第四講蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)一授課用-課件

第四講蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)一第四講蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)一1第四講蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)（一）氨基酸序列分析X-射線衍射技術(shù)核磁共振質(zhì)譜技術(shù)結(jié)構(gòu)分析的其它方法現(xiàn)代光譜技術(shù)三維電鏡重構(gòu)技術(shù)動(dòng)力學(xué)全局研究技術(shù)

UV-Vis、IR、熒光、CD、激光拉曼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象；構(gòu)象變化過(guò)程；如：蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中間態(tài)形成的時(shí)間尺度和機(jī)制.二級(jí)結(jié)構(gòu)形成、卷曲過(guò)程，變性和復(fù)性過(guò)程及機(jī)制。主要內(nèi)容是結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)第四講蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)（一）氨基酸序列分析核磁共振UV2第一節(jié)蛋白質(zhì)氨基酸序列分析技術(shù)主要內(nèi)容化學(xué)法基因方法蛋白質(zhì)分子中二硫鍵和酰胺基位置的確定蛋白質(zhì)測(cè)定新技術(shù)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的意義：寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)與制備cDNA推導(dǎo)氨基酸序列提供依據(jù)重組DNA產(chǎn)生的蛋白指紋分析蛋白質(zhì)的完整結(jié)構(gòu)鑒定確定翻譯后修飾的位點(diǎn)決定簇的定位二硫鍵的確定第一節(jié)蛋白質(zhì)氨基酸序列分析技術(shù)主要內(nèi)容一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的意義：3一、蛋白質(zhì)測(cè)序的研究1947采用部分水解的方法試圖測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸序列Consden等利用色譜技術(shù)成功測(cè)定了短桿菌肽S6的氨基酸序列Sanger首次測(cè)定了牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)（由51個(gè)氨基酸殘基組成）Spackman、Stein、Moore制造了自動(dòng)化的氨基酸分析儀，使氨基酸定量分析進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段Edman推出第一臺(tái)全自動(dòng)測(cè)序儀195819551940年前1967一、蛋白質(zhì)測(cè)序的研究1947采用部分水解的方法試圖測(cè)定蛋4N-末端氨基酸的測(cè)定方法（主要5類）1、二硝基氟苯法（DNFB法、Sanger法）2、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）

DNS-氨基酸呈熒光3、異硫氰酸苯酯法（PITC法）4、DABITC法（甲氨偶氮苯基異硫氰酸苯酯），

形成的DABIH—氨基酸呈桔黃色（有顏色）5、氨肽酶法N-末端測(cè)定的方法——奠定了序列測(cè)定方法發(fā)展基礎(chǔ)N-末端氨基酸的測(cè)定方法（主要5類）5牛胰島素（51aa）的一級(jí)結(jié)構(gòu)Sanger首次(DNFB法)測(cè)定了牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)

——Sanger法（測(cè)定蛋白N末端的方法）牛胰島素（51aa）的一級(jí)結(jié)構(gòu)Sanger首次(DNFB法6二、序列測(cè)定方法——化學(xué)方法（一）N端測(cè)序法應(yīng)用最廣的N端順序測(cè)定法大多仍以Edman降解原理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)。利用化學(xué)試劑和控制反應(yīng)條件，從N端開始，將肽鏈逐步降解，進(jìn)行氨基酸序列的測(cè)定的方法。1、Edman降解法——異硫氰酸苯酯（PITC）法特點(diǎn)：可以測(cè)定氨基酸的排列順序（包括N端分析）。適用于手工操作，也可設(shè)計(jì)自動(dòng)化測(cè)定儀器（1）原理：四點(diǎn)： ①異硫氰酸苯酯(PITC)偶聯(lián)→②ATZ-氨基酸裂解→③PTH-氨基酸轉(zhuǎn)化→④PTH-氨基酸的鑒定二、序列測(cè)定方法——化學(xué)方法（一）N端測(cè)序法7

偶聯(lián)：自由α-氨基與異硫氰酸苯酯(PITC)試劑偶聯(lián)，與其緊挨的第二個(gè)殘基的鍵合力大大減弱，很容易斷裂。

裂解：在無(wú)水條件下酸（F3CCOOH）裂解，形成苯氨基噻唑啉酮衍生物（ATZ-氨基酸）和失去末端氨基酸殘基的多肽，又可與PITC進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，下一輪降解。

轉(zhuǎn)化：ATZ-氨基酸不穩(wěn)定，三氟乙酸水溶液（25%）可轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的PTH-氨基酸。

PTH-氨基酸的鑒定：可以通過(guò)薄層層析、氣相色譜、高效液相色譜及質(zhì)譜等各種手段進(jìn)行分析。乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸(PTH－氨基酸)。PITC試劑ATZ-氨基酸偶聯(lián)：自由α-氨基與異硫氰酸苯酯(PITC)試劑8單向紙層析氨基酸鑒定——PTH-氨基酸與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（PITC試劑反應(yīng)）對(duì)照單向紙層析氨基酸鑒定——PTH-氨基酸與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（PITC9雙向紙層析雙向紙層析10薄層層析（TLC）薄層層析（TLC）11高效液相色譜（HPLC）（highperformanceliquidchromatography）高效液相色譜（HPLC）12（2）氨基酸序列分析儀器以Edman法測(cè)序，手工操作繁瑣，工作量大根據(jù)Edman降解的原理——自動(dòng)化分析儀器自70年代初全自動(dòng)序列儀誕生以來(lái)，經(jīng)過(guò)了一系列更新?lián)Q代，儀器日趨靈敏、快速。靈敏度達(dá)0.1pmol蛋白3種代表性的測(cè)序儀器簡(jiǎn)單介紹如下：（2）氨基酸序列分析儀器13①液相旋轉(zhuǎn)杯序列儀最初的自動(dòng)化儀器，對(duì)自動(dòng)化測(cè)序意義很大。測(cè)定程序：整個(gè)儀器的“核心”部分是一個(gè)反應(yīng)杯，它由一個(gè)馬達(dá)帶動(dòng)并有調(diào)速控制。蛋白質(zhì)或多肽樣品經(jīng)導(dǎo)管注入反應(yīng)杯，通過(guò)旋轉(zhuǎn)離心力被均勻地涂在杯壁上，形成一層薄膜，其厚薄可由轉(zhuǎn)速控制。反應(yīng)試劑和溶劑分別通過(guò)導(dǎo)管進(jìn)入反應(yīng)杯，與杯內(nèi)薄層上的樣品的N端自由氨基進(jìn)行Edman反應(yīng)；降解下來(lái)的ATZ—氨基酸衍生物通過(guò)另一導(dǎo)管引出并收集；再將ATZ氨基酸→PTH氨基酸→鑒定；洗滌反應(yīng)杯，依次循環(huán)分析。特點(diǎn)：該儀器樣品流失較大，樣品消耗量大，目前已很少使用。①液相旋轉(zhuǎn)杯序列儀14②固相序列分析儀發(fā)展的動(dòng)力和原因： 克服液相旋轉(zhuǎn)杯分析儀的缺點(diǎn)。多肽不易吸附旋轉(zhuǎn)杯上，樣品流失較大；原理：蛋白質(zhì)C端羧基共價(jià)固定在惰性載體上，進(jìn)行Edman降解。特點(diǎn)：樣品與載體共價(jià)結(jié)合，洗滌和抽提等過(guò)程不會(huì)丟失樣品，增加循環(huán)次數(shù)。缺點(diǎn)：（1）若多肽中其它殘基的羧基與載體結(jié)合，影響測(cè)定。如：酸性氨基酸殘基（Asp、Glu）（2）測(cè)定效率低②固相序列分析儀153-氨基丙基玻璃N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基玻璃惰性載體成功的關(guān)鍵是肽段的固定，目前采用C端α-羧基固定法，重復(fù)法高，高絲氨酸內(nèi)酯法及雙異硫氰酯法(DITC)最好，固定率可達(dá)90-95%。3-氨基丙基玻璃N-(2-氨基乙基)-惰性載體成功的關(guān)鍵是肽16③氣相蛋白序列分析儀彈筒型玻璃反應(yīng)室反應(yīng)室容積0.05ml，代替液相序列儀中的旋轉(zhuǎn)玻璃杯，用一種惰性聚合物“polybrene”固定樣品。多肽鏈與氣態(tài)試劑反應(yīng)，完成Edamn降解。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，耗費(fèi)樣品量少，通常僅需10~100pmol；試劑和溶劑消耗少，大約是液相序列儀的1／10，降低了費(fèi)用；縮短了每步降解循環(huán)時(shí)間，提高了分析效率。趨勢(shì)：靈敏度不斷提高③氣相蛋白序列分析儀17氣相蛋白序列分析儀氣相蛋白序列分析儀18（3）Edman方法改進(jìn)DABITC法：1976年，（華裔科學(xué)家）張瑞耀提出試劑：甲氨偶氮苯基異硫氰酸苯酯替代了異硫氰酸苯酯（PITC）DABITC：4-N,N-對(duì)甲氨基偶氮苯-4’-異硫氰酸酯原理：與PITC相似，形成有色產(chǎn)物DABIH—氨基酸，呈桔黃色也稱為有色的Edman降解法，氨基酸鑒定無(wú)需染色，肉眼可分辨特點(diǎn)：靈敏度很高，分析小肽段只要幾個(gè)nanomole樣品即可。但DABITC試劑與多肽N端aa耦合率低（20%-30%），測(cè)序干擾大！如何解決？DABITC—PITC兩種方法耦合，更加靈敏可靠。適用于：液相還是固相，手工還是自動(dòng)方法，效果良好。異硫氰酸酯進(jìn)行35S標(biāo)記：使分析樣品更向微量化方向發(fā)展。（3）Edman方法改進(jìn)19二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）熒光劑—DNS-Cl，與肽鏈N端氨基反應(yīng)生成DNS-肽經(jīng)酸水解，N-末端殘基形成DNS-氨基酸，檢測(cè)靈敏度提高310倍。乙酸乙酯抽提，層析鑒定，DNS-氨基酸于360nm或280nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，根據(jù)熒光點(diǎn)位置確定N端氨基酸。6MHCl，110℃水解過(guò)夜DNS-脯氨酸70%被破壞。Gln→Glu，Asn→AspTrp及其DNS衍生物完全被破壞(可用巰基乙烷磺酸真空下水解)特點(diǎn)：不能連續(xù)降解，適用于N末端分析（n-1）肽熒光？二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）6MHCl，1120DNS—Edman測(cè)定法兩種方法的結(jié)合DNS法，靈敏的高，但不能連續(xù)進(jìn)行Edman降解法N肽DNS-ClN末端氨基酸測(cè)定Edman降解除去N末端氨基酸水層（n-1）肽乙酸乙酯層（N末端氨基酸衍生物）DNS-ClN末端氨基酸測(cè)定Edman降解除去N末端氨基酸DNS—Edman測(cè)定流程示意圖DNS—Edman測(cè)定法N肽DNS-ClN末端氨基酸測(cè)定E21思考？為何要?jiǎng)?chuàng)新很多方法？什么樣的方法能延續(xù)下去？思考？22（4）氨基酸自動(dòng)序列儀的使用方法依據(jù)Ednan原理，氨基酸自動(dòng)測(cè)序儀，序列分析加快測(cè)序儀發(fā)展方向：微量化、自動(dòng)化加樣量達(dá)到微量：10-9—10-12mol水平推出從進(jìn)樣到色譜分析一體化分析儀舉例：Shimadzu（島津）公司PPSQ-21A氨基酸自動(dòng)測(cè)序儀工作原理：Ednan降解，產(chǎn)物乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸），柱前衍生的液相色譜（HPLC）分析。（4）氨基酸自動(dòng)序列儀的使用方法23工作流程固定樣品固定將蛋白固定在高聚纖維素上，在放在能固定蛋白的聚偏氟乙烯（PDVF）膜上，進(jìn)行Edman降解。反應(yīng)器耦合以N-甲基哌啶水/甲醇（TMA）氣霧環(huán)境讓蛋白末端氨基酸與PITC反應(yīng)，生產(chǎn)PTC-肽反應(yīng)器終止反應(yīng)用乙酸清洗出去多余的試劑和副產(chǎn)物反應(yīng)器裂解無(wú)水TFA溶液，將PTC-肽裂解為ATZ-氨基酸和（n-1）肽，排出并洗滌轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換反應(yīng)采用25%TFA溶液將ATZ-AA轉(zhuǎn)化為PTH-AA轉(zhuǎn)換器提取在轉(zhuǎn)換器提取游離的PTH-氨基酸樣品進(jìn)樣進(jìn)樣用乙腈溶液溶解PTH-氨基酸，并進(jìn)樣到HPLCHPLC分析分離鑒定反向HPLC分離PTH-氨基酸，并檢測(cè)數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)分析顯示和處理數(shù)據(jù)，確定PTH-氨基酸，并進(jìn)行定量和回收率計(jì)算工作流程固定樣品固定將蛋白固定在高聚纖維素上，在放在能固定蛋24（5）影響N端Edman反應(yīng)裂解率的因素在測(cè)序中，即使N端很均一的蛋白質(zhì)(第一個(gè)循環(huán)出現(xiàn)單個(gè)氨基酸殘基)，經(jīng)過(guò)十幾個(gè)循環(huán)后背景明顯不及第一個(gè)殘基清晰。原因：Edman反應(yīng)是一個(gè)化學(xué)過(guò)程，在其偶聯(lián)、裂解、轉(zhuǎn)化等步驟都有可能發(fā)生一些副反應(yīng)，從而影響最終裂解效率。三氟乙酸除了裂解作用外，可與Ser和Thr上的-OH反應(yīng)，繼而部分封閉Ser和Thr的N端α-氨基，導(dǎo)致Ser和Thr時(shí)產(chǎn)率突然降低。Ser和Thr的PTH-衍生物部分轉(zhuǎn)化成其他產(chǎn)物，造成產(chǎn)率降低。偶聯(lián)試劑PITC本身也將發(fā)生副反應(yīng)，形成一些“雜質(zhì)”。（5）影響N端Edman反應(yīng)裂解率的因素25（6）N端測(cè)序前樣品處理純度鑒定（97%）脫鹽疏基修飾去除N端封閉的基團(tuán)（酸水解，酶處理）（6）N端測(cè)序前樣品處理26（二）C端測(cè)序法雖然自動(dòng)化N端測(cè)序技術(shù)日趨成熟，但仍有不少問(wèn)題需借助C端序列分析來(lái)解決（？）C端測(cè)序優(yōu)勢(shì)：尤其適合于基因重組蛋白是否正確表達(dá)的鑒定（Why？）大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)的質(zhì)量控制、N端封閉蛋白的分析DNA探針或引物的設(shè)計(jì)。（不做詳細(xì)講述，感興趣者自己閱讀學(xué)習(xí)）（二）C端測(cè)序法271、原理（C端分析）基于與N端Edman降解類似的原理，采用化學(xué)試劑與蛋白質(zhì)和多肽的α-COOH反應(yīng)，反應(yīng)后的C末端衍生物被切割下來(lái)，通過(guò)HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分離分析。已有自動(dòng)化的C端序列分析儀1、原理（C端分析）28(1)活化C端的自由羧基與乙酸酐反應(yīng)生成混合酸酐，混合酸酐再環(huán)化成聚噁唑酮，在四丁基銨硫氰酸鹽的作用下，轉(zhuǎn)化為乙內(nèi)酰硫脲(TH)。而側(cè)鏈上的羧基形成的混合酸酐則難以成環(huán)。2、C端序列分析程序六個(gè)步驟、羧基活化→側(cè)鏈羧基保護(hù)→烷基化TH–肽→側(cè)鏈羥基保護(hù)→斷裂形成ATH-AA→AA分析(1)活化2、C端序列分析程序六個(gè)步驟、29(2)側(cè)鏈羧基的酰胺化保護(hù)

