酵母雙雜交操作步驟(中文翻譯)

酵母雙雜交操作步驟(中文翻譯)酵母雙雜交操作步驟(中文翻譯)酵母雙雜交操作步驟(中文翻譯)xxx公司酵母雙雜交操作步驟(中文翻譯)文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計，管理制度（酵母菌儲存在-70℃中，引物和質(zhì)粒DNA儲存在-20℃中）概念：1.次序轉(zhuǎn)化:指的是先將一種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母中（常是DNA-BD/baitplasmid），在選擇培養(yǎng)基中選擇出陽性克隆，之后再將另外一個質(zhì)粒（ADfusionlibrary）轉(zhuǎn)化進(jìn)去。優(yōu)點：就是比共轉(zhuǎn)化使用更少的質(zhì)粒DNA，也就是節(jié)約質(zhì)粒DNA。2.共同轉(zhuǎn)化：將兩種質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母中。優(yōu)點：比次序轉(zhuǎn)化更容易操作。pGBKT7----的選擇物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的選擇物是：ampicillin(氨芐西林)各種SD培養(yǎng)基：SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his（組氨酸）(1000ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）：;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.60g（購買來就配好的）;葡萄糖20g(即2%)SD/-leu/-trp/-his(1000ml)酵母氮源（YNB）：;-leu/-trp/-hisDOsupplement0.62g;（購買來就配好的）葡萄糖20g.(即2%)SD/-leu/-trp(1000ml)（“二缺”）酵母氮源（YNB）：;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.64g（購買來就配好的）;葡萄糖20g(即2%)SD/-leu(1000ml)酵母氮源（YNB）：;-leuDOsupplement0.69g;（購買來就配好的）葡萄糖20g(即2%)SD/-trp(1000ml)酵母氮源（YNB）：;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.74g;（購買來就配好的）葡萄糖20g(即2%)注意：YNB有兩種，一種含有硫酸胺，另外一種不含硫酸胺。我們這用的是含硫酸銨的。（買來就加進(jìn)去了的）。如果不含硫酸銨，那么要在終濃度%的YNB中再加入%的硫酸銨，即最終在1000ml溶液中加入總量為的YNB與硫酸銨。實際配制的方法是：配制40%的葡萄糖貯存液（貯存在4℃），過濾除菌，待高壓滅菌的溶液溫度降至55℃以下時，再將50ml葡萄糖貯存液加入。（過濾即可使用）酵母氮源6.7g，加DOsupplement在920ml水中溶解，調(diào)PH至（大約加10MNaOH200ul即可），之后補(bǔ)水至950ml。高壓完后待溫度降至55℃以下，加入50ml40%葡萄糖。YPD培養(yǎng)基(1000ml)20g/L蛋白胨10g/L酵母提取物20g/L瓊脂（只有制作平板才用）20g/L葡萄糖(即2%)1xYPDA培養(yǎng)基(1000ml)20g/L蛋白胨10g/L酵母提取物0.03g/L腺嘌呤（即終濃度為％）腺嘌呤可以耐受高溫20g/L葡萄糖(即2%)實際配制的方法是：配制40%的葡萄糖貯存液（貯存在4℃），過濾除菌，待高壓滅菌的溶液溫度降至55℃以下時，再將50ml葡萄糖貯存液加入。（李博士經(jīng)驗這一步不高壓，過濾即可使用）配制%的腺嘌呤溶液，過濾除菌，待高壓滅菌的溶液溫度降至55℃以下時，再將15ml腺嘌呤溶液加入。（或?qū)⑾汆堰手苯蛹舆M(jìn)去，為了方便我將直接加進(jìn)去一起高壓）（蛋白胨20g；酵母提取物10g；水大約925ml）混合后，調(diào)至PH至，加水至935ml，121℃高壓15min。注意：高壓的溫度和時間不能太長與太高，121℃高壓15min即可?？梢栽赮PDA中加入20g/L的瓊脂，以配成平板。需要加kanamycin時，kan終濃度是10–15mg/L。（kanamycin可以20℃貯存一個月，加入到平板中去可以4℃貯存一個月。）PEG/LiAc溶液（即配即用）用下列貯存液來配制50%PEG3350：用滅菌水配，如需要可以加熱至50℃以助溶。10XTEbuffer：用滅菌水配，如需要可以加熱至50℃以助溶。10XLiAc：用滅菌水配，如需要可以加熱至50℃以助溶。