層析技術(shù)的應(yīng)用

層析技術(shù)的應(yīng)用層析技術(shù)的應(yīng)用一、層析技術(shù)的原理和分類（一）層析技術(shù)的原理M.Tswett有效的分離分析工具之一。種溶媒。當(dāng)待分離的混合物隨溶媒（流動相）生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對比）可得到樣品中所含的各單一組份，從而達(dá)到將各組份分離的目的。（二）層析法分類見表16-5～7（三）層析法的特點(diǎn)與應(yīng)用表16-5按兩相所處狀態(tài)分類流動相液體流動相液體氣體液體液-液層析法氣-液層析法固體液-固層析法氣-固層析法計算機(jī)聯(lián)用，，。有分辨率高、靈敏度高、選擇性好、速度快等特點(diǎn)，因此適用于雜質(zhì)多、含量少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生物樣品的分離分析。近年來，已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)常用的分析方法。在醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境化學(xué)、高分子材料、石油化工等方面也得到了廣泛的應(yīng)用．表16-6按層析原理分類名稱 分離原理吸附層析法分配層析法離子交換層析法凝膠層析法親和層析法

組份在吸附劑表面吸附固定相是固體吸附劑，各能力不同各組份在流動相和靜止液相（固相）同同因而在凝膠上受阻滯的程度不同固定相只能與一種待分離組份專一結(jié)合，以此和無親和力的其它組份分離表16-7按操作形式不同分類名稱柱層析法薄層層析法紙層析法薄膜層析法

操作形式固定相裝千柱內(nèi)，使樣品沿著一個方向前移而達(dá)分離將適當(dāng)粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點(diǎn)樣后用流動相展開，使各組份分離使各組份分離將適當(dāng)?shù)母叻肿佑袡C(jī)吸附劑制成薄膜，以類似紙層析方法進(jìn)行物質(zhì)的分離二、層析法實(shí)驗技術(shù)（一）凝膠層析法凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等。它的突出優(yōu)點(diǎn)是層析所用的凝膠屬千惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和不需要有機(jī)溶劑且對分離成分理化性對分子物質(zhì)有很好的分離效果。1凝膠的選擇根據(jù)實(shí)驗?zāi)康牟煌x擇不同型號的凝膠。如果實(shí)驗?zāi)康氖菍悠分械拇蠓肿游镔|(zhì)和小分子物質(zhì)分開，由于它們在分配系數(shù)上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用SephadexG-25和-50,對千小膚和低分子量的物質(zhì)(10005000)的脫鹽可使用Sephadex-10,-15BiGel-2。一一般選用排阻限度略大千樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠，層析過程中這些物質(zhì)都能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，由于凡不同，最后得到分離。2柱的直徑與長度根據(jù)經(jīng)驗，組別分離時，大多采用2-30cm長的層析柱，分級分離時，一般需要10l-1cm產(chǎn)生管壁效應(yīng)。長度L與直徑DL/D10但對移動慢的物質(zhì)宜在40。千10倍量的蒸館水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細(xì)的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費(fèi)時較長，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升1-2小時即可達(dá)到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節(jié)省時間又可消。凝膠的裝填：析柱與地面垂直固定在子，下端流出口用子夾，柱頂可安裝個帶有攪拌裝置的較大容器，柱內(nèi)充滿洗脫液，將凝膠調(diào)成較稀薄的漿頭液盛千柱頂?shù)娜萜髦校缓笤谖⑽⒌財嚢柘率鼓z下沉于柱，這樣凝膠粒 水平上，直到所需高度為，拆除柱頂裝，用相應(yīng)濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時間，再開始流動平衡，流速應(yīng)低于層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加析的流，千萬不能超過最終流。平衡凝膠床過夜，使用前要檢層析床是否均，有無“紋路”或氣泡，或加一些有色物質(zhì)來觀察色帶的移動，如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現(xiàn)歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。⒋加樣和洗脫凝膠床經(jīng)過平衡后，在床頂部留下數(shù)亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大于凝膠總床體積的5％-10％。樣品濃度與分配系數(shù)無關(guān)，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質(zhì)，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運(yùn)動受限，故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過1.5-2。樣品加入后打開流出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面相平時，再加入數(shù)毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進(jìn)入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預(yù)先設(shè)計好流速，然后分部收集洗脫液，并對每一餾份做定性、定量測定。0.02％的疊氮鈉，在下次層析前應(yīng)將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測定。709095％乙醇脫水90抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。⒍凝膠層析的應(yīng)用⑴脫鹽：高分子（如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠層析法除去，這一SephadexG-101525Bio-Gel-p-2465-1525％-30％，為了防止蛋白質(zhì)脫鹽后溶解度降低會形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發(fā)性鹽類。純。凝膠對熱原有較強(qiáng)的吸附力，可用來去除無離子水中的致熱原制備注射用水。物質(zhì)的洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的分子量。SephadexG-2550量的物質(zhì)就會進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部的孔隙中，而高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外，再經(jīng)離心或過濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液。（二）離子交換層析法性質(zhì)來分離離子型化合物的一種方法。⒈離子交換劑預(yù)處理和裝柱對于離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的顆粒，以保證有較好的均勻度，對于已溶脹好的產(chǎn)品則不必經(jīng)這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀堿處理，使之成H+OH--OH-離子交換劑則用“酸-堿-酸”處理，使最終轉(zhuǎn)為-H-pHpHpH樣品中的不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達(dá)到滿意的分離效果，上樣量要適當(dāng)，不1％-5％。pHpHpHpHpH離子強(qiáng)度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細(xì)的分離。最好的洗脫方16-6pHpHC＝C－（C－C）（1－V）A2/A12 2 1AAC1 2 1 2當(dāng)A＝A時為線性梯度，當(dāng)A＞A時為凹形梯度，A＞A時為凸形梯度。1 2 1 2 1 2形過寬。圖16-6梯度洗脫示意圖（5-10ml/管）目的的不同，可采用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學(xué)測定等）確定圖譜中目的物的位置，并回收目的物。2mol/:NaCl0.1mol/lNaOH醇洗滌，其順序為：0.5mol/lNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH0.002％氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005％）2％疊氮鈉。用于分離氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)，也可用于分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。（三）高效液相層析法高效液相層析法（HPLC）HPLC力學(xué)理論等都可用于高效液相層析。⒈高效液相層析儀典型的高效液相層析儀包括輸液系統(tǒng)、層析柱與檢測系統(tǒng)三部分。流動相用一高壓泵輸入。這種高壓泵應(yīng)滿足以下條件：①流量恒定，無脈動，并有較大的調(diào)節(jié)范圍。②能抗溶劑腐蝕。③15～300kg/c800kg/c。④泵的死體積要小。梯度洗脫裝置必須具備兩臺高壓泵，一臺輸送強(qiáng)溶劑，一臺輸送弱溶劑，兩泵運(yùn)轉(zhuǎn)速度用電腦控制，并可按一定的要求HPLCng⒉HPLC的類型與應(yīng)用⑴液-固吸附層析：固定相是具有吸附活性的吸附劑，常用的有硅膠、氧化鋁、高分子有機(jī)酸或聚酰胺凝膠等。液-固吸附層析中的流動相依其所起的作用不同，分為“底劑”和洗脫劑兩類，底劑起決定基可用于分離異構(gòu)體、抗氧化劑與維生素等。⑵液-液分配層析：固定相為單體固定液構(gòu)成。將固定液的官能團(tuán)結(jié)合在薄殼或多孔型硅膠上，經(jīng)酸相層析。另一種利用離子對原理的液-液分配層析為離子對層析。化學(xué)鍵合層析分：①極性鍵合相層析：極性大的后出峰，這稱為正相層析法，適用于分離極性化合物。②非極性鍵合相層析：固定相為非極性基團(tuán)，如十八烷基（C）、辛烷基（C）、甲基與苯基等，流動相用強(qiáng)極性溶劑，如水、醇、乙腈或無機(jī)鹽18 8防止因吸附而至的拖尾現(xiàn)象。極性大的組份先出峰，極性小的組份后出峰，恰好與正相法相反，故稱反相層析。本法適用于小分子物質(zhì)的分離，如肽、核苷酸、糖類、氨基酸的衍生物等。離子對分配層析分：①正相離子對層析：此法常以水吸附在硅膠上作為固定相，把與分離組份帶相反電荷的配對離子以一定濃度溶于水或緩沖液涂漬在硅膠上。流動相為極性較低的有機(jī)溶劑。在層析過程中，待分離的離子與水相中配對離子形成中性離子對，在水相和有機(jī)相中進(jìn)行分配，而達(dá)到分離。本法優(yōu)點(diǎn)是流動相選擇余地大，缺點(diǎn)是固定相易流失。②反向離子對層析：固定相是疏水性鍵合硅膠，如C18