側(cè)鏈羧基形成混合酸酐，與哌叮硫氰酸鹽（piperidinethiocyanate）進(jìn)一步作用形成酰胺，以保護(hù)側(cè)鏈羧基。(2)側(cè)鏈羧基的酰胺化保護(hù)30(3)烷基化C末端環(huán)化成的乙內(nèi)酰硫脲（TH）衍生物較為穩(wěn)定而不易被切割，產(chǎn)率不高。選擇性地烷基化修飾硫原子，形成烷基化-TH(ATH)衍生物，裂解產(chǎn)率將大大提高。(3)烷基化31(4)修飾側(cè)鏈羥基（保護(hù)）Thr和Ser殘基的側(cè)鏈上具有羥基羥基不穩(wěn)定，會(huì)干擾測(cè)序，需要修飾。乙酸酐將羥基乙?；?，但反應(yīng)不完全。N-甲基咪唑（NMI）和乙酸酐共同作用，將Thr和Ser的羥基乙?；?。(4)修飾側(cè)鏈羥基（保護(hù)）32(5)裂解和衍生C末端ATH衍生物在酸性條件下與硫氰酸鹽反應(yīng)而被裂解生成ATH-氨基酸。新的C末端自動(dòng)環(huán)化形成乙內(nèi)酰硫脲（TH），而不必重新活化。整個(gè)測(cè)序過(guò)程只需在開始時(shí)對(duì)C端進(jìn)行一次性活化，并修飾Asp和Glu側(cè)鏈羧基，以及Thr和Ser的羥基。(6)ATH-AA分析（常規(guī)分析）小結(jié)——C末端測(cè)序程序羧基活化→側(cè)鏈羧基保護(hù)→烷基化TH–肽→側(cè)鏈羥基保護(hù)→斷裂形成ATH-AA→AA分析測(cè)定C端第一個(gè)和第二個(gè)氨基酸工藝的區(qū)別(5)裂解和衍生小結(jié)——C末端測(cè)序程序333、C末端蛋白質(zhì)序列儀可由N端序列儀改裝而成，不同之處主要在于:(1)

反應(yīng)所用的試劑不同，兩者不兼容，否則易堵塞管道。C端序列儀：所有的化學(xué)反應(yīng)均在彈筒型反應(yīng)室中進(jìn)行，切割下來(lái)的ATH-AA僅在轉(zhuǎn)化腔內(nèi)干燥和溶解后即可進(jìn)入HPLC系統(tǒng)分離分析。N端測(cè)序儀：ATZ-AA需在轉(zhuǎn)化腔中轉(zhuǎn)化為PTH-AA。3、C末端蛋白質(zhì)序列儀344、C端測(cè)序樣品前處理純度鑒定脫鹽疏基修飾ε-氨基的衍生4、C端測(cè)序樣品前處理355、影響C端測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)率的因素不同的氨基酸的反應(yīng)產(chǎn)率不同，圖譜分析比N端測(cè)序復(fù)雜。C端測(cè)序副反應(yīng)較多，最高起始產(chǎn)率僅為20%，GluAspSerThr等殘基的產(chǎn)率更低。若C端富含這幾種殘基，測(cè)序十分困難。Pro殘基終止測(cè)序過(guò)程Pro殘基有吡咯環(huán)，其羧基與乙酸酐反應(yīng)不能成環(huán)。一旦遇到Pro，整個(gè)測(cè)序過(guò)程將終止。到目前為止，C端序列可測(cè)l~10個(gè)殘基，平均3~5個(gè)，一次測(cè)序需要的量比N端測(cè)序要大得多，至少需1nmol。作為N端測(cè)序的補(bǔ)充。5、影響C端測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)率的因素36（三）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定步驟蛋白質(zhì)水解——多個(gè)短肽測(cè)定——每個(gè)短肽的序列序列拼接——蛋白質(zhì)序列二硫鍵和酰胺位置的確定（三）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定步驟蛋白質(zhì)水解——多個(gè)短肽371、酶解和分離長(zhǎng)肽鏈降解成短肽以利于多肽的序列測(cè)定長(zhǎng)肽鏈降解成短肽與氨基酸測(cè)序結(jié)合進(jìn)行序列分析長(zhǎng)肽鏈降解成短肽以利于測(cè)定肽譜常用酶及降解位點(diǎn)胰蛋白酶Lys、Arg等堿性aa羧基端，不切-Arg-Pro-、-Lys-Pro-胰凝乳蛋白酶芳香aa羧基端胃蛋白酶Phe、Trp、Leu、Ala等aa羧基端梭菌蛋白酶Arg等堿性aa羧基端V8蛋白酶Asp、Glu等酸性aa羧基端Lys內(nèi)肽酶Lys羧基端優(yōu)點(diǎn)：專一性強(qiáng)、條件溫和、副反應(yīng)少、水解率高短肽分離：采用HPLC方法——蛋白質(zhì)分離純化章節(jié)詳細(xì)介紹方法和原理1、酶解和分離長(zhǎng)肽鏈降解成短肽以利于多肽的序列測(cè)定短肽分離：38測(cè)序不能太長(zhǎng)，常常需要酶切測(cè)序，肽鏈拼接。（拼圖游戲）根據(jù)肽鏈測(cè)序結(jié)果若一條簡(jiǎn)單肽鏈：僅有1～2個(gè)斷裂點(diǎn)，根據(jù)N和C末端氨基酸，很容易確定其一級(jí)結(jié)構(gòu)。若為復(fù)雜的肽鏈：不能只靠一套肽鏈斷裂方法，需要兩套甚至更多的斷裂方法分別測(cè)序，通過(guò)查找疊肽的方法，分析確定完整的氨基酸序列。舉例說(shuō)明：（拼圖）2、肽鏈拼接——重疊肽法測(cè)序不能太長(zhǎng)，常常需要酶切測(cè)序，肽鏈拼接。（拼圖游戲）2、肽39一條15個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，其N末端為His，C末端為Glu。采用兩套斷裂方法分別測(cè)序：第一套將肽段斷裂成5個(gè)小片段，其序列分別為L(zhǎng)ys-Trp-Glu，Cys-Glu，Asp-Lys-Va-Asp，Leu-Pro-Ala和（1）His-Lys-Ile-Tyr。第二套肽段斷裂為Glu-Asp-Lys，（4）Ile-Tyr-Lys-Trp，Val-Asp-Leu-Pro，（2）Ala-Cys-Glu和（3）His-Lys。通過(guò)N、C末端及重疊肽最后可定編為：

