新冠核酸單檢檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

新冠核酸單檢樣本檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程檢驗(yàn)?zāi)康捏w外定性檢新冠(2019-nCoV)ORF1ab和N基因，用于新冠感染的體檢篩查。檢測(cè)原理與方法對(duì)新冠(2019-nCoV)ORF1ab及編碼核衣殼蛋白N基因的特異性保守序列為靶區(qū)域，進(jìn)行了雙靶標(biāo)基因的設(shè)計(jì)，配以PCR反應(yīng)液，在熒光定量PCR儀上，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)技術(shù),通過(guò)熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)樣本RNA的檢測(cè)。PCR檢測(cè)體系包含有內(nèi)源性的內(nèi)標(biāo)引物和探針，通過(guò)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)是否正常來(lái)監(jiān)測(cè)樣本采集、提取過(guò)程，避免假陰性結(jié)果。職責(zé)保證分子生物組實(shí)驗(yàn)室對(duì)于新冠(2019-nCoV)篩查檢測(cè)結(jié)果的可靠性。性能特征4.1準(zhǔn)確性檢測(cè)企業(yè)陽(yáng)性參考品，結(jié)果均為陽(yáng)性。42特異性本試劑盒與冠狀病毒(NL63,HKU1,229E,OC43)、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒Yamagata型、Victoria型、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、呼吸道合胞病毒A、B型、鼻病毒A、B、C型、腺病毒1、2、3、4、5、7、55型、副流感病毒1、2、3型、腸病毒A、B型、腸病毒C型(EV-C95)、腸病毒D型(EV-D70)、偏肺病毒、人間質(zhì)肺病毒、新生隱球菌、化膿性性鏈球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺孢子蟲(chóng)、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、嗜肺軍團(tuán)菌、百日咳桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎支原體、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎衣原體、EB病毒、人巨細(xì)胞病毒、煙曲霉、白色念球菌、光滑念珠菌、結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌、諾如病毒、輪狀病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人類(lèi)基因組DNA等陽(yáng)性樣本無(wú)交叉反應(yīng)。檢測(cè)企業(yè)陰性參考品均為陰性。43精密度批內(nèi)精密度Ct值的變異系數(shù)(CV,%)W5%。44最低檢測(cè)限本試劑盒最低檢測(cè)限為200copies/mL。標(biāo)本類(lèi)型及要求5.1樣本類(lèi)型：咽拭子、肺泡灌洗液。5.2樣本采集：5.2.1咽拭子：用1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時(shí)擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含1.5ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。5.2.2肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過(guò)或鼻經(jīng)過(guò)咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支管，將其頂端契入支氣管分支開(kāi)，經(jīng)氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水，每次30?50ml，總量100?250ml，不應(yīng)超過(guò)300ml。5.3樣本滅活：將樣本保存管置于金屬浴56°C以上保持30分鐘。