（4）AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉移到DNA一條鏈的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”復合物。

（5）3’2、反應條件

（1）必須是兩條雙鏈DNA，如果為粘性末端，末端必須配對。

（2）DNA的3’端有游離的-OH’，5’端有一個磷酸基團（P）。

（3）需要能量：

動物或噬菌體中：ATP

大腸桿菌中：NAD+

連接酶的種類：T4-DNA連接酶、DNA連接酶、T4-RNA連接酶、

連接酶的一般采用Weiss單位來衡量T4DNA連接酶的活性。在37℃下20分鐘催化1nmol32p從焦磷酸根置換到[γ，β,32P]ATP所需的酶量，定義為1個Weiss單位。該定義方法基于ATP和焦磷酸的交換，是最常用的連接酶單位，

但該定義所展示的直觀生物學意義不顯著。NewEnglandBiolabs公司也提出了一種定義方式，通過粘性末端的連接效率來表示。即，在20μl反應體系中于16℃，使HindⅢ切過的DNA（300μg/ml，μM5'末端）在30分鐘內連接50%所需的酶量為1個NEB單位。1NEB單位等于Weiss單位，1Weiss單位等于67NEB單位。

影響連接酶效果的因素

1、酶切片段的狀態(tài)：

粘性末端連接效率比平端至少大100倍

5’突出粘性末端大于3’突出粘性末端不同的限制性內切酶片段連接效率不同，以HindIII最好。2、插入片段與載體的濃度比例：

ＤＮＡ一端與另一端的連接可認為是雙分子反應，在標準條件下，其反應速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的濃度決定。不論末端位于同一ＤＮＡ分子（分子內連接）還是位于不同分子（分子間連接），都是如此?，F考慮一種簡單的情況，即連接混合物中只含有一種ＤＮＡ，也就是用可產生粘端的單個限制酶切割制備的磷酸化載體ＤＮＡ。

如果反應中ＤＮＡ濃度低，則配對的兩個末端為同一ＤＮＡ分子的機會較大（因為ＤＮＡ分子的一個末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。

因此，在ＤＮＡ濃度低時，質粒ＤＮＡ重新環(huán)化將卓有成效。如果連接反應中ＤＮＡ濃度有所增高，則在分子內連接反應發(fā)生以前，某一個ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。因此在ＤＮＡ濃度高時，連接反應的初產物將是質粒二聚體和更大一些的寡聚體。

進行克隆時，Vector

DNA和Insert

DNA的摩爾數比一般為1：2～10，增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現象。

3、反應溫度：

37℃連接酶活性最高，但37℃時粘性末端DNA分子形成的配對極不穩(wěn)定，故最佳12-16℃，最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又要有助于短暫配對結構的穩(wěn)由于ＤＮＡ很容易成為平端，所以這是一個極為有用的酶學物性。有了這樣的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相連。然而，相對而言，平端連接是低效反應，它要求以下４個條件：

１）低濃度（L）的ATP２）不存在亞精胺一類的多胺

３）極高濃度的連接酶（50Weiss單位．ml）４）高濃度的平端。

凝聚劑：

反應混合物中加入一些可促進大分子群聚作用并可導致ＤＮＡ分子凝聚成集體的物質，如聚乙二醇或氯化六氨全高鈷,可以使如何取得適當濃度的平端ＤＮＡ的總是迎刃而解。在連接反應中，這些物質具有兩作用：

１）它們可使平端ＤＮＡ的連接速率加大１－３個數量級，因此可使連接反應在酶ＤＮＡ濃度不高的條件下進行。

２）它們可以改變連接產物的分布，分子內連接受到抑制，所形成的連接產物一律是分子間連接的產物。

第三節(jié)DNA聚合酶（原理、用途）聚合酶的種類：1、依賴DNA的DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶、Klenowfragment、T7DNA聚合酶、T4DNA聚合酶和修飾過的T7DNA聚合酶