His-Lys-Ile-Tyr-Lys-Trp-Glu-Asp-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Ala-Cys-Glu一條15個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，其N末端為His，C末端為G403、二硫鍵和酰胺基位置的確定（1）為何要確定？Cys如何存在，是否形成二硫鍵Gln和Asn在測(cè)序過(guò)程中水解形成Glu和Asp（2）二硫鍵位置的確定方法（對(duì)角線電泳、測(cè)序法）用碘代乙酰胺保護(hù)蛋白樣品中未參與二硫鍵的巰基；（胃蛋白酶）水解，水解肽段進(jìn)行對(duì)角線法電泳分離。點(diǎn)在方形濾紙中心點(diǎn)上，進(jìn)行第一相電泳分離(pH6.5)。將濾紙用過(guò)甲酸蒸汽熏蒸，二硫鍵氧化成半胱氨磺酸。（酶切片段若含有二硫鍵，即分成2個(gè)小肽）第二向電泳，含半胱氨磺酸的肽比原來(lái)小，且?guī)Я烁嗟呢?fù)電荷，偏離了對(duì)角線，其余肽均對(duì)角線位置上。（Why？）染色后，剪下偏離對(duì)角線的肽斑，分析其氨基酸順序，與已確定的氨基酸順序比較，即可確定二硫鍵的位置。3、二硫鍵和酰胺基位置的確定41（3）酰胺基位置的確定方法：肽鏈酶解片段定量NH4＋推測(cè)法肽鏈中酰胺基以Asn或Gln形式存在。酰胺基水解可釋放NH4＋，測(cè)定NH4＋量推測(cè)酰胺基的含量。蛋白水解酶水解分離，可以得到含有酰胺基的肽段。測(cè)定其酰胺基數(shù)和推測(cè)可能形成酰胺基的數(shù)量，如果二者數(shù)量相等，就可以確定酰胺基位置。若不符，應(yīng)將肽鏈裂解為更小片段，再測(cè)酰胺基含量和可能存在的位置數(shù)目，直到兩者相符為止。（3）酰胺基位置的確定42三、序列測(cè)定其它方法——基因序列分析法（1）原理：翻譯密碼子（2）步驟：蛋白質(zhì)N末端和C末端氨基酸分析特異性引物設(shè)計(jì)總mRNA提?。ㄌ囟ǖ鞍踪|(zhì)）：分離法：免疫法——結(jié)合蛋白與mRNA分子雜交?？寺RNA：測(cè)定蛋白質(zhì)N端10—15殘基序列，設(shè)計(jì)兼并引物。cDNA序列分析：RT-PCR，測(cè)定cDNA序列（？方法）例如：熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷末端終止法（？？？）全自動(dòng)系列分析儀，1000bp/反應(yīng)，簡(jiǎn)單快速，成本低廉根據(jù)密碼規(guī)則讀取蛋白質(zhì)序列。三、序列測(cè)定其它方法——基因序列分析法（1）原理：翻譯密碼子43四、蛋白質(zhì)測(cè)定新技術(shù)（分離純化部分再介紹）1、高效液相色譜（HPLC）用于蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸的分析色譜填充料：大孔徑烷基化硅膠吸附劑（C18）普通孔徑：5—10um進(jìn)一步提高分析速度和靈敏度 大孔徑：3×10-5mm（大肽） 小孔徑：1×10-5mm（小肽）四、蛋白質(zhì)測(cè)定新技術(shù)（分離純化部分再介紹）44（1）微柱高效液相色譜（microcolum-HPLC）柱直徑<2.1mm(普通4.6mm)，Ishii首次提出是低分子量蛋白或肽的基礎(chǔ)樣品用量少，速度快，靈敏度高（1pmol），峰形尖窄，回收率高，非特異性吸附少。是目前肽譜分析最靈敏最先進(jìn)的技術(shù)之一應(yīng)用于肽譜和基因工程產(chǎn)物的分析（1）微柱高效液相色譜（microcolum-HPLC）45（2）無(wú)孔色譜短柱填充直徑無(wú)孔硅膠，達(dá)到快速分離。特點(diǎn)：顯著改善分析靈敏度縮短分析時(shí)間（幾分鐘完成）減少生物分子的非專一性吸附（回收率100%）降低洗脫體積（幾個(gè)微升—1mL）可耐受較高壓力（30MPa）（2）無(wú)孔色譜短柱46（3）毛細(xì)管液相色譜1995年Yamada建立柱內(nèi)徑：250um—500um，填充物直徑3-5um，孔徑3×10-5mm，2.5ml注射泵，流速僅3—5uL/min，上樣量5—25ul，檢測(cè)器：紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器毛細(xì)管流出樣品直接點(diǎn)樣到聚偏氟乙烯膜（PVDF）上，樣品用刀片割1—2mm條帶，用于蛋白質(zhì)序列分析。靈敏度很高（3）毛細(xì)管液相色譜472、毛細(xì)管電泳（CE）20世紀(jì)90年代微量分析技術(shù)材料：熔融石英玻璃，內(nèi)徑?。?lt;100um）上樣量極少（<10uL）,靈敏度高，比HPLC高2個(gè)數(shù)量級(jí)（10-15mol）分類：毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）；荷質(zhì)比等電聚焦電泳（CIEF）；等電點(diǎn)微團(tuán)電動(dòng)毛細(xì)管電泳（MECC）；疏水或離子交換毛細(xì)管篩分電泳（CSE）；分子大小和電荷毛細(xì)管柔和免疫電泳（IACE）：與抗體結(jié)合專一性2、毛細(xì)管電泳（CE）48本節(jié)小結(jié)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定化學(xué)法測(cè)定原理及方法重點(diǎn)N端降解的原理、方法和影響因素，特別是Edman降解及其方法改進(jìn)。三種序列分析儀（旋轉(zhuǎn)杯、固相、氣相）簡(jiǎn)單介紹了C端降解法的原理、方法和儀器，化學(xué)法測(cè)定蛋白質(zhì)序列測(cè)定的步驟酶解、分離純化、肽段序列測(cè)定、序列拼接、二硫鍵和酰胺基位置的確定簡(jiǎn)述基因序列分析原理和方法HPLC和毛細(xì)管電泳等蛋白質(zhì)測(cè)定新技術(shù)（略）本節(jié)小結(jié)49第二節(jié)：X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析本節(jié)主要內(nèi)容研究進(jìn)展基本概念基本原理特點(diǎn)X射線衍射技術(shù)：精確測(cè)定原子在晶體中的空間位置的一整套測(cè)量及分析技術(shù)，是迄今研究生物大分子結(jié)構(gòu)的主要技術(shù)。第二節(jié)：X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析本節(jié)主要內(nèi)容X射線衍射技術(shù)：501.研究進(jìn)展背景1895年，倫琴發(fā)現(xiàn)X射線1913年布拉格父子用X射線衍射法對(duì)氯化鈉、氯化鉀晶體進(jìn)行了測(cè)定 1915年布拉格父子因此獲諾貝爾物理獎(jiǎng)，建立了晶體學(xué)1934年第一張蛋白質(zhì)-胃蛋白酶單晶體1957年-1959年相繼8種蛋白質(zhì)獲得了高分辨率結(jié)果1960年以后從單純的結(jié)構(gòu)學(xué)邁入結(jié)構(gòu)-功能研究。1990年以后突飛猛進(jìn)，15個(gè)結(jié)構(gòu)/天2003年，PDB收錄的84.8%蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來(lái)自X-射線衍射1.研究進(jìn)展背景51我國(guó)的標(biāo)志性成果1 中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所和植物研究所“菠菜捕光復(fù)合物L(fēng)HC-II晶體結(jié)構(gòu)（2.72A）2004年，世界上權(quán)威性的著名雜志《Nature》該晶體的結(jié)構(gòu)彩圖被選作該期雜志的“封面照片”。世界上率先完成了這一具有高度挑戰(zhàn)性的國(guó)際前沿課題。推動(dòng)了中國(guó)“光合作用機(jī)理與膜蛋白三維結(jié)構(gòu)”研究進(jìn)入國(guó)際領(lǐng)先水平。意義：基于精確的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)對(duì)高等植物的光能吸收、傳遞和光保護(hù)等光合作用機(jī)理研究的熱點(diǎn)問(wèn)題進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)了膜蛋白結(jié)晶的第3種類型，TYPE-III膜蛋白晶體，并建立了包括膜蛋白、色素分子和脂分子在內(nèi)的蛋白脂質(zhì)體的完整的結(jié)構(gòu)模型，提供了近3萬(wàn)個(gè)獨(dú)立的精確的原子坐標(biāo)?？锿⒃圃菏课覈?guó)的標(biāo)志性成果1 中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所和植物研究所匡廷522005年7月1日，清華大學(xué)+生物物理所解析了“線粒體膜蛋白復(fù)合物II”的精細(xì)結(jié)構(gòu)意義：填補(bǔ)了線粒體結(jié)構(gòu)生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的空白，稱為線粒體呼吸鏈研究領(lǐng)域的一個(gè)新的里程碑。為線粒體疾病研究提供了真實(shí)可靠的模型我國(guó)的標(biāo)志性成果22005年7月1日，清華大學(xué)+生物物理所我國(guó)的標(biāo)志性成果253晶體：離子、原子或分子等粒子在三維空間上重復(fù)排列形成的有規(guī)律的高度有序結(jié)構(gòu)。點(diǎn)陣：晶體的幾何圖形。晶體中的粒子，在空間上按一定的重復(fù)規(guī)律排列而成的幾何圖形。晶格：晶胞—是構(gòu)成晶體的基本單元。按確定的單位劃分成空間格子，在晶體中稱晶格。NaCl晶體2.晶體的基本概念晶體：離子、原子或分子等粒子在三維空間上重復(fù)排列形成54批量結(jié)晶法batchcrystallization質(zhì)譜：ug級(jí)樣品，一級(jí)結(jié)構(gòu)的分子量、氨基酸排序、二硫鍵數(shù)目和位置；X-射線源：強(qiáng)度高，時(shí)間短（同步輻射）梭菌蛋白酶Arg等堿性aa羧基端1957年-1959年相繼8種蛋白質(zhì)獲得了高分辨率結(jié)果1895年，倫琴發(fā)現(xiàn)X射線晶體中的粒子，在空間上按一定的重復(fù)規(guī)律排列而成的幾何圖形。是低分子量蛋白或肽的基礎(chǔ)DABITC—PITC兩種方法耦合，更加靈敏可靠。直接獲得分子的形貌信息；(2)側(cè)鏈羧基的酰胺化保護(hù)結(jié)構(gòu)模型建立：反復(fù)修正原子坐標(biāo)、改善位相全自動(dòng)系列分析儀，1000bp/反應(yīng)，簡(jiǎn)單快速，成本低廉NMR結(jié)構(gòu)測(cè)定基本程序膜蛋白或多結(jié)構(gòu)域蛋白需要幾百次實(shí)驗(yàn)，才能獲得好的模型5、影響C端測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)率的因素是迄今研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最有效的方法Consden等利用色譜技術(shù)成功測(cè)定了2dsinα=kλ(k=1,2,3……，α：掠射角)2dcosβ=kλ(k=1,2,3……，β：入射角)布拉格X射線衍射原理布拉格衍射布拉格公式

