產(chǎn)油真菌的誘變育種

產(chǎn)油真菌的誘變育種邵征超(浙江海洋學(xué)院數(shù)理?？葡?，浙江舟山316000)摘要介紹了產(chǎn)油真菌的產(chǎn)油機(jī)理，設(shè)計(jì)了產(chǎn)油真菌的誘變育種方法。關(guān)鍵詞產(chǎn)油真菌誘變育種微生物油脂MUTATIONBREEDINGOFFUNGIPRODUCINGOILSHAOzhengchao(ZhejiangOceanUniversity,ZhejiangZhoushan316000)ABSTRACTthispaperaimstointroducemechanismofproducingoilsfrommicroorganism,establishasimpleandpracticalmethodforscreeningfungiproducingoil.KEYWORDSfungiproducingoil;mutationbreeding;microbialoils1前言隨著石油資源的日益緊缺、石油價(jià)格的不斷上漲、油品供需矛盾的日漸顯現(xiàn)及環(huán)境污染問題的更加突出，多渠道開發(fā)可再生油脂資源成為必然。柴油是重要的油品.生物柴油具有能量密度高、含硫量低、燃燒充分、潤滑性好等優(yōu)良性能，還具有可再生、易生物降解、儲(chǔ)運(yùn)安全、抗爆性能好等特點(diǎn)，可作為優(yōu)質(zhì)的石化柴油代用品［1］。目前，國外用于生產(chǎn)生物柴油的原料主要是植物油，但原料成本占到總成本的70%?85%［2］,經(jīng)濟(jì)可行性差。產(chǎn)油微生物具有資源豐富、油脂含量高、碳源利用譜廣等特點(diǎn)，開發(fā)潛力大，所以微生物油脂具有良好的發(fā)展前景，可能在未來生物柴油產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮重要的作用。在適宜條件下.某些微生物產(chǎn)生并儲(chǔ)存的油脂占其生物總量的20%以上，具有這樣表型的菌株稱為產(chǎn)油微生物［3］。已知細(xì)菌、酵母、霉菌、藻類中都有能產(chǎn)生油脂的菌株.但以酵母菌和霉菌為主。微生物油脂(fMicrobialoils)又稱為單細(xì)胞油脂(Singlecelloil，SCO1)，是由微生物在一定的條件下，利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭鳛樘荚?，在菌體內(nèi)產(chǎn)生的大量油脂［4］。2微生物殘油脂機(jī)理微生物產(chǎn)油脂的過程，本質(zhì)上與動(dòng)植物產(chǎn)生油脂的過程相似，都是從乙酰CoA羧化酶的羧化催化反應(yīng)開始，經(jīng)過多次鏈的延長，或再經(jīng)去飽和酶的一系列去飽和作用等，完成整個(gè)生化過程［5］。其中去飽和酶是微生物通過氧化去飽和途徑、生成不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶，該過程稱之為脂肪酸氧化循環(huán)。微生物利用葡萄糖經(jīng)糖酵解或磷酸己糖等一系列途徑合成乙酰CoA［8］。乙酰CoA羧化酶催化脂肪酸合成的第一步，是第一個(gè)限速酶。去飽和酶的生物學(xué)功能是保證生物膜的正常功能，即提供生物膜必須的流動(dòng)性和基本的脂雙層結(jié)構(gòu)。在酵母和霉菌中存在的去飽和酶主要是?；o酶A去飽和酶(acyl.CoAdesaturase)(Macherel，1995)，它可將雙鍵引入到CoA結(jié)合的脂肪酸中。鐵離子參加了去飽和酶催化中心的構(gòu)成(咸漠，2000)，脂肪酸去飽和酶在脂肪酰鏈的特殊位置引入雙鍵，目前己發(fā)現(xiàn)在酵母和霉菌中存在A9、A12、A6、A15、A5位的去飽和酶，這些酶大多存在于細(xì)胞的微粒體上［9］。許多因素可影響去飽和酶的活性，如溫度、pH、離子、小分子有機(jī)物等。這些因素的改變可以影響脂肪酸的組成、含量、不飽和度等［10］。3影響微生物油脂合成的菌種因素不同的微生物.其產(chǎn)生油脂的含量及油脂肪酸組成均不相同。細(xì)菌、霉菌和酵母、藻類均能產(chǎn)油脂，其中以霉菌和酵母為主。表1[11]、表2[11]列舉了幾種微生物的產(chǎn)油脂情況。表1不同菌種在同樣培養(yǎng)條件下的油脂含量菌種菌絲體干質(zhì)it/g油脂質(zhì)it/g含油量.％黑曲霉5.5290.21813.94米曲霉1.24860.1512.01少根根霉2.6690.715226.5紅酵母0.5060.30657.73釀酒酵母1.2320.39532.06表2不同菌種的脂肪酸組成釀酒酵母脂肪酸黑曲霉米曲霉少根根霉紅酵母C14:00.51.60.20.31C15：00.50.50.71Cl6：019.323.31810.47.6Cl6：l1.6850.14C17:04.23.21.94Cl8：06.98.36.610.843.08Cl8：l40.728.731.652.2529.84C18:231.630.832.842.941.944試驗(yàn)材料與方法入4.1實(shí)驗(yàn)材料A4.1.1菌株A本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。