2、不依賴DNA的DNA聚合酶：末端轉移酶

3、依賴RNA的DNA聚合酶：反轉錄酶

4、依賴DNA的RNA聚合酶：RNA聚合酶，phageSP6、T7和T3RNA聚合酶5、不依賴DNA的RNA聚合酶：polyA聚合酶

DNA聚合酶

1、DNA聚合酶I：聚合酶活性：5’》3’，需要引物

外切酶：5’》3’

3’》5’校正功能

應用：缺平移探針標記

2、Klenowfragment：

聚合酶活性：5’》3’，需要引物

外切酶：3’》5’

用途：C：隨機引物（6nt）標記D：末端終止法進行DNA序列分析

3、T4-DNA聚合酶：

聚合酶活性：5’3’，

外切酶：3’5’

外切酶活性較klenow片段的活性大200倍，對單鏈DNA的活性大于雙鏈DNA。

特點：當沒有dNTP時，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隱蔽端。如果只有一種dNTP，則降解到該dNTP的位置。

用途：

A、填補或標記限制酶切割DNA后產生的凹缺3’

B、末端標記帶3’突出末端的DNA：

利用3’5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隱蔽端、5’隱蔽端）制造出3’隱蔽端，再利用它的5’3’聚合酶活性補平，并加入放射性標記的dNTP

C、標記用作雜交探針的DNA片段

D、將雙鏈DNA的末端轉化成平

E：體外誘變

4、T7-DNA聚合酶:

從T7噬菌體感染大腸桿菌細胞中純化出來的，由兩個亞基組成：

（1）T7基因5編碼的大亞基：有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性。

（2）大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白，增加大亞基對模板的親和性

T7-DNA聚合酶的用途：

A、用填補或交換（取代）反應快速進行末端標記；

B、將雙鏈DNA的末端轉化成平末端；

C、復制較長的模板進行引物延伸反應，在測序中讀出較長的序列。

5、修飾的T7DNA聚合酶

通過修飾使3’5’外切酶活性下降99%以上，但聚合能力不受影響，修飾后的T7DNA聚合酶在聚合反應中有很高的持續(xù)性；進一步改進的基因工程生產的測序酶，完全沒有核酸外切酶花性。

用途：

（1）DNA序列6、末端轉移酶：罕見的DNA聚合酶：從小牛胸腺中純化出的堿性蛋白質，催化單鏈或雙鏈DNA分子的3’-OH末端添加一個至多個脫氧核苷酸的反應。

用途：

（1）在載體或cDNA上加換互補的同源多聚尾，以便連接。

（2）標記DNA片段的3’末端。

（3）快速擴增cDNA末端（Rapid

Amplification

of

cDNA7、反轉錄酶（依賴RNA的DNA聚合酶）（Reversetranscriplase,RT）

用途：合成cDNA。以oligodT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補結合）。四、RNA聚合酶：1、依賴DNA的RNA聚合酶