5.4樣本保存和運(yùn)送:待測(cè)樣本可立即用于處理，能在24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)的標(biāo)本可置于4C保存；24小時(shí)內(nèi)無(wú)法檢測(cè)的標(biāo)本則應(yīng)置于-70C或以下保存（如無(wú)-70C保存條件,待測(cè)樣本可于-20C保存10天，核酸樣本-20±5C保存15天）。應(yīng)避免反復(fù)凍融。樣本運(yùn)送采用冰壺加冰或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。標(biāo)本包裝和運(yùn)輸6.1標(biāo)本采集后在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)分裝。6.2所有標(biāo)本應(yīng)放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈、耐冷凍的樣本采集管里，擰緊。容器外注明樣本編號(hào)、種類(lèi)、姓名及采樣日期。6.3將密閉后的標(biāo)本放入大小合適的塑料袋內(nèi)密封，每袋裝一份標(biāo)本。樣本包裝要求要符合《危險(xiǎn)品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。6.4涉及外部標(biāo)本運(yùn)輸?shù)?，?yīng)根據(jù)標(biāo)本類(lèi)型，按照A類(lèi)感染性物質(zhì)進(jìn)行三層包裝。試劑和儀器7.1試劑：新冠2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）7.1.1試劑來(lái)源：湖南圣湘生物科技有限公司7.1.2試劑組份：序號(hào)試劑名稱(chēng)規(guī)格與裝量主要成分12019-nCoV-PCR-反應(yīng)液624uL/管引物(4.62%)、探針(1.15%)、dNTPs(3.85%)、MgCl2(0.77%)、Rnasin(0.48%)、PCRbuffer(89.13%)22019-nCoV-PCR-酶混合液96uL/管RT酶(62.5%)、Taq酶(37.5%)32019-nCoV-PCR-陽(yáng)性對(duì)照500UL/管含目標(biāo)基因（ORF1ab、N基因）、內(nèi)標(biāo)基因片段（RnaseP）的體外轉(zhuǎn)錄RNA42019-nCoV-PCR-陰性對(duì)照500UL/管生理鹽水7.1.3開(kāi)啟所有試劑需注明日期及簽名。每個(gè)試劑盒都應(yīng)貼有下列標(biāo)簽：物質(zhì)名稱(chēng)、批號(hào)、特殊儲(chǔ)藏說(shuō)明、開(kāi)蓋人、開(kāi)蓋日期、開(kāi)蓋后有效期。開(kāi)啟時(shí)應(yīng)檢查試劑是否變色，是否有肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌生長(zhǎng)跡象、濁度、沉淀反應(yīng)等，這些表示已經(jīng)變質(zhì)或超過(guò)保質(zhì)期。7.1.4試劑應(yīng)避光密閉，試劑組分保存于-20±5°C。7.1.5生產(chǎn)日期，失效日期請(qǐng)見(jiàn)外包裝盒。不使用時(shí)，這些試劑在包裝標(biāo)識(shí)的效期內(nèi)可穩(wěn)定存放。一旦使用，擴(kuò)增試劑盒反復(fù)凍融應(yīng)不超過(guò)3次。7.2儀器：適用于SLAN96熒光PCR儀。環(huán)境和安全控制8.1檢測(cè)環(huán)境：PCR實(shí)驗(yàn)室條件達(dá)到生物安全二級(jí)及以上。8.2安全控制：8.2.1檢驗(yàn)人員個(gè)人防護(hù)應(yīng)達(dá)到生物安全三級(jí)，至少穿戴工作服、一次性工作帽、雙層手套、醫(yī)用一次性防護(hù)服、醫(yī)用防護(hù)罩（N95及以上）或動(dòng)力送風(fēng)過(guò)濾式呼吸器、防護(hù)面屏或護(hù)目鏡、工作鞋或膠靴、防水靴套。必要時(shí)，可加穿防水圍裙或防水隔離衣。根據(jù)目前實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地設(shè)置要求，個(gè)人防護(hù)設(shè)備在試劑配置區(qū)緩沖間進(jìn)行穿戴齊全后再進(jìn)入核心工作區(qū)。8.2.2避免過(guò)度勞累，并及時(shí)對(duì)其健康情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，注意監(jiān)測(cè)自身及身邊檢驗(yàn)人員體溫和呼吸系統(tǒng)癥狀。8.2.3防護(hù)裝備脫卸的注意事項(xiàng)：脫卸時(shí)盡量少接觸污染面。