批量結(jié)晶法batchcrystallization2d553.晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定程序（1）樣品制備：

要求純度達(dá)95%以上 濃度通常在10mg/ml—50mg/ml以上（2）結(jié)晶和晶體生長(zhǎng)（掌握） 原理、結(jié)晶（晶體生長(zhǎng)、影響因素）及鑒定（3）衍射及數(shù)據(jù)的收集和處理：（4）位相確定：（5）模型的建立和修正：3.晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定程序（1）樣品制備：56晶體中的粒子，在空間上按一定的重復(fù)規(guī)律排列而成的幾何圖形。CD(circulardichroism)：稀溶液中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的一種簡(jiǎn)單快速又較準(zhǔn)確的方法,是利用不對(duì)稱分子對(duì)左右圓偏振光系吸光率的不同來(lái)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。自70年代初全自動(dòng)序列儀誕生以來(lái)，經(jīng)過(guò)了一系列更新?lián)Q代，儀器日趨靈敏、快速。3、異硫氰酸苯酯法（PITC法）DNA探針或引物的設(shè)計(jì)。一條15個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，其N末端為His，C末端為Glu。2dsinα=kλ(k=1,2,3……，α：掠射角)7動(dòng)力學(xué)全精研究技術(shù)（dynamicsensembleferinementDER）三種序列分析儀（旋轉(zhuǎn)杯、固相、氣相）即可進(jìn)入HPLC系統(tǒng)分離分析。1934年第一張蛋白質(zhì)-胃蛋白酶單晶體只能關(guān)注較小分子的結(jié)構(gòu)（不做詳細(xì)講述，感興趣者自己閱讀學(xué)習(xí)）已有自動(dòng)化的C端序列分析儀熒光劑—DNS-Cl，與肽鏈N端氨基反應(yīng)生成DNS-肽結(jié)晶原理：在飽和溶液中，蛋白質(zhì)分子間以規(guī)則方式慢慢堆積形成高度有序的結(jié)構(gòu)。晶體生長(zhǎng)：首先形成晶核。晶核形成的影響因素有：化學(xué)：pH、沉淀劑種類、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)濃度等；物理：溶液達(dá)成過(guò)飽和狀態(tài)的速率、溫度、重力、壓力、震動(dòng)、時(shí)間、電場(chǎng)磁場(chǎng)、介質(zhì)、粘度、均相和非均相等。生化因素：純度、配合體、抑制劑、聚合態(tài)、等電點(diǎn)等。結(jié)晶方法：批量結(jié)晶法batchcrystallization透析法：crystallizationbydialysis液相擴(kuò)散法：liquiddiffusion氣相擴(kuò)散法（VaporDiffusionMethod）。多孔材料吸附蛋白而讓其生長(zhǎng)：bioglass鈣+磷酸+硅晶體的鑒定硬度、穩(wěn)定性、染色、蛋白質(zhì)電泳、偏振光、密度差法、沉降性能等。（2）結(jié)晶晶體中的粒子，在空間上按一定的重復(fù)規(guī)律排列而成的幾何圖形。57蛋白質(zhì)的晶體蛋白質(zhì)的晶體58四園衍射儀基本構(gòu)造（3-1）四園衍射儀（全方位測(cè)定晶體）（3）衍射及數(shù)據(jù)的收集和處理四園衍射儀基本構(gòu)造（3-1）四園衍射儀（全方位測(cè)定晶體）（359（3-2）衍射舉例——溶菌酶蛋白X線衍射圖X線衍射——探視物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的一雙“銳眼”！當(dāng)一束強(qiáng)光穿過(guò)溶菌酶蛋白質(zhì)晶體，顯示器上出現(xiàn)了一幅精細(xì)的晶體衍射圖像中國(guó)科學(xué)院“上海光源”獲得了第一幅生物大分子晶體衍射圖像！文獻(xiàn)來(lái)源：文匯報(bào)-4-10記者許琦敏（3-2）衍射舉例——溶菌酶蛋白X線衍射圖X線衍射——60富蘭克林和她的DNAX光衍射結(jié)果富蘭克林和她的DNAX光衍射結(jié)果61（3-3）衍射及其數(shù)據(jù)的收集和處理衍射和數(shù)據(jù)收集中等大小晶胞的一套高分辨率數(shù)據(jù)，至少收集幾萬(wàn)個(gè)衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù)，X-射線源：強(qiáng)度高，時(shí)間短（同步輻射）溫度：低溫液氮數(shù)據(jù)收集：現(xiàn)獲現(xiàn)測(cè)，與衍射同時(shí)進(jìn)行，數(shù)據(jù)處理經(jīng)過(guò)專門的數(shù)據(jù)處理，給出一套數(shù)據(jù)的各種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，才能判斷數(shù)據(jù)質(zhì)量的好壞。

需要篩選多個(gè)晶體，選擇最合適的衍射質(zhì)量和取向的樣品突變蛋白等需要很少的實(shí)驗(yàn)就可以測(cè)定結(jié)構(gòu)

膜蛋白或多結(jié)構(gòu)域蛋白需要幾百次實(shí)驗(yàn)，才能獲得好的模型發(fā)展方向：

自動(dòng)化操作，軟件的開發(fā)（3-3）衍射及其數(shù)據(jù)的收集和處理62(3-4)位相確定：解決衍射點(diǎn)的位相問(wèn)題——關(guān)鍵環(huán)節(jié)分子置換法（MR）多對(duì)同晶型置換法多波長(zhǎng)反常散射法（MAD）(3-5)模型建立和修正獲得電子密度圖：依據(jù)衍射線的振幅和位相，依據(jù)公式計(jì)算電子密度圖，包含了結(jié)構(gòu)的全部信息電子密度圖解析：結(jié)構(gòu)模型顯示系統(tǒng)和相關(guān)軟件結(jié)構(gòu)模型建立：反復(fù)修正原子坐標(biāo)、改善位相模型的修正：軟件處理，獲得結(jié)構(gòu)模型和結(jié)構(gòu)參數(shù)。(3-4)位相確定：解決衍射點(diǎn)的位相問(wèn)題——關(guān)鍵環(huán)節(jié)63是迄今研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最有效的方法優(yōu)點(diǎn)：不損傷樣品：水溶性蛋白、膜蛋白、大分子組裝體與復(fù)合體分辨率高，：能達(dá)到的精度是其它任何方法所不能比擬的。無(wú)污染、快捷能得到有關(guān)晶體完整性的大量信息蛋白質(zhì)分子大?。?0nm分子中原子的距離：0.1nm=1AX-射線的波長(zhǎng)：0.5A-1.5A

缺點(diǎn)：蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)要求高蛋白質(zhì)晶體難以培養(yǎng)，晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)。很難捕捉到分子的動(dòng)態(tài)信息4.優(yōu)缺點(diǎn)是迄今研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最有效的方法4.優(yōu)缺點(diǎn)64本節(jié)小結(jié)晶體及衍射的基本概念蛋白質(zhì)晶體X衍射基本程序X衍射分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的優(yōu)缺點(diǎn)本節(jié)小結(jié)65蛋白質(zhì)N端測(cè)序儀器基于的化學(xué)原理是什么，簡(jiǎn)述之。代表儀器有哪些？它們有什么進(jìn)步？N-末端氨基酸的測(cè)定方法有哪些，簡(jiǎn)述之。蛋白質(zhì)Edman降解法的原理，Edman降解法的改良方法有哪些，簡(jiǎn)述之。簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)C末端降解測(cè)序的程序氨基酸分析儀測(cè)序操作流程。C末端與N末端蛋白質(zhì)序列儀有哪些相同和不同之處。試比較C末端與N末端蛋白質(zhì)序列的優(yōu)缺點(diǎn)（影響因素）。化學(xué)法一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的步驟有哪些，簡(jiǎn)述之?；驕y(cè)序法翻譯蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)方法。如何確定二硫鍵和酰胺基位置，為和要確定？X射線衍射測(cè)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的原理和基本程序。思考題蛋白質(zhì)N端測(cè)序儀器基于的化學(xué)原理是什么，簡(jiǎn)述之。代表儀器有哪66第三節(jié)核磁共振技術(shù)

NuclearMagneticResonance（NMR）原理適用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)基本概念核磁共振結(jié)構(gòu)測(cè)定基本程序第三節(jié)核磁共振技術(shù)

