下一代測序技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)診斷中的應(yīng)用

下一代測序技術(shù)

在臨床實(shí)驗(yàn)診斷中的應(yīng)用

測序技術(shù)的發(fā)展1954年，Whitfeld等用化學(xué)降解的方法測定多聚核糖核苷酸序列1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法，Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法進(jìn)行DNA測序80年代中期出現(xiàn)了以熒光標(biāo)記代替放射性同位素標(biāo)記、以熒光信號接收器和計(jì)算機(jī)信號分析系統(tǒng)代替放射性自顯影的自動測序儀90年代中期出現(xiàn)毛細(xì)管電泳技術(shù)Sanger測序技術(shù)指標(biāo)讀長可達(dá)1000bp準(zhǔn)確率99.999%每千堿基對測序成本僅$0.5每天的數(shù)據(jù)通量可以達(dá)到600000

bp對于一代測序而言，其速度和成本已達(dá)到極限。測序技術(shù)的發(fā)展進(jìn)入21世紀(jì)后，以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標(biāo)志的下一代測序技術(shù)誕生了。2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)——GenomeSequencer20System，開創(chuàng)了邊合成邊測序（sequencing-by-synthesis）的先河?！癗extgenerationsequencing”PubmedsearchingJun10,2015FortheFirsttime:Whole-GenomeSequencingDeliversNewTreatmentOptionsforTwinswithRareGeneticMovementDisorder50-HourWholeGenomeSequencingProvidesRapidDiagnosisforChildrenWithGeneticDisorders下一代測序（NGS）已逐漸應(yīng)用于臨床分子診斷不同規(guī)模的NGS實(shí)驗(yàn)在臨床分子診斷中的應(yīng)用全基因組測序（Genome）：產(chǎn)前診斷全外顯子組測序（Exome）：發(fā)現(xiàn)、鑒定致病基因靶向目標(biāo)基因測序（Panel）：臨床分子診斷SangerPanelExomeGenome非常準(zhǔn)確價(jià)格低廉/外顯子檢測周期短可以優(yōu)化“偶然發(fā)現(xiàn)”可能性低容易分析結(jié)果容易解讀無基因偏倚標(biāo)準(zhǔn)化工作流程可以對用完的數(shù)據(jù)進(jìn)行再分析測序無偏倚極少技術(shù)偏倚同時(shí)檢測結(jié)構(gòu)性變異和SNV對遺傳異質(zhì)性高的疾病診斷率低需要對panel進(jìn)行設(shè)計(jì)和再設(shè)計(jì)針對不同的疾病需要不同的panel需要足夠的樣本存在測序偏倚沒有非編碼區(qū)信息“偶然發(fā)現(xiàn)”存在數(shù)據(jù)分析瓶頸非編碼區(qū)變異的解釋耗時(shí)臨床分子診斷中各種測序方法的優(yōu)劣比較Contributionofdifferentfactorstotheoverallcostofasequencingprojectacrosstime在臨床診斷領(lǐng)域首次利用WES，對一例原先懷疑為Batter綜合征的患兒作出了先天性氯化物丟失性腹瀉的正確診斷，該患兒發(fā)生了SLC26A3基因的D652N的新生純合突變NGS在臨床分子診斷中的應(yīng)用NGS在神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病分子診斷中的應(yīng)用(1)將NGS技術(shù)作為常規(guī)診斷試驗(yàn)進(jìn)行候選基因突變篩查對于神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病患者的臨床診療和遺傳咨詢具有重要價(jià)值NGS在神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病分子診斷中的應(yīng)用(2)DMD和BMD是最常見的NMDDMD基因巨大，常規(guī)方法難度大89例DMD和BMD患者，18例女性攜帶者和245例非DMD患者CNV：99.99%精確性

