瘧原蟲(chóng)血片制作方法

關(guān)于瘧原蟲(chóng)血片制作方法第1頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五血膜的制作（取血時(shí)間）取血時(shí)機(jī)現(xiàn)癥病人一般可隨時(shí)取血，瘧疾普查時(shí)可不考慮取血時(shí)機(jī)。但在診斷或需要某期瘧原蟲(chóng)作標(biāo)本時(shí)，則應(yīng)掌握適宜的取血時(shí)機(jī)。間日瘧在寒熱發(fā)作時(shí)，外周血液中主要可見(jiàn)環(huán)狀體期；發(fā)作后數(shù)小時(shí)，環(huán)狀體發(fā)育到滋養(yǎng)體期，瘧色素形成，形態(tài)較易辯認(rèn)，為診斷的有利時(shí)機(jī)；36~48小時(shí)，可檢出裂殖體；發(fā)作一、二次后，配子體出現(xiàn)較多。惡性瘧較理想的取血時(shí)間是在發(fā)作后至20小時(shí)內(nèi)取血，初發(fā)患者退熱后常查不到原蟲(chóng)。第2頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五血膜的制作（取血操作）取血方法采血部位一般人為耳垂，指頭，通常在耳垂取血（現(xiàn)場(chǎng)取血建議用大頭針采血，一人一針，避免血傳疾病）。先用75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻動(dòng)耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方，右手持消毒針迅速刺入耳垂下端1~2毫米，不宜過(guò)深或過(guò)淺。然后用右手中指輕輕向擠壓出血。第3頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五取血量及涂片法（涂片操作）薄血膜取潔凈的載玻片2張，1張平置在桌上，以左手拇指，食指夾持載玻片兩端（手指切勿接觸玻片表面），用另一張邊緣平滑（最好為磨口邊緣）的載玻片做推片，用推片一端邊緣的中點(diǎn)從取血部分取約1微升的血量（相當(dāng)于1/4火柴頭大?。寡闻c平置的載玻片接觸，并形成25~30度夾角，待血液向兩側(cè)擴(kuò)展約2厘米長(zhǎng)度時(shí)，均勻而迅速地輕輕向左推出（約2.5厘米長(zhǎng)）。第4頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五（涂片操作）厚血膜用推片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當(dāng)于火柴頭大?。?，使血滴與平置的載玻片接觸，再由里向外一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)2~4圈，涂成直徑0.8~1厘米大小圓形厚血膜，血膜厚薄均勻，過(guò)厚易于脫落，過(guò)薄達(dá)不到檢出率的要求。第5頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五血膜的制作（涂片操作）涂制厚、薄血膜的位置通常是將厚、薄血膜涂在一張載片上。方法是將載片分為6等分，第1、2格備貼標(biāo)簽及編號(hào)用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前緣至第6格中部。作為標(biāo)本的血片每張玻片涂厚、薄血膜各1個(gè)；門(mén)診和發(fā)熱病人血片每片1人，涂涂2個(gè)厚血膜1個(gè)薄血膜，以防血膜脫落而影響檢查；瘧疾調(diào)查時(shí)，每張玻片可涂制2~3人血膜。標(biāo)本片發(fā)熱病人血片標(biāo)簽標(biāo)簽第6頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五血膜的制作血膜編號(hào)血膜制成后，立即用特種蠟筆或水筆于玻片面上寫(xiě)上受檢者的號(hào)碼，以防差錯(cuò)，待薄血膜干后再用鉛筆于薄血膜中寫(xiě)上血片種類(lèi)的代號(hào)和受檢者的個(gè)人編號(hào)，依次順序插入標(biāo)本盒內(nèi)。第7頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五制作血膜的注意事項(xiàng)

1.玻片清洗時(shí)，避免玻片碰撞、磨損。制作血膜的載玻片必須完全清潔而毫無(wú)油漬或污垢。制片時(shí)，手指只能持載片的邊緣，不能接觸玻片表面，以免油污使薄血膜產(chǎn)生空白區(qū)以及厚血膜脫落。作為推片的玻片邊緣一定要平滑，才能使推出的血膜均勻一致。第8頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五制作血膜的注意事項(xiàng)2.剛涂制的血膜要平放在標(biāo)本盒內(nèi)，厚血膜未干前勿使標(biāo)本盒傾斜，以免血膜傾向一側(cè)，造成血膜厚薄不均，厚處不一溶血和著色而影響檢查結(jié)果；晾干血膜時(shí)應(yīng)注意防塵、防止蒼蠅、蟑螂等昆蟲(chóng)吮吸血膜，干后應(yīng)及時(shí)裝入標(biāo)本盒并蓋嚴(yán)，新的木制標(biāo)本盒需敞開(kāi)放置一段時(shí)間，讓木醇揮發(fā)后才能使用，以免厚血膜紅蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。第9頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五制作血膜的注意事項(xiàng)3.血膜讓其自然干燥，切忌用太陽(yáng)曬或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天標(biāo)本盡可能24~48小時(shí)內(nèi)固定染色；冬天也不能超過(guò)72小時(shí)。放置時(shí)間越久，厚血膜越不易脫血，染色效果也差。若不能及時(shí)染色，膜血膜宜先用甲醇固定（1~3分鐘）然后用過(guò)濾清水對(duì)厚血膜溶血，晾干固定后裝入盒內(nèi)蓋嚴(yán)，待以后染色。第10頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五血片的染色