最后配成PEG/LiAc溶液是：（以10ml為例）終濃度為配制10mlPEG/LiAc需要加入的物質(zhì)PEG400040%8mlof50%PEGTEbuffer1X1mlof10XTELiAc1X1mlof10XLiAc無菌1xTE/LiAc溶液（用10x已滅菌的貯存液稀釋）10xTEbuffer:0.1MTris-HCl,10mMEDTA,pH(高壓)10xLiAc：1M用稀醋酸調(diào)節(jié)PH至高壓Forβ-galactosidase濾膜實驗Zbuffer溶液：Na2HPO4?7H2O16.1g/L（如換Na2HPO4?14H2O則20.739g/L）NaH2PO4?H2O5.50g/L（如換NaH2PO4?2H2O則6.21g/L）KCl0.75g/LMgSO4?7H2O0.246g/L最后調(diào)PH至，高壓，室溫下可以貯存1年X-gal溶液：X-GAL溶解于DMF（二甲基甲酰胺）中至濃度為20mg/ml.，–20°C避光保存Zbuffer/X-gal溶液：100mlZbuffermlβ-mercaptoethanol（β-巰基乙醇）mlX-gal貯存液ONPG溶液：（即配即用）ONPG溶于Zbuffer中，終濃度4mg/ml，調(diào)PH至.注意：ONPG需要1～2h才能溶解每次用之前新鮮制備。帶有β-巰基乙醇的Zbuffer將mlβ-巰基乙醇加入100mlZbuffer中即可為了轉(zhuǎn)化成功的小提示：1.用一個1～3周齡（直徑2～3mm）的菌落去接種液體培養(yǎng)基。如果菌落直徑＜2mm，就用多幾個菌落去接種。（也要大力渦旋使細(xì)胞團(tuán)分散開來。）2.如果過夜或者3hr之后的培養(yǎng)基明顯成塊，那么在使用之前一定要充分渦旋使培養(yǎng)基。3.當(dāng)通過離心收集細(xì)胞的時候，使用一個離心管即可，可以更好、更充分地收集細(xì)胞。4.為了提高轉(zhuǎn)化效率，要在1小時內(nèi)準(zhǔn)備酵母感受態(tài)細(xì)胞。如果有必要，可以在11步之后在室溫條件下儲存酵母感受態(tài)細(xì)胞幾個小時，而活性卻只有一點降低。5.當(dāng)進(jìn)行通同轉(zhuǎn)化的時候，誘餌（BD）質(zhì)粒的量必須過度，而AD質(zhì)粒的量要不足。一般BD是AD的兩倍。（李博士：此要求一般是針對文庫篩選而言）6.為了使菌落更好地生長，在涂布轉(zhuǎn)化復(fù)合物到瓊脂平板上時要直到所有液體被吸收?？梢赃x擇直徑5mm的無菌玻璃珠（每一個100mm的平板用5-7個玻璃珠，直徑150mm的平板用7-9個玻璃珠）去促進(jìn)轉(zhuǎn)化復(fù)合物的擴(kuò)散，搖動的時候shaketheplatebackandforth—notroundandround.（科內(nèi)似并無此操作，而僅僅以玻棒涂布耳）一.復(fù)蘇酵母：將酵母細(xì)胞接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)1-3周。（接種的時候采取四區(qū)分區(qū)畫線法）二.酵母感受態(tài)細(xì)胞置備和轉(zhuǎn)化步驟：1.取直徑2～3mm的克隆接種到1ml的YPD或SD培養(yǎng)基中。2.劇烈振蕩或渦旋5min，使所有團(tuán)塊分散開來。3.轉(zhuǎn)移酵母液到50mlYPD（固體——也有液態(tài)的，未加入瓊脂粉耳）或者SD培養(yǎng)基中。4.置于30℃搖床中，以250rpm的轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)基16～18h，直到OD600>5.轉(zhuǎn)移部分過夜培養(yǎng)物（30ml）到300mlYPD培養(yǎng)基（固體）中，使最終OD600在～之間。6.30℃搖床以230rpm的轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)基3～4h直至OD為～.（IftheOD600is<,somethingiswrongwiththeculture）7.轉(zhuǎn)移酵母液至50ml離心管中，1000g室溫（20～21°C）離心5min8.棄去上清，加入25～50ml無菌水或無菌的1xTE重懸酵母。9.在1000g室溫（20～21°C）條件下離心5min10.輕輕倒出（棄去）上清11.將細(xì)胞重懸于新鮮準(zhǔn)備的，無菌的1xTE/1xLiAc（在實驗開始之前置備）(至此酵母感受態(tài)細(xì)胞制備完畢)12.向無菌的微量離心管中加入質(zhì)粒DNA各和鯡魚精載體DNA，之后輕輕混勻。13.再向每管中加入ml酵母感受態(tài)細(xì)胞，并且震蕩混勻。14.向每一管加入600ul無菌PEG/LiAc溶液，高速振蕩混勻。15.30℃搖床以200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)30min16.向每一管加入70ulDMSO輕輕顛倒混勻，不要震蕩。