和98.96%敏感性SNV：100%準(zhǔn)確率9例患者發(fā)生部分外顯子缺失，可知精確斷裂位置信息NGS在視網(wǎng)膜疾病分子診斷中的應(yīng)用（1）作者病例數(shù)基因數(shù)臨床診斷基因診斷率Neveling,etal.100111視網(wǎng)膜變性36%Audo,etal.20254遺傳性視網(wǎng)膜病家系57%Bowne,etal.2146常染色體顯性遺傳視網(wǎng)膜變性家系24%Glockle,etal.170105遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良55%～80%Wang,etal.123163視網(wǎng)膜變性37%Fu,etal.31163常染色體隱性視網(wǎng)膜變性家系40%較之傳統(tǒng)的分子診斷方法（如采用Sanger測序技術(shù)逐個(gè)基因進(jìn)行分析），NGS能夠有效提高各種類型視網(wǎng)膜疾病分子診斷的能力和效率；同時(shí)能有效降低分子診斷的費(fèi)用NGS在視網(wǎng)膜疾病分子診斷中的應(yīng)用（2）105個(gè)已知視網(wǎng)膜疾病致病基因組成的NGS診斷panel107例臨床未經(jīng)篩選的視網(wǎng)膜疾病患者視網(wǎng)膜變性患者的分子診斷率：55%Bardet–Biedl綜合征或Usher綜合征患者：80%均發(fā)現(xiàn)致病或候選致病變異NGS在遺傳病攜帶者檢測中的應(yīng)用利用NGS技術(shù)，能對嚴(yán)重影響兒童健康的遺傳病進(jìn)行全面、系統(tǒng)篩查NGS在線粒體疾病分子診斷中的應(yīng)用42例經(jīng)常規(guī)基因檢測未能診斷的嬰兒型線粒體病此panel包含線粒體基因組、100個(gè)已知線粒體病致病基因及1000個(gè)與線粒體功能相關(guān)基因與正常人相比，患者群體中具有功能影響的變異（罕見變異、影響蛋白功能的變異及隱性遺傳的變異）負(fù)荷增加了5倍55%存在隱性基因突變或致病性線粒體基因突變：10例（24%）患者進(jìn)行明確的分子診斷；

13例（31%）患者出現(xiàn)核基因突變，其中2例患者的突變經(jīng)功能研究發(fā)現(xiàn)可疑引起線粒體病NGS在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用利用NGS技術(shù)對孕婦外周血中的cfDNA進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷（noninvasiveprenataltesting,NIPT）已成為該領(lǐng)域的發(fā)展趨勢基于孕婦外周血無細(xì)胞血漿胎兒DNA的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的21三體（0.3%vs.3.6%,P<0.001）和18三體（0.2%vs.0.6%,P=0.03）的假陽性率遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的產(chǎn)前篩查NIPT能夠檢出全部攜帶常染色體異倍體的孕婦，陰性預(yù)測值為100%（95%CI：99.8%～100%）同時(shí)，NIPT對21三體（45.5%vs4.2%）和18三體（40.0%vs8.3%）的陽性預(yù)測值顯著高于標(biāo)準(zhǔn)篩查方法可以作為常染色體異倍體篩查的一線方法NGS在腫瘤分子診斷中的應(yīng)用診斷用藥治療監(jiān)測預(yù)后評估……精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃2015年1月20日，美國總統(tǒng)奧巴馬在國情咨文演講中提出了“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃”，30日白宮發(fā)布文件正式啟動“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃”，希望精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)可以引領(lǐng)一個(gè)醫(yī)學(xué)新時(shí)代。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)