FR3,刺抱小克銀漢霉（Cunninghamellaechinulata）；AAGEDm59、AGEDm95為菌株AGED激光誘變A株，多形單毛抱（MonoblepharispolymorphaComu）。A其中FR37-?][麻酸含量、AGEDm59花生四稀酸含A量、AGEDm95二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量A較高。A4.1.2實(shí)驗(yàn)儀器A超凈工作臺(tái)、格蘭氏微波爐、索氏抽提器、粉碎機(jī)、電子天平；A氣相色譜儀：福立9790氣相色譜儀，CT-IA氮、A氫、空氣發(fā)生器（武漢科林分析技術(shù)研究所），GPI一2A氣體凈化器（福立儀器）。A4.1.3試驗(yàn)試劑A乙醚、石油醚、苯、甲醇、氫氧化鉀；AGLA甲脂、AA甲脂、EPA甲脂及DHA甲脂標(biāo)準(zhǔn)A品購白Sigma公司，其他試劑均為分析純。4.1.4培養(yǎng)基A斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基；種子和發(fā)酵培養(yǎng)基A為PDY液體培養(yǎng)基。4.2試驗(yàn)方法a4.2.1抱子懸液的制備AFR3取7天種齡、AGEDm59、AGEDm95取l0A天種齡的斜面菌株，用無菌水洗下抱子（并用接種針輕A刮表面），F(xiàn)R3配成10一、AGEDm59、AGEDm95配A成l0。濃度的抱子液。4.2.2誘變及保種A紫外誘變：先打開紫外燈照射30min,取0.5ml抱A子懸液到倒好DPA固體培養(yǎng)基的平皿中，涂布均勻，A放在紫外燈下（紫外燈為25W，照射距離為35cm）A照射，之后置于25°C避光24h培養(yǎng)。隨機(jī)挑取單菌落A于斜面中保存。微波誘變［12］：由于微波照射會(huì)產(chǎn)生熱效應(yīng)，因此在進(jìn)A行微波誘變時(shí)采用了間歇性照射，即先照射一段時(shí)A間后進(jìn)行冷卻，再照射，照射時(shí)間為各次照射時(shí)間的A累加。250mi三角瓶裝100ml經(jīng)過活化的抱子懸液（即A先在150r/min的搖床上振蕩5h），用中等強(qiáng)度功率A照射，每次照射的時(shí)間為10秒，隨機(jī)挑取的誘變株都A保存于斜面中。4.2.3菌絲培養(yǎng)和收獲A把長好的誘變株從斜面轉(zhuǎn)到500ml三角瓶中（內(nèi)A裝200m1PDY液體培養(yǎng)基），置于25C中150轉(zhuǎn)/分鐘A搖床上培養(yǎng)。FR3培養(yǎng)4天，AGEDm59、AGEDm95A培養(yǎng)6天后下樣，用濾布過濾獲得濕菌絲體［13］。將所得A濕菌絲體在36C烘箱內(nèi)烘干，稱重，計(jì)算生物量。4.2.4油脂提取及甲脂化A將干菌體粉碎，并用脫脂濾紙包好，用100ml乙A醚在43?C進(jìn)行索氏提取6h，回收溶劑，用N2吹走殘A留溶劑稱重，計(jì)算粗油脂量。4.2.5氣相色譜分析條件A色譜柱：FFAP交聯(lián)石英毛細(xì)管柱（0.25mmx0.25Apmx30m）；檢測器：氫火焰檢測器（FID）；載氣：N2（流量60mLlmin）：溫度：進(jìn)樣器溫度160C，檢測器溫A度240C；柱溫：160C升至200C（8C/rnin），繼續(xù)升A至220C（2C/min），恒溫7min，降至160C。4.2.6多不飽和脂肪酸含量分析A用微量進(jìn)樣器吸取l上層清液進(jìn)樣分析，對照A標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間進(jìn)行定性，由面積歸一化法確定相對A百分含量。5產(chǎn)油真菌展望產(chǎn)油微生物除可代替動(dòng)植物油脂生產(chǎn)食用油脂.特別是保健類功能性油脂外，還可以作為生產(chǎn)生物柴油的油源。生物柴油由各種動(dòng)、植物油脂經(jīng)酯化或轉(zhuǎn)酯化工藝而得，而大部分微生物油的脂肪酸組成和一般植物油相近，以C和C系脂肪酸，如油酸、棕櫚酸、亞油酸和硬脂酸為主，因此微生物油脂可替代植物油脂生產(chǎn)生物柴油。由于技術(shù)經(jīng)濟(jì)原因.過去單細(xì)胞油脂很少有規(guī)?；a(chǎn)的報(bào)道。但隨著工業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展，微生物油脂發(fā)酵從原料到過程都在不斷取得新的進(jìn)展。