脫下的防護(hù)眼罩、長(zhǎng)筒膠鞋等非一次性使用的物品應(yīng)直接放入盛有消毒液的容器內(nèi)浸泡；其余一次性使用的物品應(yīng)放入黃色醫(yī)療廢物收集袋中作為醫(yī)療廢物集中處置。脫卸防護(hù)裝備的每一步均應(yīng)進(jìn)行手消毒，所有防護(hù)裝備全部脫完后再次洗手、手消毒。8.2.4如果操作人員的皮膚或衣物上沾到了血液及廢液，應(yīng)立刻用清水沖洗并進(jìn)行消毒處理。如果眼睛被濺入血液及廢液，用大量的清水沖洗并采取必要的醫(yī)療措施。8.2.5工作臺(tái)在每天工作結(jié)束后用10%的次氯酸鈉溶液清洗，空間用紫外線照射60分鐘。8.2.6此試劑為體外用，試劑含有防腐劑和穩(wěn)定劑，存在一定的危險(xiǎn)性；不要入，避免和眼睛，皮膚或衣服接觸。8.2.7醫(yī)療廢物處理：本檢測(cè)所產(chǎn)生的全部廢棄物均應(yīng)按《安全手冊(cè)》中有關(guān)規(guī)定執(zhí)行并遵循《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》和《醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)醫(yī)療廢物管理辦法》的要求，規(guī)范使用雙層黃色醫(yī)療廢物收集袋封裝后按照常規(guī)處置流程進(jìn)行處置。操作步驟9.1試劑準(zhǔn)備（在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）；9.1.1取出盒中的各組分，室溫放置，待其溫度平衡至室溫后,混勻后備用；9.1.2根據(jù)待測(cè)樣本數(shù)量，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照數(shù)量，按比例（2019-nCoV-PCR反應(yīng)液26應(yīng)/人份+2019-nCoV-PCR-酶混合液4gL/人份）取相應(yīng)量的組分，充分混勻成PCR混合液，瞬時(shí)離心后備用；9.1.3將上述準(zhǔn)備好的試劑轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)，待用。9.2樣本處理（在樣本處理區(qū)進(jìn)行）9.2.1新冠2019-Ncov一步法提取核酸檢測(cè)（單檢）9.2.1.1樣本接收后打開(kāi)外層包裝箱，取出內(nèi)物品，統(tǒng)一放恒溫箱內(nèi)56^放置30min以上（目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用溫度：60-65^左右，放置30min）。滅活后取出，打開(kāi)中層包裝。樣本在生物安全柜里進(jìn)行再次震蕩混勻，樣本瞬時(shí)離心。每個(gè)PCR管中加入樣本釋放劑（型號(hào)S1014）10gL（建議深吸淺打，避免出現(xiàn)氣泡）；各管分別加入待測(cè)標(biāo)本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照及弱陽(yáng)性對(duì)照各10gL，吸打3-5次混勻輕輕吸打，避免出現(xiàn)氣泡），室溫靜置10分鐘以上；9.2.1.3室溫靜置10分鐘；9.2.1.4將30gL配制好的PCR-混合液加入到裝有20uL上述處理后的樣本PCR擴(kuò)增管中,蓋好八連管蓋。9.2.2新冠2019-Ncov磁珠法提取核酸檢測(cè)（高風(fēng)險(xiǎn)人群）使用S10015核酸提取或純化試劑盒提取核酸1按照S10015-洗滌液2標(biāo)簽指示，使用前加入相應(yīng)量的無(wú)水乙醇。9.2.2.2根據(jù)樣本數(shù)量，將蛋白酶K（20應(yīng)/人份）和S10015-磁珠溶液（30應(yīng)/人份）按照比例混合成蛋白酶K-磁珠混合液，震蕩混勻，低速瞬時(shí)離心。9.2.2.3根據(jù)待測(cè)樣本數(shù)量取1.5m］離心管若干，每管加入300gL樣品，每一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)一份弱陽(yáng)性對(duì)照、一份空白對(duì)照、三個(gè)陰性對(duì)照；4加入500|iLS10015-提取溶液1和50gL蛋白酶K-磁珠混合液；蓋上管蓋，震蕩混勻30s,60°C加熱10min.9.2.2.5室溫靜置1min，低速瞬時(shí)離心，將離心管置于磁性分離器上，5min后吸棄廢液（注意不要碰到吸附于管壁內(nèi)側(cè)的磁珠）；9.2.2.6加入700|iLS10015-洗滌液1，震蕩混勻30s，低速瞬時(shí)離心后將離心管再次置于磁性分離器。