分子白云第六周rna part

RNABiology–PartIIIP2Theaccuracyoftranslation1、mRNA的錯誤翻譯<10-62、Twotypesoferrorsfromtheribosome:Frameshift移碼突變:~10-5Incorrectaminoacid:~5x10-43、Twotypesoferrorsfroman氨酰-tRNA合成酶:Wrongaminoacid、WrongtRNAP3SmallnuclearRNA(snRNA)小核RNA——eukaryoticcellnucleus?100-300nucleotidesinsize?許多snRNA是剪接體的組分：Majorspliceosome:U1,U2,U4,U5,U6Minorspliceosome:U11,U12P42種snRNA?Sm-classsnRNA?Lsm-classsnRNAP6SmallnucleolarRNA(snoRNA)小核仁RNA指導(dǎo)其他RNAs的初級化學(xué)修飾(rRNA,tRNA,snRNA)兩種snoRNA?C/DboxsnoRNAs?H/ACAboxsnoRNAsP7RNApairingwithboxC/DsnoRNAstoguidemethylationreactions甲基化.P8RNApairingwithboxH/ACAsnoRNAstoguidepseudouridylylations假尿苷化.P9Non-codingRNAs非編碼RNAsHousekeepingncRNAs：tRNA,rRNA,snRNA…RegulatoryncRNAs：miRNA、lncRNA…P10microRNAs(miRNAs)微RNA真核生物基因組編碼（內(nèi)源的）的(~22-ntlong)RNAmolecules.Thehumangenomehas>1000genescodeformiRNAs(~5%ofthegenome).Atleast30%ofourgenesareregulatedbymiRNAs,miRNAs參與RNAinterference(RNAi).RNAinterference(RNAi):Aprocessbywhichshort(21to23)nucleotideantisenseRNAs,derivedfromlongerdouble-strandedRNAs,canmodulateexpressionofmRNAbytranslationinhibitionordegradation.RNA干擾指由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的技術(shù)。P13miRNA-mRNA相互作用的模型1.The“seed”region:nucleatesthemiRNA-mRNAassociation.2.Bulgeormismatchesinthecentralregion:precluding排除thecleavageofmRNA.3.Reasonablecomplementarityonthe3’endtostabilizethisinteraction.P14ShortinterferingRNA(siRNAs)干擾小RNA外源合成或病毒產(chǎn)生的RNAiP17miRNApathwayPrimarymiRNAtranscripts(pri-miRNA)areatleast1000ntlong,containsingleorclustereddouble-strandedhairpinswithsingle-stranded5’and3’-terminaloverhangs.DNARNApol=2\*ROMANIIpri-miRNADroshaandDGCR8pre-miRNADicermiRNAduplexcleavageP20Precursor先驅(qū)miRNA(pre-miRNA)Pre-miRNAisexportedtothecytoplasmbyExportin-5andRanGTP.P21Dicer:anendoribonuclease內(nèi)切核糖核酸酶responsibleforcleavinglongdsRNAsand/orpre-miRNAstodsRNAduplexesofaspecificlengthdsRBP:double-strandedRNA-bindingprotein.siRNA介導(dǎo)沉默的機理：轉(zhuǎn)錄后水平的mRNA的降解以及染色體水平上形成異染色質(zhì)。siRNA介導(dǎo)mRNA的降解需要核酸酶的催化以及鎂離子的幫助。miRNA的功能：裝載成RISC后使互補配對的mRNA降解；miRNA也可抑制mRNA的翻譯，降低靶基因的蛋白水平但不影響其mRNA的水平。