NuclearMagneticRe67另外，蛋白質(zhì)的晶體狀態(tài)與自然狀態(tài)也不盡相同，在分析的時(shí)候要考慮到這個(gè)問(wèn)題。核磁共振技術(shù)可以分析液態(tài)下的肽鏈結(jié)構(gòu)，這種方法繞過(guò)了結(jié)晶、X－射線衍射成像分析等難點(diǎn)，直接分析自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。現(xiàn)代核磁共振技術(shù)已經(jīng)從一維發(fā)展到三維，在計(jì)算機(jī)的輔助下，可以有效地分析并直接模擬出蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)與輔基和底物結(jié)合的情況以及酶催化的動(dòng)態(tài)機(jī)理。從某種意義上講，核磁共振可以更有效地分析蛋白質(zhì)的突變。另外，蛋白質(zhì)的晶體狀態(tài)與自然狀態(tài)也不盡相同，在分析的時(shí)候要考681．永久磁鐵：提供外磁場(chǎng)，要求穩(wěn)定性好，均勻，不均勻性小于六千萬(wàn)分之一。掃場(chǎng)線圈。2．射頻振蕩器：線圈垂直于外磁場(chǎng)，發(fā)射一定頻率的電磁輻射信號(hào)。60MHz或100MHz。3．射頻信號(hào)接受器（檢測(cè)器）：當(dāng)質(zhì)子的進(jìn)動(dòng)頻率與輻射頻率相匹配時(shí)，發(fā)生能級(jí)躍遷，吸收能量，在感應(yīng)線圈中產(chǎn)生毫伏級(jí)信號(hào)。4．樣品管：外徑5mm的玻璃管,測(cè)量過(guò)程中旋轉(zhuǎn),磁場(chǎng)作用均勻。與UV-vis和紅外光譜法類似，NMR也屬于吸收光譜（是處于強(qiáng)磁場(chǎng)中原子核對(duì)射頻輻射的吸收1．永久磁鐵：提供外磁場(chǎng)，要求穩(wěn)定性好，均勻，不均勻性小于六69核磁共振波譜儀核磁共振波譜儀702.適用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)近生理狀態(tài)溶液中的蛋白質(zhì)構(gòu)象測(cè)定蛋白質(zhì)分子動(dòng)力學(xué)（在s到ps時(shí)間尺度上）小分子和蛋白質(zhì)作用的動(dòng)力學(xué)過(guò)程蛋白質(zhì)可變形尾巴部分的構(gòu)象觀察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)過(guò)程（主側(cè)鏈運(yùn)動(dòng)、不同溫度和壓力下蛋白質(zhì)的折疊和去折疊過(guò)程）結(jié)構(gòu)定性和定量分析非損傷性測(cè)定法，對(duì)樣品無(wú)破壞作用，但不能太大，溶解性要好，穩(wěn)定性要高，不降解不聚合，可進(jìn)行同位素標(biāo)記等。缺點(diǎn)：靈敏度低適用分子量較小的蛋白質(zhì)2.適用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)近生理狀態(tài)溶液中的蛋白質(zhì)構(gòu)象測(cè)定缺點(diǎn)：713.基本概念參數(shù)/概念含義結(jié)構(gòu)信息峰位基團(tuán)的化學(xué)勢(shì)移δ二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，反映微環(huán)境變化峰形耦合常數(shù)及基團(tuán)間的耦合關(guān)系主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象變化峰面積/峰強(qiáng)度核的相對(duì)數(shù)量以及弛豫弛豫過(guò)程從激化的狀態(tài)回復(fù)到平衡狀態(tài)的過(guò)程弛豫時(shí)間弛豫過(guò)程所需要的時(shí)間NOE信號(hào)強(qiáng)度質(zhì)子對(duì)間的距離，越大反映殘基間短程二維同核核磁共振100以下氨基酸殘基數(shù)，穩(wěn)定的溶于水的自然風(fēng)度的蛋白質(zhì)樣品三維/四維異核核磁共振大于100以上氨基酸殘基數(shù)檢測(cè)1H、13C、15N核之間的相關(guān)共振信號(hào)。液體核磁共振13C直接檢測(cè)、長(zhǎng)程N(yùn)OE信息收集膜蛋白／去污劑膠束復(fù)合物(應(yīng)用去污劑膠束來(lái)模擬膜蛋白的磷脂雙分子層環(huán)境)固體核磁共振只能關(guān)注較小分子的結(jié)構(gòu)膜蛋白／磷脂復(fù)合譜儀頻率30MHz→900MH→1000MHz儀器工作方式連續(xù)波譜儀→脈沖-傅里葉變換譜儀3.基本概念參數(shù)/概念含義結(jié)構(gòu)信息峰位基團(tuán)的化學(xué)勢(shì)移δ二級(jí)724.NMR結(jié)構(gòu)測(cè)定基本程序純度：不應(yīng)有鐵及其它雜質(zhì)、粘度要低、濃度：5-10%；5mg(1H),15-30mg(13C)；傅立葉變換-NMR需1mg溶劑：1H譜=四氯化碳(1H),、二硫化碳氘代溶劑：氯仿、丙酮、苯、二甲基亞砜的氘代物標(biāo)樣濃度（四甲基硅烷TMS）：1%樣品→1D-2D-3D（一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu))→計(jì)算出三維結(jié)構(gòu)→能量最小化優(yōu)化→高分辨率三維結(jié)構(gòu)幾何4.NMR結(jié)構(gòu)測(cè)定基本程序純度：不應(yīng)有鐵及其它雜質(zhì)、粘度要73NMR詳細(xì)步驟1.樣品制備：將蛋白質(zhì)溶于D20或H20中，相對(duì)分子質(zhì)量大于6000的需要事先用15N或15N、13C加以標(biāo)記維NMR實(shí)驗(yàn)：測(cè)定1HNMR譜圖。用D2O交換以及做pH、溫度的影響實(shí)驗(yàn)，以獲取化學(xué)位移、耦合常數(shù)以及有關(guān)形成氫鍵等信息3.二維NMR實(shí)驗(yàn)：測(cè)定1H-1HCOSY等，以確定耦合體系，辨別氨基酸類型，進(jìn)行序列識(shí)別，并根據(jù)NOE信息確定各種二級(jí)結(jié)構(gòu)單元等。4.三維NMR實(shí)驗(yàn)：測(cè)定CBCA(CO)NH,CBCANH,HNCO,HNHA,HCCH-COSY,NOESY-TOCSY等的三維圖譜，進(jìn)一步確認(rèn)各自旋體系5.四維NMR實(shí)驗(yàn)：測(cè)定13C/15N編輯的NOESY或13C/13C編輯的NOESY譜，對(duì)重疊嚴(yán)重的一些譜峰的NOE相關(guān)性進(jìn)行分析

NMR詳細(xì)步驟1.樣品制備：將蛋白質(zhì)溶于D20或H20中，相74碳譜與氫譜的對(duì)比碳譜與氫譜的對(duì)比75碳譜與氫譜的對(duì)比譜圖去偶作用對(duì)比碳譜與氫譜的對(duì)比譜圖去偶作用對(duì)比76膜蛋白3D結(jié)構(gòu)研究日益增多越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室涉足這一領(lǐng)域新的方法將進(jìn)一步推進(jìn)膜蛋白3D研究．在膜蛋白樣品制備方面，更多的經(jīng)驗(yàn)積累將極大推進(jìn)人們對(duì)膜蛋白與不同去污劑，不同的磷脂之間的相互作用的理解，將避免嘗試一些不利于膜蛋白穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的去污劑，大大加快正確去污劑篩選的速度．膜蛋白研究膜蛋白3D結(jié)構(gòu)研究日益增多膜蛋白研究77？

膜蛋白樣品中，還包含有去污劑或磷脂分子，這樣，膜蛋白的1H信號(hào)將和去污劑/磷脂中的1H信號(hào)相重疊，而很難獲得只含有膜蛋白的1H信號(hào)的核磁光譜．在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要采用含13C和／或15N標(biāo)記的膜蛋白，再依靠核磁共振同位素過(guò)濾脈沖序列特異性獲得膜蛋白的信號(hào)，并進(jìn)一步進(jìn)行膜蛋白的結(jié)構(gòu)研究．蛋白質(zhì)通常溶于pH<7、鹽離子濃度大約10-50mmol／L的水溶液中。除了緩沖液必須鹽組分，有時(shí)還加入少量的甘油、異丙醇、蔗糖、精氨酸和谷氨酸等，以提高蛋白質(zhì)的溶解度和穩(wěn)定性。？膜蛋白樣品中，還包含有去污劑或磷脂分子，這樣，膜蛋白的178第三、其它結(jié)構(gòu)測(cè)定方法Uv-vis熒光光譜CD(circulardichroism)：稀溶液中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的一種簡(jiǎn)單快速又較準(zhǔn)確的方法,是利用不對(duì)稱分子對(duì)左右圓偏振光系吸光率的不同來(lái)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。激光拉曼光譜（瑞利散射和拉曼散射）：適用從固到稀溶液樣品；物化處理后樣品，對(duì)樣品沒(méi)有破壞性，可得到一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)信息。質(zhì)譜：ug級(jí)樣品，一級(jí)結(jié)構(gòu)的分子量、氨基酸排序、二硫鍵數(shù)目和位置；三維電鏡重構(gòu)法：是電子顯微束+電子衍射+計(jì)算機(jī)圖像處理是對(duì)電子顯微圖像進(jìn)行傅里葉變換，得到三維結(jié)構(gòu)。直接獲得分子的形貌信息；適合樣品范圍更寬，尤其是難以結(jié)晶的膜蛋白和生物大分子復(fù)合體；可捕捉動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)變化信息；易于和其它技術(shù)結(jié)合得到高分辨率結(jié)構(gòu)信息，相位確定更直接和方便（質(zhì)量高于同晶置換法，不需要重原子衍生物），是結(jié)構(gòu)分析的重要補(bǔ)充。7動(dòng)力學(xué)全精研究技術(shù)（dynamicsensembleferinementDER）兩個(gè)NMR（分子可能移動(dòng)范圍或其它結(jié)構(gòu)內(nèi)運(yùn)動(dòng)）+分子動(dòng)力學(xué)（分子在蛋白質(zhì)內(nèi)移動(dòng)）。用動(dòng)力學(xué)及結(jié)構(gòu)信息來(lái)繪制蛋白質(zhì)移動(dòng)的全范圍圖譜。運(yùn)用NMR的序參數(shù)，模擬分子動(dòng)力學(xué)，得到一套代表蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化的構(gòu)型。第三、其它結(jié)構(gòu)測(cè)定方法Uv-vis79蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