鍵合相，待分離離子和帶相反電荷離。本法優(yōu)點(diǎn)是固定相不存在流失問題、流動相含水或緩沖液更適用于電離性化合物的分離。HPLCpHpK（四）親和層析法析技術(shù)。具有專一親和力的生物分子對主要有：抗原與抗體、DNADNARNA、酶與它的底物或競爭性抑制劑、激素（或藥物）與它們的受體、維生素和它的特異結(jié)合蛋白、糖蛋白與它相應(yīng)的植物凝集素等?？捎H和的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑，當(dāng)含有混合組份的樣品通過此固定相時，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)合，其它沒有親和力的無關(guān)與基質(zhì)共價連接的化合物稱配基。的限制。面。應(yīng)用實(shí)例：2-胰凝乳蛋白酶的提純⒈親和吸附劑（Σ-氨基-N-乙酰-Ｄ-色氨酸）Sepharose4B100mgCNBr2-8mol/lNaOHpH11.0。20℃左右，8-12200.1mol/lNaHCO（pH9.0）Sepharose43B0.1mol/lNaHCO（pH9.0）溶液混合，接著迅速加入α-胰蛋白酶抑制劑3氨基-N-乙酰-色氨酸甲酯）。抑制劑的最大用量為每毫升Sepharose4B65μmol/L42450mmol/lTris-HCl沖液（pH8.0）中保存?zhèn)溆谩?0mmol/LTris-HCl（pH8.0）緩沖液平衡（室溫）。樣品溶于同樣緩沖30-60ml/280nm0.2mol/L（pH3.0）洗脫。（五）聚焦層析法pHpH聚焦層析所用凝膠主要有兩種：MONOP（PBE）。其中MONOP帶正電荷的胺基填充，適用于高效聚焦層析。多元緩沖液交換劑是一種交換凝膠，適用作普通聚焦層析的16-8。表16-8聚焦層析技術(shù)數(shù)據(jù)凝膠名稱MONOP

pH11-8

洗脫P(yáng)harmalyte8-10.5PBE11-8Pharm