磁吸3min，將液體完全吸出丟棄（注意不要碰到吸附于管壁內(nèi)側(cè)的磁珠）；7加入700|iLS10015-洗滌液2,震蕩混勻30s，低速瞬時(shí)離心后將離心管再次置于磁性分離器。磁吸3min，將液體完全吸出丟棄，繼續(xù)于磁性分離器上靜置2min，將液體完全吸盡。注意不要碰到吸附于管壁內(nèi)側(cè)的磁珠；若此時(shí)洗滌液并非無(wú)色透明，需重復(fù)該步驟）；8室溫開(kāi)蓋靜置5min（乙醇?xì)埩魰?huì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成不良影響，需保證乙醇充分揮發(fā)；同時(shí)不要干燥太長(zhǎng)時(shí)間，以免磁珠掛壁難以洗脫）。9.2.2.9加入60gLS10015-洗脫液S，震蕩混勻30s,將離心管壁上磁珠洗脫到管底，室溫靜置5min；低速瞬時(shí)離心將離心管再次置于磁性分離器上磁吸3min，然后將洗脫下來(lái)的核酸轉(zhuǎn)移到干凈的1.5m1離心管中。10根據(jù)樣本數(shù)量，取相應(yīng)量的八連管，各管分別加入提取好的待測(cè)標(biāo)本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照及弱陽(yáng)性對(duì)照各20應(yīng)，將30gL配制好的PCR-混合液加入到裝有20gL核酸的PCR擴(kuò)增管中，蓋好八連管蓋。9.2.3將上述準(zhǔn)備好的八連排轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)處理區(qū)，準(zhǔn)備上機(jī)擴(kuò)增。9.3PCR擴(kuò)增9.3.1確定UPS工作狀況正常后啟動(dòng)控制電腦，開(kāi)SLAN96P電源開(kāi)關(guān)，打開(kāi)電腦并雙擊桌面“SLAN8.2.2”圖標(biāo)，打開(kāi)軟件。項(xiàng)目創(chuàng)建：首次操作需要進(jìn)行項(xiàng)目創(chuàng)建，在軟件最上方的項(xiàng)目欄點(diǎn)擊項(xiàng)目創(chuàng)建，以后使用時(shí)就只需要調(diào)用相應(yīng)項(xiàng)目程序就可以了。選擇熒光檢測(cè)通道選擇：1）選擇FAM（ORF-1ab區(qū)域）和ROX（N基因）通道檢測(cè)2019-nCoV病毒核酸；2）選擇HEX通道檢測(cè)內(nèi)標(biāo)，設(shè)定循環(huán)參數(shù)完成創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。循環(huán)參數(shù)：步驟溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)1逆轉(zhuǎn)錄50°C30分鐘12cDNA預(yù)變性95°C1分鐘13變性95°C15秒45退火，延伸及熒光米集60°C30秒4儀器冷卻25°C10秒1完成項(xiàng)目創(chuàng)建后，點(diǎn)擊“HOME”進(jìn)行基本設(shè)置，彈出的對(duì)話框中編輯所創(chuàng)建的項(xiàng)目名稱(chēng)+樣本號(hào)+日期，實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)以及保存到相應(yīng)的文件夾下，點(diǎn)擊“孔板編輯”選擇實(shí)驗(yàn)需要運(yùn)行模塊，選擇項(xiàng)目程序，選擇“實(shí)驗(yàn)分析”模塊下點(diǎn)擊開(kāi)始運(yùn)行擴(kuò)增程序。樣本信息編輯將：將陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及待測(cè)樣本的點(diǎn)樣順序設(shè)置并設(shè)置樣本名稱(chēng)和實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果，對(duì)檢測(cè)靶標(biāo)以及內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增曲線分別進(jìn)行分析。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整，Start值可以在3?15、End值可設(shè)在5~20，調(diào)整陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線使其平直或低于閾值線)，點(diǎn)擊Analyze進(jìn)行分析,使各項(xiàng)參數(shù)符合下述“10.質(zhì)量控制”中的要求，然后到Plate窗下記錄定性結(jié)果。