P25RISC:RNA-inducedsilencingcomplexRISCloadingcomplex(RLC):acomposedofatleastArgonaute(Ago),Dicer,andadsRBP.RLCgeneratediceddsRNAandloaditontoArgonaute.RISC裝載與鏈選擇一致。Argonaute(Ago)為一種蛋白，具體名字未查到。siRNAmiRNAsiRNAmiRNAP29Post-initiationtranslationrepression后起始翻譯抑制A、Blockingtranslationelongationorpromotepre-maturedissociationofribosomes.阻斷翻譯延長或促進成熟核糖體解離。B、Translationisnotinhibitedbutthenascentpeptidechainisdegradedco-translationally.翻譯不抑制，但新生肽鏈邊合成邊降解。AgocancompetewitheIF4Eforbindingtothe5’capstructure.Ago與eIF4E競爭結(jié)合到5’cap結(jié)構(gòu)。B、AgocanrecruiteIF6,whichpreventsthelargeribosomalsubunitfromjoiningthesmallsubunit.阻止核糖體大小亞基結(jié)合。P31Deadenylation脫腺苷化degradationA、AgocanpreventmRNAcircularization環(huán)化B、miRNAtriggersdeadenylationandsubsequentlydecapping脫蓋P33ApplicationsofRNAi?Usedinavarietyoforganisms用于各種生物?High-throughputscreens高通量篩選?ThedevelopmentofRNAiasatherapeuticstrategy治療策略?miRNAasbiomarkersanddiagnosticsmiRNA作為生物標志物和診斷P34Agenome-wideRNAiscreenforinfluenzavirus流感病毒hostcellularfactors.P35miRNAsasbiomarkers.一、C值(C-Value)：在每一種生物中其單倍體基因組的DNA總量是特異的，被稱為C值。C值悖論：物種的C值和它進化的復(fù)雜性之間沒有嚴格的對應(yīng)關(guān)系，這種現(xiàn)象稱為C值悖論。注：高等生物具有比低等生物更復(fù)雜的生命活動，所以理論上應(yīng)該是它們的C值也應(yīng)該更高。但是事實上C值沒有體現(xiàn)出與物種進化程度相關(guān)的趨勢。高等生物的C值不一定就意味著它的C值高于比它低等的生物。這種生物學(xué)上的DNA總量的比較和矛盾，稱為C值悖論。二、長鏈非編碼RNA(longnoncodingRNA,lncRNA)：lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt、不編碼蛋白的RNA。（1stidentifiedintheearly1990’s:Xist&H19）注：LncRNAXist(Xchromosomeinactivespecifictranscript)就是通過調(diào)節(jié)目的基因使CpG島發(fā)生甲基化，抑制X染色體基因的表達來介導(dǎo)X染色體失活;基因組印記是指來自親本的等位基因傳遞給子代時發(fā)生了修飾，使帶有親本印記的等位基因表達與親本不同的性狀。而H19LncRNA對維持人類11號染色體近端的IGF2受體-H19基因組印跡具有非常重要的作用lncRNA特點：lncRNA的表達受調(diào)控，呈現(xiàn)組織和細胞特異性。物種之間保守性差它們包含許多類型的轉(zhuǎn)錄本，在結(jié)構(gòu)上類似mRNA，有時也轉(zhuǎn)錄成編碼基因的反義轉(zhuǎn)錄本。相當(dāng)一部分lncRNA只位于細胞核內(nèi)。