一、同源建模是最常用最有效的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法。前提是需要用同源蛋白質(zhì)的已知結(jié)構(gòu)作為模板。當(dāng)缺乏這種模板結(jié)構(gòu)時(shí)，預(yù)測(cè)很難奏效！能否從蛋白質(zhì)氨基酸序列出發(fā)，直接預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。二、反向折疊法三、從頭預(yù)測(cè)法蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

一、同源建模是最常用最有效的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方80感謝觀看感謝觀看81第四講蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)一第四講蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)一82第四講蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)（一）氨基酸序列分析X-射線衍射技術(shù)核磁共振質(zhì)譜技術(shù)結(jié)構(gòu)分析的其它方法現(xiàn)代光譜技術(shù)三維電鏡重構(gòu)技術(shù)動(dòng)力學(xué)全局研究技術(shù)

UV-Vis、IR、熒光、CD、激光拉曼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象；構(gòu)象變化過(guò)程；如：蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中間態(tài)形成的時(shí)間尺度和機(jī)制.二級(jí)結(jié)構(gòu)形成、卷曲過(guò)程，變性和復(fù)性過(guò)程及機(jī)制。主要內(nèi)容是結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)第四講蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)（一）氨基酸序列分析核磁共振UV83第一節(jié)蛋白質(zhì)氨基酸序列分析技術(shù)主要內(nèi)容化學(xué)法基因方法蛋白質(zhì)分子中二硫鍵和酰胺基位置的確定蛋白質(zhì)測(cè)定新技術(shù)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的意義：寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)與制備cDNA推導(dǎo)氨基酸序列提供依據(jù)重組DNA產(chǎn)生的蛋白指紋分析蛋白質(zhì)的完整結(jié)構(gòu)鑒定確定翻譯后修飾的位點(diǎn)決定簇的定位二硫鍵的確定第一節(jié)蛋白質(zhì)氨基酸序列分析技術(shù)主要內(nèi)容一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的意義：84一、蛋白質(zhì)測(cè)序的研究1947采用部分水解的方法試圖測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸序列Consden等利用色譜技術(shù)成功測(cè)定了短桿菌肽S6的氨基酸序列Sanger首次測(cè)定了牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)（由51個(gè)氨基酸殘基組成）Spackman、Stein、Moore制造了自動(dòng)化的氨基酸分析儀，使氨基酸定量分析進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段Edman推出第一臺(tái)全自動(dòng)測(cè)序儀195819551940年前1967一、蛋白質(zhì)測(cè)序的研究1947采用部分水解的方法試圖測(cè)定蛋85N-末端氨基酸的測(cè)定方法（主要5類）1、二硝基氟苯法（DNFB法、Sanger法）2、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）

DNS-氨基酸呈熒光3、異硫氰酸苯酯法（PITC法）4、DABITC法（甲氨偶氮苯基異硫氰酸苯酯），

形成的DABIH—氨基酸呈桔黃色（有顏色）5、氨肽酶法N-末端測(cè)定的方法——奠定了序列測(cè)定方法發(fā)展基礎(chǔ)N-末端氨基酸的測(cè)定方法（主要5類）86牛胰島素（51aa）的一級(jí)結(jié)構(gòu)Sanger首次(DNFB法)測(cè)定了牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)

——Sanger法（測(cè)定蛋白N末端的方法）牛胰島素（51aa）的一級(jí)結(jié)構(gòu)Sanger首次(DNFB法87二、序列測(cè)定方法——化學(xué)方法（一）N端測(cè)序法應(yīng)用最廣的N端順序測(cè)定法大多仍以Edman降解原理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)。利用化學(xué)試劑和控制反應(yīng)條件，從N端開始，將肽鏈逐步降解，進(jìn)行氨基酸序列的測(cè)定的方法。1、Edman降解法——異硫氰酸苯酯（PITC）法特點(diǎn)：可以測(cè)定氨基酸的排列順序（包括N端分析）。適用于手工操作，也可設(shè)計(jì)自動(dòng)化測(cè)定儀器（1）原理：四點(diǎn)： ①異硫氰酸苯酯(PITC)偶聯(lián)→②ATZ-氨基酸裂解→③PTH-氨基酸轉(zhuǎn)化→④PTH-氨基酸的鑒定二、序列測(cè)定方法——化學(xué)方法（一）N端測(cè)序法88

偶聯(lián)：自由α-氨基與異硫氰酸苯酯(PITC)試劑偶聯(lián)，與其緊挨的第二個(gè)殘基的鍵合力大大減弱，很容易斷裂。

裂解：在無(wú)水條件下酸（F3CCOOH）裂解，形成苯氨基噻唑啉酮衍生物（ATZ-氨基酸）和失去末端氨基酸殘基的多肽，又可與PITC進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，下一輪降解。

轉(zhuǎn)化：ATZ-氨基酸不穩(wěn)定，三氟乙酸水溶液（25%）可轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的PTH-氨基酸。