17.42℃水浴熱激15min18.取出后在冰上冷卻1-2minrpm室溫離心5min，棄去上清。20.用ml無菌的1×TE重懸酵母。21.取合適體積的菌液（一般是100ul）涂在選擇性的SD培養(yǎng)基的平板上，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4天。（將克隆分成三份涂與不同平板上，1/3涂在SD/–His/–Leu/–Trp，1/3涂在SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp，最后1/3涂在SD/–Leu/–Trp上。）（科內(nèi)僅涂布二缺與四缺板）（在21步之后涂一個二缺板和一個四缺板）因為在二缺板中AH109能生長，說明BD和AD已經(jīng)轉(zhuǎn)進(jìn)去了。如果在四缺板中能生長，說明誘餌和文庫肯定有作用，接著做一個α-gal實驗。如果是將質(zhì)粒轉(zhuǎn)到Y(jié)187中的話，21步之后涂一個二缺板就行了。如果酵母能生長的話就接著做一個β-gal。所以有的人同時轉(zhuǎn)化兩種菌種。這樣就完全可以確定兩蛋白是否有作用了。之后計算轉(zhuǎn)化率，如果轉(zhuǎn)化率達(dá)到10的6次方以上，那么就可以接著做后面的檢驗實驗。三.α和β-gal實驗：（我就做β-gal試驗，要注意如果做β-gal的話，這時候菌種要換成Y187，而不是之前的AH109）（在protocol的24～28頁）1.試劑：2.原理：ONPG為無色物質(zhì)，在β-半乳糖苷酶的作用催化下生成黃色的onitrophenol(硝基苯酚)，在420nm(OD410)處有光吸收。Na2CO3可以提高PH值，使酶變性，從而終止反應(yīng)。（Na2CO3在配制時，不需要高壓）3.實驗方法一.Colony-liftFilterAssay（濾膜分析或濾膜試驗）（這是定性試驗）將要測試的菌株（直徑1-3mm）轉(zhuǎn)接到新的選擇性SD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2-4天。準(zhǔn)備Zbuffer/X-gal溶液。為每一個要測試的平板準(zhǔn)備好一張無菌的Whatman濾紙，置于100mm或150mm無菌平板中用Zbuffer/X-gal溶液浸泡。用無菌的鑷子小心地將無菌Whatman濾紙覆蓋到平板表面，要使所有的待測菌株都有部分沾到濾紙上。用注射器在濾紙上打3個或更多的不對稱的孔，以標(biāo)志方向。濾紙放入液氮中～1min至結(jié)冰，之后再放置于室溫融化，如此反復(fù)凍融3次。小心地將帶有菌株的濾紙放到預(yù)浸泡的濾紙上，有菌株一面向上，注意兩層濾紙中間不要有氣泡。平板放到30℃培養(yǎng)箱中，觀察其是否變藍(lán)。一般陽性克隆在～8h內(nèi)會變藍(lán)，超過8h容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。二.LiquidCultureAssay（以O(shè)NPG為底物的液體培養(yǎng)法）（這是定量試驗）在合適的SD培養(yǎng)基中制備5ml過度培養(yǎng)物。注意：你所選用的SD培養(yǎng)基要適合你所用的系統(tǒng)和質(zhì)粒。在進(jìn)行實驗當(dāng)天，將ONPG以4mg/ml的濃度溶于Zbuffer中，振蕩1～2h確保完全溶解。大力渦旋過夜培養(yǎng)基1min以分散細(xì)胞團(tuán)塊，立即轉(zhuǎn)移2ml（）過夜培養(yǎng)基物到8ml(2ml)YPD培溶液中。（以25%的含量加）30℃培養(yǎng)3～5h（230-250rpm）直至細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期（1ml溶液的OD600應(yīng)在之間）在收獲細(xì)胞的同時記錄OD600值。注意：在檢測OD值的時候，渦旋培養(yǎng)基以分散細(xì)胞團(tuán)塊各吸取ml（ml）培養(yǎng)物到各3個ml離心管（每個管子就是），離心14000rpm/30sec。小心移去上清，加上ml（ml）Zbuffer到每個管中，渦旋直到細(xì)胞重懸。再次離心并移去上清，加上300ul（100ul）Zbuffer到每個管中，渦旋直到細(xì)胞重懸。這樣，終濃度就是=5倍。注意：在這個清洗步驟之后，細(xì)胞收獲物的差異可以通過再次讀取OD600值來糾正。轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至新的離心管中。將細(xì)胞置于液氮中（約～1min）直至細(xì)胞冰凍。將離心管放于37℃水浴中～1min使其融化。反復(fù)凍融3次（重復(fù)9和10步）確保細(xì)胞裂解。用100ulZbuffer.來設(shè)置一個空白對照。加ml的Zbuffer與β-巰基乙醇到反應(yīng)管和空