lncRNA被認為執(zhí)行了重要的調(diào)控功能，也與疾病發(fā)展息息相關(guān)lncRNA的分類AntisenselncRNA(反義長非編碼RNA)Intronictranscript(內(nèi)含子非編碼RNA)BidirectionallncRNAs（雙向lncRNA）IntergeniclncRNAs（基因間lncRNA）注：劉默芳老師課件中的分類：對lncRNA的研究方法染色質(zhì)標記：啟動子區(qū)：組蛋白H3賴氨酸4三甲基化（H3K5me3）轉(zhuǎn)錄單位：組蛋白H3賴氨酸36三甲基化（H3K36me3）CAGE-seq：加帽的RNA片段的測序轉(zhuǎn)錄物的精確開始3P-seq：多聚腺苷酸化的末端測序轉(zhuǎn)錄物的精確末端注：如何排除IncRNA編碼蛋白的潛力TranslatelncRNAsinall3frames，并對蛋白質(zhì)家族和結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫進行同源性檢索CSF：密碼子替代頻率RibosomeProfiling（源自劉默芳老師PPT）RNA分子功能鑒定：基因表達分析：High‐throughputRNAseqRNA合成動態(tài)分析：Bromouridelabel+RNAseq翻譯水平檢測：RibosomeProfilinglncRNA的作用機制Decoy(誘餌)：lncRNA可以阻止調(diào)節(jié)蛋白進入DNA，結(jié)合其它調(diào)控RNA或蛋白并屏蔽其功能eg.Gas5糖皮質(zhì)激素受體（GR）的DNA結(jié)構(gòu)域與糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件（GRE）相結(jié)合代謝轉(zhuǎn)錄基因饑餓條件下Gas5被誘導(dǎo)，Gas5結(jié)構(gòu)類似于GR的DNA結(jié)合位點，即Gas5-GRinteractionsGR-GREinteractionsScaffold（支架）：lncRNA可以作為銜接子使兩種或多種蛋白質(zhì)空間上更接近，作為相關(guān)分子元件組裝的平臺eg.HOTAIR（HOXtranscriptantisenseintergenicRNA）2148-nt，能形式獨立的結(jié)構(gòu)域。其5'結(jié)構(gòu)域結(jié)合PRC2復(fù)合物，其3'結(jié)構(gòu)域結(jié)合LSD1-CoREST復(fù)合物，協(xié)調(diào)H3K27甲基化和H3K4me2去甲基化，導(dǎo)致基因沉默Guide（向?qū)В簂ncRNA可以指導(dǎo)DNA招募蛋白質(zhì)，即指導(dǎo)核糖核蛋白復(fù)合物定位eg.Xist（X-inactivespecifictranscript）：在人中為17kbX染色體失活過程的主要原因有兩個功能：定位到DNA和沉默基因表達lncRNA的功能X染色體失活，基因組印記及染色質(zhì)修飾，轉(zhuǎn)錄激活/沉默，核內(nèi)運輸?shù)热?、核酶ribozyme：主要指一類具有催化功能的RNA，亦稱RNA催化劑1.核酶的歷史：核酶的發(fā)現(xiàn)從根本上改變了以往只有蛋白質(zhì)才具有催化功能的概念，為此Cech和Altman獲得了1989年的諾貝爾獎。T.Cech的重要發(fā)現(xiàn)開始于1981年。研究目的：細胞中DNA轉(zhuǎn)錄成rRNA后，rRNA中一些“內(nèi)含子”（intron），如何從RNA分子中剪切下來的。根據(jù)過去傳統(tǒng)的概念，這一過程必須要有蛋白質(zhì)酶來完成。研究對象：原生動物四膜蟲，其含有一種RNA，組成中除了核糖體RNA外還有一個由413個核苷酸組成的插入序列（interveningsequenc，IVS）。研究發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物rRNA前體很不穩(wěn)定，在鳥苷和Mg2+存在下切除自身的413個核苷酸的內(nèi)含子（IVS），使兩個外顯子拼接起來，變成成熟的rRNA分子。催化反應(yīng)是在沒有任何蛋白質(zhì)酶的存在下發(fā)生的，稱為自我剪接。首次發(fā)現(xiàn)rRNA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的I型內(nèi)含子剪切和外顯子拼接過程可在無任何蛋白質(zhì)存在的情況下發(fā)生，證明了RNA具有催化功能。為區(qū)別于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)催化劑，Cech給這種具有催化活性的RNA定名為核酶。1983年Altman等人在研究細菌RNaseP時發(fā)現(xiàn)研究目的：t-RNA分子的剪接過程。核糖核酸酶P是一種核糖核蛋白,含有一個單鏈RNA分子,長度為375個堿基，結(jié)合一個相對分子質(zhì)量為20kDa的多肽(119個氨基酸殘基)。過去都認為核酸酶P的催化作用由RNA和蛋白質(zhì)共同完成的。而該實驗證明，核酸酶P的催化作用是由RNA完成的，而其中的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)僅僅起穩(wěn)定構(gòu)象的作用。