（一）染液的種類(lèi)及染色原理染液種類(lèi)：目前所用的血片染色液，雖然名稱(chēng)很多，但都是從羅門(mén)諾夫斯基氏創(chuàng)造的染液變化過(guò)來(lái)的?？偟目煞譃樗芤汉途凭芤簝纱箢?lèi)，前者包括羅氏、西氏（Simon)、J.S.B氏染液等，后者包括利氏(Leishman)、瑞氏和吉氏染液等。這些染液中的主要染劑都包含美蘭、伊紅和由美蘭氧化所成的天青，所以稱(chēng)多色性染劑。第11頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五血片的染色

（一）染液的種類(lèi)及染色原理染色原理：伊紅是酸性水溶性鈉鹽，美蘭是堿性水溶性鹽酸鹽，當(dāng)它們各自溶化水中時(shí)，就離解為帶陽(yáng)電和陰電的離子。伊紅主要離解為酸性的陽(yáng)離子，在遇到堿性的蛋白質(zhì)如血紅蛋白、嗜伊紅白血球顆粒等即可結(jié)合成不易溶于水的沈淀物染成紅色。美蘭主要離解為堿性的美蘭離子，美蘭就與瘧原蟲(chóng)、淋巴和大單核細(xì)胞的胞漿、嗜堿性白細(xì)胞的顆粒等酸性蛋白質(zhì)結(jié)合染成蘭色。第12頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五血片的染色

（一）染液的種類(lèi)及染色原理染色原理：美蘭與伊紅都不能使原蟲(chóng)和白細(xì)胞的核著色，必須由天青作為媒介（染媒）才能使其著色。天青雖然也是堿性染劑，但又具有染媒作用，使原蟲(chóng)核和白細(xì)胞核等原來(lái)只能染上極淡蘭色的結(jié)構(gòu)染上顯著的酸性染劑伊紅，這樣，就使白細(xì)胞粗大的核染成顯著的既蘭又紅的紫蘭色，而較小或菲薄的原蟲(chóng)核和淋巴細(xì)胞原漿中的顆粒染成紫紅色。第13頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五血片的染色

（一）染液的種類(lèi)及染色原理注意：蛋白質(zhì)是二性電解質(zhì)，當(dāng)其處于較等電點(diǎn)為酸的溶液中時(shí)，便呈鹼的作用，即與酸或陰離子結(jié)合，這就說(shuō)明為何在染液偏酸時(shí)，伊紅的著色力強(qiáng)，使紅細(xì)胞著色鮮艷而淋巴細(xì)胞和原蟲(chóng)的胞漿著色不著；反之，蛋白質(zhì)在偏鹼的溶液中呈酸的作用而中和鹼基，也就說(shuō)明為何染液偏鹼時(shí)，紅細(xì)胞和嗜伊紅白細(xì)胞的顆粒等被染成紫蘭色。

伊紅在水溶液內(nèi)遇到美蘭或天青，即可互相化合而產(chǎn)生沈淀從而失去染色力，因此，吉氏母液絕對(duì)不能進(jìn)水。第14頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五血片的染色

（二）吉氏染液母液配置方法取吉氏粉0.5克置于研缽中，加少量甘油充分研磨，再加再磨，至25毫升加完為止，倒入60或100毫升帶有玻塞的有色玻瓶中。在研缽中加少量甲醇，洗去甘油濃液混入瓶?jī)?nèi)，至25毫升甲醇洗凈缽中甘油染液為止，塞緊瓶塞，充分搖勻，置于55~60℃水浴中或溫箱內(nèi)24小時(shí)或室溫內(nèi)3~5天，多加搖動(dòng)，即成原液。吉氏染液是目前較優(yōu)良的血膜染劑，即使在炎熱天氣中，亦可經(jīng)久不變。材料：1、吉氏粉0.5克2、甘油25毫升3、甲醇25毫升第15頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五血片的染色

（三）吉氏染液血片染色方法先用甲醇或無(wú)水酒精固定薄血膜，待干后進(jìn)行染色。亦可在固定薄血膜后用清水對(duì)厚血膜溶脫血紅蛋白，然后才進(jìn)行染色。