點(diǎn)擊軟件界面上方文件的下拉菜單打開(kāi)可以直接打開(kāi)上機(jī)文件，選擇右側(cè)分析類(lèi)型，左上角的1?6數(shù)字鍵可以選擇對(duì)應(yīng)的通道進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的導(dǎo)出：點(diǎn)擊左上角的文件，在其下拉菜單中有導(dǎo)出，選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以導(dǎo)出*.xls格式的實(shí)驗(yàn)文件。質(zhì)量控制2019-nCoV-PCR-陰性對(duì)照:FAM、ROX通道及內(nèi)標(biāo)(HEX)通道均無(wú)Ct值或Ct>40；2019-nCoV-PCR-陽(yáng)性對(duì)照:FAM、ROX及內(nèi)標(biāo)(HEX)通道均CtM35；2019-nCoV-PCR-弱陽(yáng)性對(duì)照:FAM、ROX及內(nèi)標(biāo)(HEX)通道均Ct<40；10.3以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重新進(jìn)行。干擾和交叉反應(yīng)11.1標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)本收集、處理、運(yùn)送及保存質(zhì)量有關(guān)，其中任何失誤都將會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。如果標(biāo)本處理時(shí)沒(méi)有控制好交叉污染，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。11.2樣本中可能存在的干擾物質(zhì)：100pg/mL鹽酸羥甲唑琳、50gg/mL地塞米松、50gg/mL鹽酸頭孢甲肟、100gg/mL奧司他韋、100pg/mL扎那米韋、100pg/mL利巴韋林、100pg/mL阿奇霉素、300U/mLa-干擾素、320pg/mL布地奈德、125gg/mL苯福林、100gg/mL妥布霉素、50gg/mL倍氯美松、100pg/mL氟尼縮松、100pg/mL莫米松、200pg/mL氟替卡松、200|ig/mL鹽酸組胺、100pg/mL帕拉米韋、100pg/mL洛匹那韋、100哽/mL莫匹羅星、100哽/mL曲安奈德、100gg/mL利托那韋、100gg/mL阿比多爾、60gg/mL氯化鈉、100gg/mL尿素、10gg/mL血紅素、20gg/mL純化粘蛋白、20%(v/v)無(wú)水乙醇、20%(v/v)人全血對(duì)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯干擾。參考范圍本方法檢測(cè)下限為200IU/ml，檢測(cè)目標(biāo)基因的Ct參考值為40；內(nèi)標(biāo)Ct的參考值為40。檢驗(yàn)結(jié)果分析13.1對(duì)于FAM和ROX通道均檢測(cè)到典型的S型擴(kuò)增曲線，且Ct<40的樣本，更換檢驗(yàn)人員，使用兩種不同廠家的新冠核酸檢測(cè)試劑提取樣本核酸進(jìn)行復(fù)核，若結(jié)果ORFIab和N基因同時(shí)陽(yáng)性時(shí)，判定為陽(yáng)性；若僅ORFla或N基因其中之一檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性時(shí)，需重新采樣復(fù)查,復(fù)查后ORPlab或N基因仍為陽(yáng)性時(shí),判定為陽(yáng)性,并采用其他試劑成方法進(jìn)行確認(rèn)；報(bào)告為2019-nCoV病毒“初篩陽(yáng)性待復(fù)查”，并將標(biāo)本送至疾控確診。13.2對(duì)于FAM或ROX通道出現(xiàn)單靶標(biāo)檢測(cè)到典型的S型擴(kuò)增曲線，且Ct<40的樣本，使用不同廠家的新冠核酸檢測(cè)試劑重新提取樣本核酸進(jìn)行復(fù)查，若仍為單靶標(biāo)陽(yáng)性，則重新采樣進(jìn)行復(fù)檢；如果仍為單靶標(biāo)陽(yáng)性，報(bào)告為2019-nCoV病毒“初篩陽(yáng)性待復(fù)查”，并將標(biāo)本送至疾控確診；否則判斷為陰性。13.3Ct值位于灰區(qū)，當(dāng)出現(xiàn)Ct值在37-40之間時(shí)為灰度區(qū)?？赡艽嬖谙铝星闆r:2個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果均處于“灰度區(qū)”；1個(gè)位點(diǎn)判讀為陽(yáng)性，另1個(gè)立點(diǎn)的結(jié)果處于“灰度區(qū)”1個(gè)位點(diǎn)判讀為