六味地黃丸中丹皮酚的含量測(cè)定方案

六味地黃丸中丹皮酚的含量測(cè)定方案一、設(shè)計(jì)背景六味地黃丸由熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、澤瀉、茯苓等原料炮制而成，是世界各地廣泛使用的古老中藥，用于治療腰痛、脫發(fā)、月經(jīng)不足、脫發(fā)、治療腎陰虛證等各種疾病。腰、膝酸痛。六味地黃丸作為中藥方劑，已有上千年的歷史，最早記載于宋代《孝兒要正之覺》錢毅著。大量研究表明，丹皮酚具有多種藥理活性，廣泛的應(yīng)用使其已成為我國(guó)最受歡迎的商業(yè)中藥方劑之一。其具有抗衰老、調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子、治療II型糖尿病、調(diào)節(jié)中性系統(tǒng)等功效。中藥的治療作用主要由多種成分共同作用，如果是要測(cè)定其中的一種生物活性成分物質(zhì)，則需要設(shè)計(jì)方案來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。利用高效液相色譜，能較好地反映中藥中不同含量的質(zhì)量信息。另一方面，由于中藥的質(zhì)量與其主要生物活性成分直接相關(guān)，因此在質(zhì)量控制實(shí)踐中，定量分析也是必不可少的。丹皮酚治療顯著降低血糖水平、機(jī)械性痛覺過(guò)敏、機(jī)械性痛覺過(guò)敏和熱痛覺過(guò)敏。丹皮酚治療還能提高運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和感覺神經(jīng)的傳導(dǎo)速度。組織病理學(xué)研究表明丹皮酚治療可防止神經(jīng)元損傷，降低脫髓鞘和白細(xì)胞浸潤(rùn)。丹皮酚是六味地黃丸中非常重要的一種藥用生物活性物質(zhì)。測(cè)定其含量可以為質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。圖1、丹皮酚化學(xué)式二、設(shè)計(jì)依據(jù)檢測(cè)依據(jù)來(lái)自于《中國(guó)藥典》（2020版）中有關(guān)于測(cè)定中藥材中有關(guān)含量的要求。方法一是選用紫外分光光度計(jì)法來(lái)進(jìn)行測(cè)定的話，首先要對(duì)其進(jìn)行一個(gè)超聲處理，這樣做的話，其操作簡(jiǎn)單方便、而且提取時(shí)間也比較短，方便來(lái)進(jìn)行操作，提取之后，用紫外分光光度計(jì)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，因?yàn)榈てし釉谔囟ǖ奈展獠ㄩL(zhǎng)下，其吸光度比較大，測(cè)定的含量比較準(zhǔn)確，受到其他物質(zhì)的干擾會(huì)比較小。方法二是選用高效液相色譜法來(lái)進(jìn)行測(cè)定，采用高效液相色譜法來(lái)測(cè)定的話，其測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確，選取適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗪土鲃?dòng)相，想要提取的物質(zhì)因?yàn)樵谒x取的兩相之中的溶解度不一，隨著不斷的溶解吸解吸這一個(gè)過(guò)程，就可以來(lái)對(duì)想要的物質(zhì)進(jìn)行分離。用高效液相色譜法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)也是選取超聲來(lái)進(jìn)行一個(gè)前處理，其結(jié)果精密度和準(zhǔn)確度都很好。就這兩種方法而言，用高效液相色譜法更優(yōu)，所以選取高效液相色譜法。三、設(shè)計(jì)方案（一）儀器與材料1.儀器電子天平（cp224D，天平塞多利斯科學(xué)儀器有限公司）、高效液相色譜儀(HP1100系列四元泵、上海惠普有限公司）、水浴加熱鍋（HH-4恒溫水浴鍋，金昌實(shí)驗(yàn)儀器源頭廠家），超聲儀、膠頭滴管、燒杯、移液管、容量瓶等。2.試劑試藥丹皮酚對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度：96.2％)；六味地黃丸樣品，由實(shí)習(xí)單位提供(規(guī)格：0.18*360丸)；甲醇（色譜純）、水為去離子水，其他試劑均為分析純。（二）色譜條件色譜柱：Shim-pack

VP-ODS柱(150×4.7mm,5μm)甲醇－水（70：30）色譜柱溫：20℃進(jìn)樣室溫度：室溫進(jìn)樣量：10μl流速：1.0mi/min檢測(cè)波長(zhǎng)為274nm以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測(cè)波長(zhǎng)為274nm。理論板數(shù)按丹皮酚峰計(jì)算應(yīng)不低于3500，相鄰色譜峰的分離度均應(yīng)大于1.59。（三）溶液的制備1.對(duì)照品溶液的制取對(duì)照品丹皮酚適量,

精密稱定,

加甲醇制成1ml含0.24mg丹皮酚的貯備液,

用刻度吸管精密吸取2.5ml該貯備液移置25ml容量瓶中,加甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻，制成每1mL含42μg的溶液,待用。2.供試品溶液的制備取供試品六味地黃丸20粒,搗碎研細(xì)混勻,取約0.4g,精密稱定,放入有瓶口塞的錐形瓶中,再精密加入50%甲醇50mL,加塞密閉,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率33KHz)45min,放冷,再次稱定重量,用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻后濾過(guò),取續(xù)濾液,待用。3.緩沖溶液的制備中國(guó)藥典中所述六味地黃丸的配方為：熟地黃120g,