成批血片染色：將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入2%吉氏染液稀釋液（2毫升原液加中性蒸餾水98毫升稀釋均勻即成），同時(shí)對(duì)厚薄血膜染色30分鐘（如染液不合標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，得酌情增減染色時(shí)間），然后用清水輕輕將染液沖去，再用清水輕輕沖洗一次，干凈后將血片標(biāo)本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干鏡檢。第16頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五血片的染色

（三）吉氏染液血片染色方法先用甲醇或無(wú)水酒精固定薄血膜，待干后進(jìn)行染色。亦可在固定薄血膜后用清水對(duì)厚血膜溶脫血紅蛋白，然后才進(jìn)行染色。

單張血片染色：薄血膜經(jīng)固定干燥后，用2%吉氏染液稀釋液1~2毫升，滴入血片標(biāo)本上染色30分鐘左右，或用中性蒸餾水1毫升，加吉氏母液1~2滴，混合均勻后滴入血片標(biāo)本上，染色10~20分鐘，然后用清水輕輕將片上的染液沖洗干凈，晾干鏡檢。第17頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五影響染色效果的因素血片染色好壞除了與玻片是否清潔，血片制作質(zhì)量好壞等有關(guān)外，還受到以下幾個(gè)因素的影響：（1）染料溶劑的質(zhì)量染料、甲醇和甘油如果不純，常使配制的染液偏酸或偏堿而影響染色效果。因此必須用分析純的甲醇和中性甘油，而且在配制時(shí)所用的器具必須干凈而無(wú)水份。第18頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五影響染色效果的因素（2）染液的新舊新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力較弱且常呈現(xiàn)偏堿性。染液存放時(shí)間越久，染色力越強(qiáng)。通常在染液配制1~2周后才使用，盛裝染液的瓶子應(yīng)加塞蓋密。以防吸潮而影響染液質(zhì)量。第19頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五影響染色效果的因素（3）染液稀釋后使用時(shí)間吉氏和瑞氏染液的主要成份是美藍(lán)、伊紅和由美藍(lán)氧化產(chǎn)生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊紅遇到美藍(lán)和天青即產(chǎn)生沉淀。因此，必須在稀釋染液當(dāng)時(shí)使用，一般在半小時(shí)內(nèi)染色力最強(qiáng)。第20頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五影響染色效果的因素（4）染液的稀釋濃度染液的濃度高其著色就快而深，從而瘧原蟲(chóng)寄生紅細(xì)胞的薛氏點(diǎn)粗大顯著，但顏色常偏堿；染液濃度過(guò)低則染色時(shí)間久，顏色偏酸，薛氏點(diǎn)不明顯或消失。第21頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五影響染色效果的因素（5）染色時(shí)間染色時(shí)間長(zhǎng)染色效果好，反之較差。室溫高則著色快，染色時(shí)間可略縮短，氣溫低可適當(dāng)延長(zhǎng)。因此染色時(shí)間應(yīng)根據(jù)染液的質(zhì)量、新舊、稀釋濃度和氣溫而適當(dāng)增減。第22頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五影響染色效果的因素（6）染色用水染液的稀釋用水和染色后沖洗用水應(yīng)選擇Ph7.0~7.2清潔水，通常使用的新鮮的蒸餾水或過(guò)濾的冷開(kāi)水，以及自來(lái)水、井水、河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏堿，可用緩沖蒸餾水調(diào)整。染色后發(fā)現(xiàn)血膜顏色偏藍(lán)（偏堿）或偏紅（偏酸）時(shí)，可用與之相反的酸、堿度水沖洗血片予以糾正。第23頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五影響染色效果的因素（7）染色后不要直接將染液倒掉，應(yīng)沿玻片或染色缸邊緣加水使染液表面一層溢出，并輕輕沖洗，以免染液色素顆粒沾污血膜。第24頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五顯微鏡的一般構(gòu)造1.鏡座9.粗調(diào)節(jié)器17.濾光鏡圈2.鏡柱10.細(xì)調(diào)節(jié)器18.反光鏡3.鏡臂11.齒板4.傾斜度關(guān)節(jié)12.鏡臺(tái)5.鏡筒13.推動(dòng)器6.接目鏡14.彈簧夾7.旋轉(zhuǎn)盤(pán)15.聚光器8.接物鏡16.虹彩第25頁(yè)，共27頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)23分，星期五血片的鏡檢1.在學(xué)習(xí)鏡檢瘧原蟲(chóng)之前，必須先對(duì)正常厚薄血膜中各種血細(xì)胞的形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和染色性質(zhì)加以識(shí)別。2.學(xué)習(xí)鏡檢瘧原蟲(chóng)，首