最近美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL1的報(bào)告特別指出，微生物油脂發(fā)酵可能是生物柴油產(chǎn)業(yè)和生物經(jīng)濟(jì)的重要研究方向［14］。當(dāng)前生物柴油的研究已是世界科研的焦點(diǎn).世界各國紛紛根據(jù)本國國情選擇合適的油脂原料生產(chǎn)生物柴油.大多采用植物油脂制取生物柴油。植物油脂因生長周期長、占地面積大，不符合我國國情.因此油脂原料供給問題是我國生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。產(chǎn)油微生物具有資源豐富、油脂含量高、生長周期短、碳源利用譜廣、不受氣候限制等特點(diǎn)［15］，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。加快微生物油脂發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程.可為我國未來生物柴油產(chǎn)業(yè)化和油脂化工行業(yè)的健康發(fā)展提供保障。現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展使產(chǎn)油微生物的研究技術(shù)在不斷趨向成熟。微生物用于油脂工業(yè)已成為現(xiàn)實(shí).但隨著能源危機(jī)和環(huán)境保護(hù)問題的突出，其開發(fā)研究方向主要為：繼續(xù)尋找或改良高產(chǎn)油脂菌種；降低產(chǎn)油微生物培養(yǎng)成本，如利用廉價(jià)碳源等，促進(jìn)微生物油脂產(chǎn)業(yè)化；對微生物發(fā)酵產(chǎn)油脂工藝進(jìn)行優(yōu)化；微生物油脂替代植物油脂制取生物柴油，降低生物柴油制取成本。目前國際上對產(chǎn)油微生物甘油三酯生物合成和代謝調(diào)控機(jī)制的研究已取得重要進(jìn)展，如能通過基因工程和原生質(zhì)體融合，對現(xiàn)有菌種進(jìn)行改造，是獲得高產(chǎn)油脂菌株的一條好途徑。另外，深入研究微生物在產(chǎn)油脂時(shí)，碳源、氮源、碳氮比、溫度、pH值等因素對其的影響，有利于改進(jìn)發(fā)酵工藝，進(jìn)一步降低發(fā)酵成本，最大限度地發(fā)揮菌種產(chǎn)油脂的能力再者.需要繼續(xù)研究微生物油脂的提取純化技術(shù).為微生物油脂大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)[7]。因此，產(chǎn)油微生物的研究，特別是利用產(chǎn)油微生物生產(chǎn)油脂為生物柴油提供原料油脂方面的研究.對解決當(dāng)今世界各國油脂原料供應(yīng)問題、促進(jìn)生物柴油的推廣使用、解決環(huán)境問題和人類能源問題等都具有重要的意義。參考文獻(xiàn)TechnicalReport，NRER/TP一'580一24443，1998KSTyson.Biodieselresearchpmgress1992一1997.NRELJVGerpen.Businessmanagementforbiodieselproducers.NRELTechnicalReport，NREL/SR一'51036342，2004CRatledge.JPWynnThebiochemistryandmolecularbiologyoflipidaccumulationinokaginousMic^ganisEs.AdvApplMicrobio1.2002.5l：l?5l4顏治.陳晶微生物油脂及其開發(fā)利用研究進(jìn)展.糧食與油脂，2003(7):l3?l55薛飛燕.張栩等.微生物油脂的研究進(jìn)展及展望生物加工過程，2005，3(1):23-276劉波，孫艷，劉永紅等.產(chǎn)油微生物油脂生物合成與代謝調(diào)控研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)報(bào)，2005，45(1)：153-1567易紹金，教授，產(chǎn)油微生物的研究及其應(yīng)用，中外能源，2006年4月，第11卷第2期8施安輝.谷勁松等.高產(chǎn)油脂酵母菌株的選育、發(fā)酵條件的優(yōu)化及油脂成分分析.中國釀造，1997(4)：10?l9楊建斌，油脂化工/生物柴油專家，生物油脂10董欣榮，曹健，微生物功能性油脂的研究，鄭州糧食學(xué)院學(xué)報(bào).1999，20(4):10~111李小松，俞揚(yáng)帆.微生物油脂.食品科技.1997(5):8?912李永泉《微波學(xué)報(bào)》2001第1期-萬方數(shù)據(jù)13周而勛楊媚李琳曾偉達(dá)《華南農(nóng)業(yè)