是一種在預(yù)防和治療疾病時(shí)，考慮到人體在遺傳、環(huán)境和生活方式中存在個(gè)體化差異的新方法。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃將產(chǎn)出推動精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念進(jìn)入臨床實(shí)踐的科學(xué)證據(jù)。美國精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃-定義把按基因匹配癌癥療法變得像匹配血型那樣標(biāo)準(zhǔn)化，把找出正確的用藥劑量變得像測量體溫那樣簡單，每次都給恰當(dāng)?shù)娜嗽谇‘?dāng)?shù)臅r(shí)間使用恰當(dāng)?shù)寞煼?。美國精?zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃-定義美國總統(tǒng)奧巴馬的解釋美國精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃-目標(biāo)著重發(fā)展癌癥基因組學(xué)支持靶向藥物的臨床試驗(yàn)、藥物組合解決方案以及限制靶向用藥耐藥性的研究開發(fā)新的腫瘤細(xì)胞模型以預(yù)測藥物組合有效性，并研究藥物耐藥機(jī)制短期目標(biāo)：致力于將精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)用于癌癥領(lǐng)域針對不同人群的靶向抗腫瘤藥物的創(chuàng)新性臨床試驗(yàn)癌癥的綜合療法攻克藥物耐受長期目標(biāo)：為實(shí)現(xiàn)多種疾病的個(gè)性化治療提供有價(jià)值的信息創(chuàng)建大于100萬的志愿者隊(duì)列，他們愿意共享基因數(shù)據(jù)、生物樣本及所有電子健康信息。通過分析百萬志愿者的基因信息，研究遺傳性變異在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，了解疾病治療的分子基礎(chǔ)，為藥物研發(fā)與患者“精準(zhǔn)治療”明確方向。高級藥物基因組學(xué)，針對每個(gè)病人使用正確劑量的正確藥物確定疾病新的治療和預(yù)防目標(biāo)測試移動設(shè)備對人們健康生活習(xí)慣養(yǎng)成的作用為更多疾病的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供科學(xué)基礎(chǔ)美國精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃-目標(biāo)中國的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)國家精準(zhǔn)醫(yī)療戰(zhàn)略專家會議組建19人專家委員會計(jì)劃在2030年前投入600億元精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代的到來美國精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)：強(qiáng)調(diào)的基因組、蛋白質(zhì)組學(xué)等大多存在于分子層面，并以癌癥等重大疾病為主要攻克對象；中國精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)：定義更加寬泛，現(xiàn)代科技中不局限于分子層面，且加入了其他科技以及傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，并把有效與安全、經(jīng)濟(jì)，個(gè)體和社會效益放在同等重要的地位。中國疾病分布有自身特點(diǎn)：中國癌癥患者多，腫瘤患者每年新增350萬例，且癌癥發(fā)病譜有自身特點(diǎn)在遺傳病上，每年出生的缺陷新生兒120萬例中國是一個(gè)傳染病大國，抗生素濫用非常突出中國版精準(zhǔn)醫(yī)療需要聚焦在惡性腫瘤、疑難罕見病、疑難性疾病、藥物基因組學(xué)。我國應(yīng)發(fā)展具有中國特色、符合中國國情的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中國的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)NGS在腫瘤分子診斷中的應(yīng)用RainDropSourceKRASBackgroundSample+ThunderboltsEGFRTP53ThunderboltcancerpanelIncludeskeydrivermutations,tumorsuppressorgenes,drugresistancemarkersDividesample’stargetsintodigitalsingle-moleculeformatAllthedropletshaveALLtheprimerpairsIndexingbarcodesincorporatedin2ndstandard-formatPCRreactionFlowcell-readyforIlluminasequencersABL1EGFRGNAQKRASPTPN11AKT1ERBB2GNASMETRB1ALKERBB4HNF1AMLH1RETAPCEZH2HRASMPLSMAD4ATMFBXW7IDH1NOTCH1SMARCB1BRAFFGFR1IDH2NPM1SMOCDH1FGFR2JAK2NRASSRCCDKN2AFGFR3JAK3PDGFRASTK11CSF1RFLT3KDRPIK3CATP53CTNNB1GNA11KITPTENVHL50ImportantCancerGenes230AmpliconsOncologyCompanionDx我們的實(shí)踐WES用于范可尼貧血（FA-A）的

臨床分子診斷FANCA基因的復(fù)合雜合突變WES用于家族性馬蹄內(nèi)翻足的

臨床分子診斷FLNBc.4810G>T,p.D1604YWES用于先天性關(guān)節(jié)攣縮畸形的

臨床分子診斷WES用于出血病患者的分子診斷病人資料患者，女性，臨床類似血友病出血表現(xiàn)用凝血酶原復(fù)合物治療有效DIC、凝血因子活性檢測均正常VWD排除血小板功能正常其弟與其有相似的臨床出血表現(xiàn)，父母為近親婚配遺傳性出血性疾?。蜃庸δ苋毕?？）NGS結(jié)果631A>C,211T>P

F10基因表型診斷APTT:

50.2sFⅤ:124.9%PT:

11.3sFⅧ:76.7%INR:

0.98FⅪ:118.7%FIB:

3.71g/LFⅫ:80.7%FⅡ:

109.8%FⅦ:

100.4%FⅨ:72.0%FⅩ(PT法):

108.3%FX:C（APTT法）=4.36%病人凝固時(shí)間=76.7s發(fā)色底物法：FX:C=109.4%NGS應(yīng)用于疾病基因診斷存在的問題基因變異致病性的確定（缺乏統(tǒng)一、精確注釋、經(jīng)審核的基因型-表型數(shù)據(jù)庫;文獻(xiàn)報(bào)道中有27%的致病變異實(shí)為多態(tài)性或注釋錯誤）偶然發(fā)現(xiàn)結(jié)果的報(bào)告（ACMG指南及引發(fā)的爭議）N