PTH-氨基酸的鑒定：可以通過(guò)薄層層析、氣相色譜、高效液相色譜及質(zhì)譜等各種手段進(jìn)行分析。乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸(PTH－氨基酸)。PITC試劑ATZ-氨基酸偶聯(lián)：自由α-氨基與異硫氰酸苯酯(PITC)試劑89單向紙層析氨基酸鑒定——PTH-氨基酸與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（PITC試劑反應(yīng)）對(duì)照單向紙層析氨基酸鑒定——PTH-氨基酸與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（PITC90雙向紙層析雙向紙層析91薄層層析（TLC）薄層層析（TLC）92高效液相色譜（HPLC）（highperformanceliquidchromatography）高效液相色譜（HPLC）93（2）氨基酸序列分析儀器以Edman法測(cè)序，手工操作繁瑣，工作量大根據(jù)Edman降解的原理——自動(dòng)化分析儀器自70年代初全自動(dòng)序列儀誕生以來(lái)，經(jīng)過(guò)了一系列更新?lián)Q代，儀器日趨靈敏、快速。靈敏度達(dá)0.1pmol蛋白3種代表性的測(cè)序儀器簡(jiǎn)單介紹如下：（2）氨基酸序列分析儀器94①液相旋轉(zhuǎn)杯序列儀最初的自動(dòng)化儀器，對(duì)自動(dòng)化測(cè)序意義很大。測(cè)定程序：整個(gè)儀器的“核心”部分是一個(gè)反應(yīng)杯，它由一個(gè)馬達(dá)帶動(dòng)并有調(diào)速控制。蛋白質(zhì)或多肽樣品經(jīng)導(dǎo)管注入反應(yīng)杯，通過(guò)旋轉(zhuǎn)離心力被均勻地涂在杯壁上，形成一層薄膜，其厚薄可由轉(zhuǎn)速控制。反應(yīng)試劑和溶劑分別通過(guò)導(dǎo)管進(jìn)入反應(yīng)杯，與杯內(nèi)薄層上的樣品的N端自由氨基進(jìn)行Edman反應(yīng)；降解下來(lái)的ATZ—氨基酸衍生物通過(guò)另一導(dǎo)管引出并收集；再將ATZ氨基酸→PTH氨基酸→鑒定；洗滌反應(yīng)杯，依次循環(huán)分析。特點(diǎn)：該儀器樣品流失較大，樣品消耗量大，目前已很少使用。①液相旋轉(zhuǎn)杯序列儀95②固相序列分析儀發(fā)展的動(dòng)力和原因： 克服液相旋轉(zhuǎn)杯分析儀的缺點(diǎn)。多肽不易吸附旋轉(zhuǎn)杯上，樣品流失較大；原理：蛋白質(zhì)C端羧基共價(jià)固定在惰性載體上，進(jìn)行Edman降解。特點(diǎn)：樣品與載體共價(jià)結(jié)合，洗滌和抽提等過(guò)程不會(huì)丟失樣品，增加循環(huán)次數(shù)。缺點(diǎn)：（1）若多肽中其它殘基的羧基與載體結(jié)合，影響測(cè)定。如：酸性氨基酸殘基（Asp、Glu）（2）測(cè)定效率低②固相序列分析儀963-氨基丙基玻璃N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基玻璃惰性載體成功的關(guān)鍵是肽段的固定，目前采用C端α-羧基固定法，重復(fù)法高，高絲氨酸內(nèi)酯法及雙異硫氰酯法(DITC)最好，固定率可達(dá)90-95%。3-氨基丙基玻璃N-(2-氨基乙基)-惰性載體成功的關(guān)鍵是肽97③氣相蛋白序列分析儀彈筒型玻璃反應(yīng)室反應(yīng)室容積0.05ml，代替液相序列儀中的旋轉(zhuǎn)玻璃杯，用一種惰性聚合物“polybrene”固定樣品。多肽鏈與氣態(tài)試劑反應(yīng)，完成Edamn降解。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，耗費(fèi)樣品量少，通常僅需10~100pmol；試劑和溶劑消耗少，大約是液相序列儀的1／10，降低了費(fèi)用；縮短了每步降解循環(huán)時(shí)間，提高了分析效率。趨勢(shì)：靈敏度不斷提高③氣相蛋白序列分析儀98氣相蛋白序列分析儀氣相蛋白序列分析儀99（3）Edman方法改進(jìn)DABITC法：1976年，（華裔科學(xué)家）張瑞耀提出試劑：甲氨偶氮苯基異硫氰酸苯酯替代了異硫氰酸苯酯（PITC）DABITC：4-N,N-對(duì)甲氨基偶氮苯-4’-異硫氰酸酯原理：與PITC相似，形成有色產(chǎn)物DABIH—氨基酸，呈桔黃色也稱為有色的Edman降解法，氨基酸鑒定無(wú)需染色，肉眼可分辨特點(diǎn)：靈敏度很高，分析小肽段只要幾個(gè)nanomole樣品即可。但DABITC試劑與多肽N端aa耦合率低（20%-30%），測(cè)序干擾大！如何解決？DABITC—PITC兩種方法耦合，更加靈敏可靠。適用于：液相還是固相，手工還是自動(dòng)方法，效果良好。異硫氰酸酯進(jìn)行35S標(biāo)記：使分析樣品更向微量化方向發(fā)展。（3）Edman方法改進(jìn)100二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）熒光劑—DNS-Cl，與肽鏈N端氨基反應(yīng)生成DNS-肽經(jīng)酸水解，N-末端殘基形成DNS-氨基酸，檢測(cè)靈敏度提高310倍。乙酸乙酯抽提，層析鑒定，DNS-氨基酸于360nm或280nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，根據(jù)熒光點(diǎn)位置確定N端氨基酸。6MHCl，110℃水解過(guò)夜DNS-脯氨酸70%被破壞。Gln→Glu，Asn→AspTrp及其DNS衍生物完全被破壞(可用巰基乙烷磺酸真空下水解)特點(diǎn)：不能連續(xù)降解，適用于N末端分析（n-1）肽熒光？二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）6MHCl，11101DNS—Edman測(cè)定法兩種方法的結(jié)合DNS法，靈敏的高，但不能連續(xù)進(jìn)行Edman降解法N肽DNS-ClN末端氨基酸測(cè)定Edman降解除去N末端氨基酸水層（n-1）肽乙酸乙酯層（N末端氨基酸衍生物）DNS-ClN末端氨基酸測(cè)定Edman降解除去N末端氨基酸DNS—Edman測(cè)定流程示意圖DNS—Edman測(cè)定法N肽DNS-ClN末端氨基酸測(cè)定E102思考？為何要?jiǎng)?chuàng)新很多方法？什么樣的方法能延續(xù)下去？思考？103（4）氨基酸自動(dòng)序列儀的使用方法依據(jù)Ednan原理，氨基酸自動(dòng)測(cè)序儀，序列分析加快測(cè)序儀發(fā)展方向：微量化、自動(dòng)化加樣量達(dá)到微量：10-9—10-12mol水平推出從進(jìn)樣到色譜分析一體化分析儀舉例：Shimadzu（島津）公司PPSQ-21A氨基酸自動(dòng)測(cè)序儀工作原理：Ednan降解，產(chǎn)物乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸），柱前衍生的液相色譜（HPLC）分析。（4）氨基酸自動(dòng)序列儀的使用方法104工作流程固定樣品固定將蛋白固定在高聚纖維素上，在放在能固定蛋白的聚偏氟乙烯（PDVF）膜上，進(jìn)行Edman降解。反應(yīng)器耦合以N-甲基哌啶水/甲醇（TMA）氣霧環(huán)境讓蛋白末端氨基酸與PITC反應(yīng)，生產(chǎn)PTC-肽反應(yīng)器終止反應(yīng)用乙酸清洗出去多余的試劑和副產(chǎn)物反應(yīng)器裂解無(wú)水TFA溶液，將PTC-肽裂解為ATZ-氨基酸和（n-1）肽，排出并洗滌轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換反應(yīng)采用25%TFA溶液將ATZ-AA轉(zhuǎn)化為PTH-AA轉(zhuǎn)換器提取在轉(zhuǎn)換器提取游離的PTH-氨基酸樣品進(jìn)樣進(jìn)樣用乙腈溶液溶解PTH-氨基酸，并進(jìn)樣到HPLCHPLC分析分離鑒定反向HPLC分離PTH-氨基酸，并檢測(cè)數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)分析顯示和處理數(shù)據(jù)，確定PTH-氨基酸，并進(jìn)行定量和回收率計(jì)算工作流程固定樣品固定將蛋白固定在高聚纖維素上，在放在能固定蛋105（5）影響N端Edman反應(yīng)裂解率的因素在測(cè)序中，即使N端很均一的蛋白質(zhì)(第一個(gè)循環(huán)出現(xiàn)單個(gè)氨基酸殘基)，經(jīng)過(guò)十幾個(gè)循環(huán)后背景明顯不及第一個(gè)殘基清晰。原因：Edman反應(yīng)是一個(gè)化學(xué)過(guò)程，在其偶聯(lián)、裂解、轉(zhuǎn)化等步驟都有可能發(fā)生一些副反應(yīng)，從而影響最終裂解效率。三氟乙酸除了裂解作用外，可與Ser和Thr上的-OH反應(yīng)，繼而部分封閉Ser和Thr的N端α-氨基，導(dǎo)致Ser和Thr時(shí)產(chǎn)率突然降低。Ser和Thr的PTH-衍生物部分轉(zhuǎn)化成其他產(chǎn)物，造成產(chǎn)率降低。偶聯(lián)試劑PITC本身也將發(fā)生副反應(yīng)，形成一些“雜質(zhì)”。（5）影響N端Edman反應(yīng)裂解率的因素106（6）N端測(cè)序前樣品處理純度鑒定（97%）脫鹽疏基修飾去除N端封閉的基團(tuán)（酸水解，酶處理）（6）N端測(cè)序前樣品處理107（二）C端測(cè)序法雖然自動(dòng)化N端測(cè)序技術(shù)日趨成熟，但仍有不少問(wèn)題需借助C端序列分析來(lái)解決（？）C端測(cè)序優(yōu)勢(shì)：尤其適合于基因重組蛋白是否正確表達(dá)的鑒定（Why？）大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)的質(zhì)量控制、N端封閉蛋白的分析DNA探針或引物的設(shè)計(jì)。（不做詳細(xì)講述，感興趣者自己閱讀學(xué)習(xí)）（二）C端測(cè)序法1081、原理（C端分析）基于與N端Edman降解類似的原理，采用化學(xué)試劑與蛋白質(zhì)和多肽的α-COOH反應(yīng)，反應(yīng)后的C末端衍生物被切割下來(lái)，通過(guò)HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分離分析。已有自動(dòng)化的C端序列分析儀1、原理（C端分析）109(1)活化C端的自由羧基與乙酸酐反應(yīng)生成混合酸酐，混合酸酐再環(huán)化成聚噁唑酮，在四丁基銨硫氰酸鹽的作用下，轉(zhuǎn)化為乙內(nèi)酰硫脲(TH)。而側(cè)鏈上的羧基形成的混合酸酐則難以成環(huán)。2、C端序列分析程序六個(gè)步驟、羧基活化→側(cè)鏈羧基保護(hù)→烷基化TH–肽→側(cè)鏈羥基保護(hù)→斷裂形成ATH-AA→AA分析(1)活化2、C端序列分析程序六個(gè)步驟、110(2)側(cè)鏈羧基的酰胺化保護(hù)

側(cè)鏈羧基形成混合酸酐，與哌叮硫氰酸鹽（piperidinethiocyanate）進(jìn)一步作用形成酰胺，以保護(hù)側(cè)鏈羧基。(2)側(cè)鏈羧基的酰胺化保護(hù)111(3)烷基化C末端環(huán)化成的乙內(nèi)酰硫脲（TH）衍生物較為穩(wěn)定而不易被切割，產(chǎn)率不高。選擇性地烷基化修飾硫原子，形成烷基化-TH(ATH)衍生物，裂解產(chǎn)率將大大提高。(3)烷基化112(4)修飾側(cè)鏈羥基（保護(hù)）Thr和Ser殘基的側(cè)鏈上具有羥基羥基不穩(wěn)定，會(huì)干擾測(cè)序，需要修飾。乙酸酐將羥基乙?；磻?yīng)不完全。N-甲基咪唑（NMI）和乙酸酐共同作用，將Thr和Ser的羥基乙?；?。(4)修飾側(cè)鏈羥基（保護(hù)）113(5)裂解和衍生C末端ATH衍生物在酸性條件下與硫氰酸鹽反應(yīng)而被裂解生成ATH-氨基酸。新的C末端自動(dòng)環(huán)化形成乙內(nèi)酰硫脲（TH），而不必重新活化。整個(gè)測(cè)序過(guò)程只需在開始時(shí)對(duì)C端進(jìn)行一次性活化，并修飾Asp和Glu側(cè)鏈羧基，以及Thr和Ser的羥基。(6)ATH-AA分析（常規(guī)分析）小結(jié)——C末端測(cè)序程序羧基活化→側(cè)鏈羧基保護(hù)→烷基化TH–肽→側(cè)鏈羥基保護(hù)→斷裂形成ATH-AA→AA分析測(cè)定C端第一個(gè)和第二個(gè)氨基酸工藝的區(qū)別(5)裂解和衍生小結(jié)——C末端測(cè)序程序1143、C末端蛋白質(zhì)序列儀可由N端序列儀改裝而成，不同之處主要在于:(1)

反應(yīng)所用的試劑不同，兩者不兼容，否則易堵塞管道。C端序列儀：所有的化學(xué)反應(yīng)均在彈筒型反應(yīng)室中進(jìn)行，切割下來(lái)的ATH-AA僅在轉(zhuǎn)化腔內(nèi)干燥和溶解后即可進(jìn)入HPLC系統(tǒng)分離分析。N端測(cè)序儀：ATZ-AA需在轉(zhuǎn)化腔中轉(zhuǎn)化為PTH-AA。3、C末端蛋白質(zhì)序列儀1154、C端測(cè)序樣品前處理純度鑒定脫鹽疏基修飾ε-氨基的衍生4、C端測(cè)序樣品前處理1165、影響C端測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)率的因素不同的氨基酸的反應(yīng)產(chǎn)率不同，圖譜分析比N端測(cè)序復(fù)雜。C端測(cè)序副反應(yīng)較多，最高起始產(chǎn)率僅為20%，GluAspSerThr等殘基的產(chǎn)率更低。若C端富含這幾種殘基，測(cè)序十分困難。Pro殘基終止測(cè)序過(guò)程Pro殘基有吡咯環(huán)，其羧基與乙酸酐反應(yīng)不能成環(huán)。一旦遇到Pro，整個(gè)測(cè)序過(guò)程將終止。到目前為止，C端序列可測(cè)l~10個(gè)殘基，平均3~5個(gè)，一次測(cè)序需要的量比N端測(cè)序要大得多，至少需1nmol。作為N端測(cè)序的補(bǔ)充。5、影響C端測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)率的因素117（三）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定步驟蛋白質(zhì)水解——多個(gè)短肽測(cè)定——每個(gè)短肽的序列序列拼接——蛋白質(zhì)序列二硫鍵和酰胺位置的確定（三）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定步驟蛋白質(zhì)水解——多個(gè)短肽1181、酶解和分離長(zhǎng)肽鏈降解成短肽以利于多肽的序列測(cè)定長(zhǎng)肽鏈降解成短肽與氨基酸測(cè)序結(jié)合進(jìn)行序列分析長(zhǎng)肽鏈降解成短肽以利于測(cè)定肽譜常用酶及降解位點(diǎn)胰蛋白酶Lys、Arg等堿性aa羧基端，不切-Arg-Pro-、-Lys-Pro-胰凝乳蛋白酶芳香aa羧基端胃蛋白酶Phe、Trp、Leu、Ala等aa羧基端梭菌蛋白酶Arg等堿性aa羧基端V8蛋白酶Asp、Glu等酸性aa羧基端Lys內(nèi)肽酶Lys羧基端優(yōu)點(diǎn)：專一性強(qiáng)、條件溫和、副反應(yīng)少、水解率高短肽分離：采用HPLC方法——蛋白質(zhì)分離純化章節(jié)詳細(xì)介紹方法和原理1、酶解和分離長(zhǎng)肽鏈降解成短肽以利于多肽的序列測(cè)定短肽分離：119測(cè)序不能太長(zhǎng)，常常需要酶切測(cè)序，肽鏈拼接。（拼圖游戲）根據(jù)肽鏈測(cè)序結(jié)果若一條簡(jiǎn)單肽鏈：僅有1～2個(gè)斷裂點(diǎn)，根據(jù)N和C末端氨基酸，很容易確定其一級(jí)結(jié)構(gòu)。若為復(fù)雜的肽鏈：不能只靠一套肽鏈斷裂方法，需要兩套甚至更多的斷裂方法分別測(cè)序，通過(guò)查找疊肽的方法，分析確定完整的氨基酸序列。舉例說(shuō)明：（拼圖）2、肽鏈拼接——重疊肽法測(cè)序不能太長(zhǎng)，常常需要酶切測(cè)序，肽鏈拼接。（拼圖游戲）2、肽120一條15個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，其N末端為His，C末端為Glu。采用兩套斷裂方法分別測(cè)序：第一套將肽段斷裂成5個(gè)小片段，其序列分別為L(zhǎng)ys-Trp-Glu，Cys-Glu，Asp-Lys-Va-Asp，Leu-Pro-Ala和（1）His-Lys-Ile-Tyr。第二套肽段斷裂為Glu-Asp-Lys，（4）Ile-Tyr-Lys-Trp，Val-Asp-Leu-Pro，（2）Ala-Cys-Glu和（3）His-Lys。通過(guò)N、C末端及重疊肽最后可定編為：