酒萸肉60g,

山藥60g,

茯苓45g,

澤瀉45g,

牡丹皮45g，除牡丹皮外，處方中各味藥按8∶4∶4∶3∶3的比例混合，搗碎研細(xì)混勻,取約0.4g,精密稱定,放入有瓶口塞的錐形瓶中,再精密加入50%甲醇50mL,加塞密閉,稱定重量,

超聲處理(功率250W,頻率33KHz)45min,放冷,再次稱定重量,用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻后濾過(guò),取續(xù)濾液，便制得不含牡丹皮的緩沖溶液。（四）方法學(xué)考察1.專屬性試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及緩沖溶液，在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果應(yīng)使測(cè)定對(duì)象丹皮酚相應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)干擾，即緩沖溶液在與丹皮酚對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處未見明顯的色譜峰,說(shuō)明分離良好,緩沖溶液無(wú)干擾。記錄丹皮酚的保留時(shí)間，計(jì)算分離度，判定是否可以達(dá)到良好的分離效果。2.線性關(guān)系的確定分別取所配制的對(duì)照品貯備溶液（0.24mg/ml）：1.0ml、2.0ml、4.0ml、8.0ml、10.0ml、15.0ml、20.0ml，分別置于25ml容量瓶中，依次取溶液10μl，按濃度由低到高的順序，按上述色譜條件方法注入高效液相色譜儀進(jìn)樣分析，分別記錄丹皮酚的色譜峰峰面積。以丹皮酚峰面積(A)對(duì)丹皮酚濃度(C)進(jìn)行回歸處理，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。3.精密度試驗(yàn)取對(duì)照品溶液丹皮酚（0.24mg/ml）,按上述色譜條件的方法重復(fù)進(jìn)樣分析5次，每次進(jìn)樣10μl,記錄丹皮酚面積以及保留時(shí)間,重復(fù)5次,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值應(yīng)該不大于2.0%，則表明精密度良好。4.穩(wěn)定性試驗(yàn)取同批次的對(duì)照品溶液，室溫下分別在0，2，4,6，8,10，12h進(jìn)樣10μl至高效液相色譜中測(cè)定，記錄的峰面積，計(jì)算均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），相對(duì)偏差（RSD）在范圍之內(nèi)不大于1.50%，表明對(duì)照品溶液在12h內(nèi)的穩(wěn)定性良好5.重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密稱取同一批次的供試品溶液5份，分別進(jìn)樣10μl至高效液相色譜中，記錄色譜圖峰面積，求得標(biāo)準(zhǔn)偏差，測(cè)定含量，峰面積的相對(duì)偏差應(yīng)（RSD）不大于2.0%，則表明該方法具有良好的重復(fù)性。6.加樣回收率實(shí)驗(yàn)取3種不同批次的六味地黃丸,研細(xì)后精密稱定，每批各2份，每份0.2g分別置于50mg的容量瓶中，加入0.24mg/ml丹皮酚對(duì)照品貯備液1.0ml、2.0

ml,分別取10μl注入色譜儀中，按照上述色譜條件方法進(jìn)行檢測(cè)，記錄加入量，測(cè)得量，計(jì)算回收率，平均回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，回收率應(yīng)在98.0%-102.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）應(yīng)不大于2.0%(n=6)。四、設(shè)計(jì)小結(jié)本方案采用Shim-packVP-ODS柱(150×4.7mm,5μm)色譜柱，流動(dòng)相為甲醇－水(70∶30)；流速1.0ml/min；柱溫:室溫20；進(jìn)樣量10μl;檢測(cè)波長(zhǎng)274nm。色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;取丹皮酚對(duì)照品溶液進(jìn)樣，在200～400nm波長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行掃描，選取這個(gè)波長(zhǎng)是因?yàn)樵谶@個(gè)波段丹皮酚的吸收度最高，所得出的測(cè)定結(jié)果最接近真實(shí)值，誤差是最小的，可獲得足夠數(shù)量的檢測(cè)峰，選取上述流速則是在這個(gè)流速之下，丹皮酚在兩相之間吸附解吸的效率最高，而且可以達(dá)到最大限度的將六味地黃丸之中的丹皮酚全部提取出來(lái)。選取甲醇而不是乙醇的原因是用甲醇處理，反應(yīng)峰多，干擾小，峰形好。更有利于檢測(cè)，還可以獲得更好的響應(yīng)。采用甲醇-水洗脫體系，因?yàn)閾?jù)查閱文獻(xiàn)可得，上述為最佳的色譜條件。其線性梯度洗脫對(duì)樣品的分離能力最佳。若達(dá)不到預(yù)期的目的，可通過(guò)對(duì)色譜條件進(jìn)行改進(jìn)，比如可以選擇合適長(zhǎng)度、粒徑的色譜柱，以期達(dá)到預(yù)期的效果。五、附件材料圖1電子天平圖2高效液相色譜儀圖3六味地黃丸（濃縮丸）圖3六味地黃丸（濃縮丸）六、參考資料[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.2020.743.[2]宋曉，孫曉慧，李珂，等.HPLC不同廠家六味地黃丸中丹皮酚的含量測(cè)定.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014,35(0