包括：RNA聚合酶，phageSP6、T7和T3RNA聚合酶

以DNA為模板，從啟動子開始，經過延伸、終止，合成轉錄產物。

用途：

A：合成單鏈RNA探針B：體外翻譯，基因表達分析

2、不依賴DNA的RNA聚合酶：

多聚（A）聚合酶，ATP存在下，催化在單鏈RNA3’末端加上AMP，任何RNA可作底物。

用途：

A：在RNA末端加上多聚（A）尾，以合成cDNA；

B：標記RNA的3’端。

第四節(jié)修飾酶

修飾酶：主要為三類：末端轉移酶（在DNA聚合酶中已述），堿性磷酸酶，多核苷酸激酶

多核苷酸激酶的用途：DNA5’堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP）

種類：細菌性堿性磷酸酶、小牛腸堿性磷酸酶用途：

A：載體5’末端脫磷，防止載體自我環(huán)化。

B：在RNA/DNA末端除去5’磷酸，便于標記5’末端。

四基因工程技術凝膠電泳技術電泳（electroghoresis）：帶電物質在電場中向相反電極移動的現象。電泳技術：就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術。電荷效應：分子篩效應：一個含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經凝膠色譜柱時，各分子在柱內同時進行著兩種不同的運動：垂直向下的移動和無定向的擴散運動。大分子物質由于直徑較大，不易進入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時向下移動的速度較快。小分子物質除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，即進入凝膠相內，在向下移動的過程中，從一個凝膠內擴散到顆粒間隙后再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入和擴散，小分子物質的下移速度落后于大分子物質，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，這種現象叫分子篩效應。電泳遷移率：是指在單位電場強度（1V/cm）時帶電分子的遷移速度。遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。影響凝膠電泳遷移率的因素樣品的物理性質1、分子大?。壕€狀雙鏈DNA分子長度（堿基對數目bp）的對數（log10）與遷移距離成反比，以此來測定DNA片段（線性雙鏈）的分子量準確且方便。當DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。2、分子的空間構型：即使分子量相同，構型不同，其遷移率也不同。共價閉合環(huán)狀DNA（covalentlyclosecircularDNA，cccDNA，超螺旋構型）＞lDNA（linearform，線型，質粒的兩條鏈均斷裂；線性分子）＞ocDNA（開環(huán)DNA，opencircularDNA，ocDNA，它的雙鏈中的一條保持完整的環(huán)狀結構，另一條單鏈上有一到幾個切口）。但是由于瓊脂糖濃度、電場強度、離子強度和溴化乙錠等的影響，會出現相反的情況。3、帶電量：核酸分子是兩性解離分子，是堿基上的氨基解離，而三個磷酸基團中只有一個磷酸解離，所以分子帶正電，在電場中向負極泳動；而時，堿基幾乎不解離，而磷酸基團解離，所以核酸分子帶負電，在電場中向正極泳動。不同的核酸分子的電荷密度大致相同，因此對泳動速度影響不大。4、堿基組成：對遷移率影響不明顯，單鏈DNA形成發(fā)頭結構，影響遷移率，單鏈（1kb）小于雙鏈DNA（1kb）不同濃度瓊脂糖凝膠的有效分離范圍 DNA在聚丙烯酰胺凝膠中的有效分離范圍DNA電泳帶糊的原因：1、DNA降解，應避免核酸酶污染；2、電泳緩沖液陳舊電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經常更換電泳緩沖液；3、所用電泳條件不合適電泳時電壓不應超過20V/cm，溫度＜30℃；巨大DNA鏈電泳，溫度應＜15℃4、DNA上樣量過多減少凝膠中DNA上樣量；5、DNA樣含鹽過高電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽；6、有蛋白污染電泳前酚抽提去除蛋白；7、DNA變性電泳前勿加熱，用20mMNaCl緩沖液稀釋DNA。染色劑及其原理染色劑：核酸電泳后，需經染色后才能顯現出帶型，最常用的是溴化乙錠染色法，其次是銀染色，目前還有其他不僅安全的染色劑。溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）最常用260nm，300nm，360nm，發(fā)出590nm橙紅色。原理溴化乙錠：含有一個可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個三環(huán)平面基團。它與DNA的結合幾乎沒有堿基序列特異性。在高離子強度的飽和溶液中，大約每個堿基插入一個溴化乙錠分子。當染料分子插入后，其平面基團與螺旋的軸線垂直并通過范德華力與上下堿基相互作用。這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近，導致與DNA結合的染料呈現熒光，其熒光產率比游離溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結合的染料本身吸收302nm和366nm的光輻射。這兩種情況下，被吸收的能量在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。由于溴化乙錠-DNA復合物的熒光產率比沒有結合DNA的染料高出20-30倍，所以當凝膠中含有游離的溴化乙錠（ml）時，可以檢測到少至10ng的NDA條帶。原理銀染：銀染色液中的銀離子(Ag)可與核酸形成穩(wěn)定的復合物，然后用還原劑如甲醛使Ag還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色。主