His-Lys-Ile-Tyr-Lys-Trp-Glu-Asp-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Ala-Cys-Glu一條15個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，其N末端為His，C末端為G1213、二硫鍵和酰胺基位置的確定（1）為何要確定？Cys如何存在，是否形成二硫鍵Gln和Asn在測(cè)序過(guò)程中水解形成Glu和Asp（2）二硫鍵位置的確定方法（對(duì)角線電泳、測(cè)序法）用碘代乙酰胺保護(hù)蛋白樣品中未參與二硫鍵的巰基；（胃蛋白酶）水解，水解肽段進(jìn)行對(duì)角線法電泳分離。點(diǎn)在方形濾紙中心點(diǎn)上，進(jìn)行第一相電泳分離(pH6.5)。將濾紙用過(guò)甲酸蒸汽熏蒸，二硫鍵氧化成半胱氨磺酸。（酶切片段若含有二硫鍵，即分成2個(gè)小肽）第二向電泳，含半胱氨磺酸的肽比原來(lái)小，且?guī)Я烁嗟呢?fù)電荷，偏離了對(duì)角線，其余肽均對(duì)角線位置上。（Why？）染色后，剪下偏離對(duì)角線的肽斑，分析其氨基酸順序，與已確定的氨基酸順序比較，即可確定二硫鍵的位置。3、二硫鍵和酰胺基位置的確定122（3）酰胺基位置的確定方法：肽鏈酶解片段定量NH4＋推測(cè)法肽鏈中酰胺基以Asn或Gln形式存在。酰胺基水解可釋放NH4＋，測(cè)定NH4＋量推測(cè)酰胺基的含量。蛋白水解酶水解分離，可以得到含有酰胺基的肽段。測(cè)定其酰胺基數(shù)和推測(cè)可能形成酰胺基的數(shù)量，如果二者數(shù)量相等，就可以確定酰胺基位置。若不符，應(yīng)將肽鏈裂解為更小片段，再測(cè)酰胺基含量和可能存在的位置數(shù)目，直到兩者相符為止。（3）酰胺基位置的確定123三、序列測(cè)定其它方法——基因序列分析法（1）原理：翻譯密碼子（2）步驟：蛋白質(zhì)N末端和C末端氨基酸分析特異性引物設(shè)計(jì)總mRNA提取（特定蛋白質(zhì)）：分離法：免疫法——結(jié)合蛋白與mRNA分子雜交?？寺RNA：測(cè)定蛋白質(zhì)N端10—15殘基序列，設(shè)計(jì)兼并引物。cDNA序列分析：RT-PCR，測(cè)定cDNA序列（？方法）例如：熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷末端終止法（？？？）全自動(dòng)系列分析儀，1000bp/反應(yīng)，簡(jiǎn)單快速，成本低廉根據(jù)密碼規(guī)則讀取蛋白質(zhì)序列。三、序列測(cè)定其它方法——基因序列分析法（1）原理：翻譯密碼子124四、蛋白質(zhì)測(cè)定新技術(shù)（分離純化部分再介紹）1、高效液相色譜（HPLC）用于蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸的分析色譜填充料：大孔徑烷基化硅膠吸附劑（C18）普通孔徑：5—10um進(jìn)一步提高分析速度和靈敏度 大孔徑：3×10-5mm（大肽） 小孔徑：1×10-5mm（小肽）四、蛋白質(zhì)測(cè)定新技術(shù)（分離純化部分再介紹）125（1）微柱高效液相色譜（microcolum-HPLC）柱直徑<2.1mm(普通4.6mm)，Ishii首次提出是低分子量蛋白或肽的基礎(chǔ)樣品用量少，速度快，靈敏度高（1pmol），峰形尖窄，回收率高，非特異性吸附少。是目前肽譜分析最靈敏最先進(jìn)的技術(shù)之一應(yīng)用于肽譜和基因工程產(chǎn)物的分析（1）微柱高效液相色譜（microcolum-HPLC）126（2）無(wú)孔色譜短柱填充直徑無(wú)孔硅膠，達(dá)到快速分離。特點(diǎn)：顯著改善分析靈敏度縮短分析時(shí)間（幾分鐘完成）減少生物分子的非專一性吸附（回收率100%）降低洗脫體積（幾個(gè)微升—1mL）可耐受較高壓力（30MPa）（2）無(wú)孔色譜短柱127（3）毛細(xì)管液相色譜1995年Yamada建立柱內(nèi)徑：250um—500um，填充物直徑3-5um，孔徑3×10-5mm，2.5ml注射泵，流速僅3—5uL/min，上樣量5—25ul，檢測(cè)器：紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器毛細(xì)管流出樣品直接點(diǎn)樣到聚偏氟乙烯膜（PVDF）上，樣品用刀片割1—2mm條帶，用于蛋白質(zhì)序列分析。靈敏度很高（3）毛細(xì)管液相色譜1282、毛細(xì)管電泳（CE）20世紀(jì)90年代微量分析技術(shù)材料：熔融石英玻璃，內(nèi)徑?。?lt;100um）上樣量極少（<10uL）,靈敏度高，比HPLC高2個(gè)數(shù)量級(jí)（10-15mol）分類：毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）；荷質(zhì)比等電聚焦電泳（CIEF）；等電點(diǎn)微團(tuán)電動(dòng)毛細(xì)管電泳（MECC）；疏水或離子交換毛細(xì)管篩分電泳（CSE）；分子大小和電荷毛細(xì)管柔和免疫電泳（IACE）：與抗體結(jié)合專一性2、毛細(xì)管電泳（CE）129本節(jié)小結(jié)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定化學(xué)法測(cè)定原理及方法重點(diǎn)N端降解的原理、方法和影響因素，特別是Edman降解及其方法改進(jìn)。三種序列分析儀（旋轉(zhuǎn)杯、固相、氣相）簡(jiǎn)單介紹了C端降解法的原理、方法和儀器，化學(xué)法測(cè)定蛋白質(zhì)序列測(cè)定的步驟酶解、分離純化、肽段序列測(cè)定、序列拼接、二硫鍵和酰胺基位置的確定簡(jiǎn)述基因序列分析原理和方法HPLC和毛細(xì)管電泳等蛋白質(zhì)測(cè)定新技術(shù)（略）本節(jié)小結(jié)130第二節(jié)：X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析本節(jié)主要內(nèi)容研究進(jìn)展基本概念基本原理特點(diǎn)X射線衍射技術(shù)：精確測(cè)定原子在晶體中的空間位置的一整套測(cè)量及分析技術(shù)，是迄今研究生物大分子結(jié)構(gòu)的主要技術(shù)。第二節(jié)：X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析本節(jié)主要內(nèi)容X射線衍射技術(shù)：1311.研究進(jìn)展背景1895年，倫琴發(fā)現(xiàn)X射線1913年布拉格父子用X射線衍射法對(duì)氯化鈉、氯化鉀晶體進(jìn)行了測(cè)定 1915年布拉格父子因此獲諾貝爾物理獎(jiǎng)，建立了晶體學(xué)1934年第一張蛋白質(zhì)-胃蛋白酶單晶體1957年-1959年相繼8種蛋白質(zhì)獲得了高分辨率結(jié)果1960年以后從單純的結(jié)構(gòu)學(xué)邁入結(jié)構(gòu)-功能研究。1990年以后突飛猛進(jìn)，15個(gè)結(jié)構(gòu)/天2003年，PDB收錄的84.8%蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來(lái)自X-射線衍射1.研究進(jìn)展背景132我國(guó)的標(biāo)志性成果1 中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所和植物研究所“菠菜捕光復(fù)合物L(fēng)HC-II晶體結(jié)構(gòu)（2.72A）2004年，世界上權(quán)威性的著名雜志《Nature》該晶體的結(jié)構(gòu)彩圖被選作該期雜志的“封面照片”。世界上率先完成了這一具有高度挑戰(zhàn)性的國(guó)際前沿課題。推動(dòng)了中國(guó)“光合作用機(jī)理與膜蛋白三維結(jié)構(gòu)”研究進(jìn)入國(guó)際領(lǐng)先水平。意義：基于精確的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)對(duì)高等植物的光能吸收、傳遞和光保護(hù)等光合作用機(jī)理研究的熱點(diǎn)問(wèn)題進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)了膜蛋白結(jié)晶的第3種類型，TYPE-III膜蛋白晶體，并建立了包括膜蛋白、色