研究發(fā)現(xiàn)：在較高濃度的鎂離子和適量精氨酸參與下，核酸酶P（ribonucleaseP，RNaseP）中的RNA能夠切割tRNA前體的5端。隨著研究的深入，Cech發(fā)現(xiàn)L-19RNA在一定條件下，能以高度專一性的方式去催化寡聚核苷酸底物的切割與連接。核酶可以識別底物RNA的特定序列，并在專一性位點上進行切割，其特異性接近DNA限制性內(nèi)切酶，高于RNase，具有很大的潛在的應(yīng)用價值。2.核酶的特點?具有催化活性的RNA?可以表征酶活性?催化活性可以是分子間或分子內(nèi)（一輪）?核糖體是核酶！3.核酶的分類：剪接型核酶：指RNA分子被磷酸二酯酶水解切割后，伴隨著形成新的磷酸二酯鍵，即磷酸二酯鍵的轉(zhuǎn)移反應(yīng)或稱轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。其作用機制是通過既剪有接的方式除去內(nèi)含子I類內(nèi)含子：一類具有酶催化功能的內(nèi)含子,轉(zhuǎn)錄成RNA后可以自我剪接。此類內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄后可以形成9個由堿基配對形成的特定二級結(jié)構(gòu)，分別命名為P1至P9,P1和P7是保守的。P3，P4，P6和P7的核心區(qū)域具有催化性在剪接反應(yīng)中,要有一種鳥嘌呤核苷(含有游離的3'-OH)G-OH。G首先結(jié)合到內(nèi)含子的5'端,當(dāng)線性的內(nèi)含子成為環(huán)狀時,其3'端可以距離5'端15個核苷酸以外,從而將原來的5'端和15個堿基(或以上)的節(jié)段(包括G)切除出去。這種自我剪接,是由RNA的特定序列的核酸內(nèi)切酶的活性所催化。剪切型核酶：這類RNA進行自身催化的反應(yīng)是只切不接。特點是在Mg2+或其他二價金屬離子存在下，在特定的位點，自我剪切，產(chǎn)生5‘-OH和2’，3‘-環(huán)磷酸二酯末端。eg.RNaseP可剪切前體5‘端41nt,5’端成熟。不同tRNA的5’端沒有順序共同性，剪切的準確性與剪切部位周圍的核苷酸順序無關(guān)，表明在RNaseP的組分內(nèi)沒有引導(dǎo)序列，RNaseP所識別的是底物的高級結(jié)構(gòu)。錘頭型核酶對切割位點的識別位點遵守NUH規(guī)則（N代表任意核苷酸，H代表A,U或C）。催化過程需要二價金屬離子參與。有三個雙螺旋區(qū)，13個核苷酸殘基保守序列，剪切反應(yīng)在右上方GUX序列的3‘端自動發(fā)生四、SELEX即指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(shù)(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)。利用該技術(shù)可以從隨機單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸適體(Aptamer)。自Tuerk等首先運用此技術(shù)篩選到特異性吸附噬菌體T4DNA聚合酶和有機染料分子的特異寡核苷酸配基后，經(jīng)過十幾年的發(fā)展，SELEX技術(shù)已經(jīng)成為一種重要的研究手段和工具。1.原理：基本思想是體外化學(xué)合成一個單鏈寡核苷酸庫，用它與靶物質(zhì)混合，混合液中存在靶物質(zhì)與核酸的復(fù)合物，洗掉未與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸，分離與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，以此核酸分子為模板進行PCR擴增，進行下一輪的篩選過程。通過重復(fù)的篩選與擴增，一些與靶物質(zhì)不結(jié)合或與靶物質(zhì)有低親和力、中親和力的DNA或RNA分子被洗去，而"適配子"(Aptamer)即與靶物質(zhì)有高親和力的DNA或RNA從非常大的隨機文庫中分離出來，且純度隨SELEX過程的進行而增高，從P摩爾到n摩爾，最后占據(jù)庫的大多數(shù)(>90%左右)。注：SELEX首先根椐分子生物學(xué)技術(shù)，人工合成單鏈隨機寡核苷酸文庫。通常文庫容量為10"一10個單鏈寡核苷序列。文庫包括DNA文庫、RNA文庫、修飾化的RNA文庫。文庫的中間為隨機序列，序列長度往往在20~40bp之間。隨機序列兩端是帶有限制性內(nèi)切酶位點的固定序列，此固定序列是多聚酶鏈反應(yīng)及其他酶學(xué)反應(yīng)相關(guān)引物的結(jié)合位點。在隨機文庫中，單鏈隨機寡核苷酸分子