病理組織切片的制作

病理組織切片的制作盧文麗吳中華方肇勤（2007/01/04）一、 器材（按一小組，約4-6人）眼科鑷：直無勾10cm、彎無勾10cm各5把；組織鑷；12.5cm2把；眼科剪：直尖10cm4把；解剖剪：cr/14，4把；普通雙面刀片：10片/盒X1盒；染色架：5個；染色缸：1000ml，14-15個；切片盒：50片/盒乂3盒或100片/盒X2盒；37度、60度恒溫箱：各1個；磨砂載玻片：50片/盒X3盒；蓋玻片：100片/盒X2盒；廣口瓶：30ml或60mlx20個；滴管及配套吸頭：4個；玻璃漏斗：p903個；玻璃攪棒：2支普通粗孔大張濾紙：20張；p90mm玻璃培養(yǎng)皿：4個；中號普通毛筆：2支；燒杯：500ml、1000ml各1個；量筒：100ml、500ml、1000ml各1個；組織切片機及配套刀片：4臺；攤片用水浴鍋：2臺；生物切片石蠟：5盒，熔點：56-58^；電子天平：1臺；酒精燈：150ml,4臺；脫水籃：1-2個；打火機、標簽紙、鉛筆各一，卷筒紙、乳膠手套、口罩、醫(yī)用紗布足量。試劑苦味酸（2.4.6-三硝基苯酚）：30g/瓶X1瓶；37%?40%福爾馬林液：500ml/瓶X1瓶；冰醋酸：AR,500ml/瓶X1瓶；無水乙醇：AR,500ml/瓶X10瓶；二甲苯：AR,500ml/瓶X10瓶；hematoxylin蘇木色素（蘇木精）：10g/瓶X1瓶；酸性品紅（曙紅丫水溶）：25g/瓶X1瓶；碘酸鈉：AR,500g/瓶X1瓶；檸檬酸：AR,500g/瓶x1瓶；水合氯醛：AR,250g/瓶x1瓶;銨磯（ALNH（SO）-12HO）或鉀磯（ALK（SO）-12HO）：500g/瓶x1瓶蛋白甘油（甘油/雞蛋清=1/1）：50ml中性樹膠：100&/瓶乂2瓶。若中性樹膠過于粘稠，可與二甲苯按7/3的比例稀釋。蒸餾水：5000ml

三.實驗步驟（一）固定液、染色液的配置（1）Bouin氏液苦味酸飽和水溶液75ml37%?40%福爾馬林液25ml冰醋酸5ml苦味酸飽和溶液的濃度為100ml水中加1g苦味酸。（2）Mayer蘇木精液蘇木精1g蒸餾水1000ml銨磯或鉀磯50g碘酸鈉0.2g檸檬酸1g水合氯醛50g將蘇木精溶于蒸餾水內(nèi)（需要時可微熱），加入研細的明磯，搖震助溶（需要時再加溫），明磯溶解后，依次加入碘酸鈉、檸檬酸、水合氯醛等試劑。配制后即可供使用。（3）曙紅曙紅 0.5?1g蒸餾水 100ml混勻后過濾（二） 組織取材取舌、胸腺、脾、胃、肝、十二指腸等6種臟器。（三） 固定與修塊上午：取組織塊入Bouin氏液中，組織塊的直徑應小于7mm。下午：修塊，用雙面刀片將組織塊修剪成3?5mm3大小。若中午取材，則晚上修快。具體修塊方法如下表1：表1舌等6種組織修塊及包埋方法組織名稱修塊方法包埋方法舌在舌根隆起靠舌尖側切斷，分為四段，取前2/4段舌體近舌尖部朝下肝截取4mm3大小方形塊任一截面朝下脾截取中間4mm3大小方形塊截斷面朝下胃截取幽門部朝上長約5mm的胃胃竇部寬口朝下十二指腸靠近幽門部截取長約5mm的腸截斷面朝下胸腺截取5mm3大小方形塊任一截面朝下（四）脫水與透明在以下過程，要求經(jīng)?；蝿咏M織塊，以保證組織塊可以充分地與乙醇或二甲苯接觸，在每一步驟之后，要充分濾干組織塊，一般用筒紙吸干組織塊上的液體，以免影響其他液體的濃度，但要防止組織塊干燥。全過程約需要4.5h（270min）o1.75%乙醇 50minTOC\o"1-5"\h\z85%乙醇 50min95%乙醇（I） 30min95%乙醇 （II） 30min100%乙醇（I） 30min100%乙醇（II） 30min7 1/2二甲苯（乙醇與二甲苯等體積）20min二甲苯（I） 20min二甲苯（II） 10min（可依據(jù)透明效果而定）透明效果的判斷：如組織塊顏色加深透明，二甲苯溶液顏色透明，即表明脫水效果很好；如脫水不好，二甲苯溶液顏色會變混濁。使用過的酒精或二甲苯倒入燒杯里以便回收。（五） 浸蠟、包埋與修蠟塊浸蠟：可在脫水與透明進行時，將60。0恒溫箱打開，使大燒杯內(nèi)的石蠟充分溶解，待脫水與透明結束后，可將脫水籃整個或包裹在紗布內(nèi)的組織塊轉入充分溶解的石蠟里，于60°C恒溫箱放置120分鐘。包埋：包埋有多種器具，比較簡潔廉價的方法是采用紙盒?？稍诮灥耐瑫r將紙盒做好，包埋時將60C的石蠟倒入紙盒內(nèi)，然后用小鑷子將各組織塊按一定的順序排列好，使切面朝下。我們建議，不同組別的同一組織包埋于一個蠟塊中，以保證切片和染色條件一致，且以便讀片和比較。為防止倒入紙盒內(nèi)的石蠟底部立刻凝固，可將紙盒置于一玻璃板上（或大培養(yǎng)皿內(nèi)），然后將玻璃板置于80-90C左右熱水上，包埋時蠟盒底部要放平，做蠟塊的蠟要反復凍融較好。組織包埋方法可參見表2。修蠟塊：待紙盒內(nèi)蠟凝固后（若需要使蠟塊迅速凝固，可將包埋好的蠟塊置于4。。冰水混和物中）。將蠟塊取出，用刀片將其修成梯形，通常蠟塊大小視組織多少而定，為保證切片順利，組織塊與蠟塊邊緣之間的距離不得小于2mm。修剪下來的殘蠟應回收，以便再用。（六） 切片在載玻片上擦少量甘油蛋白?？傻伟氲胃视偷鞍子谳d玻片上，用手指充分抹勻，呈半干狀為佳。切片厚約4?8pm，通常厚約6gm，細胞小而密的組織如胸腺，可以切4?5pm，而細胞疏的組織，如下丘腦可切10pm。將切片在55C左右水浴中展開，展開程度以帶黃顏色的組織完全攤平為準。用涂有甘油蛋白的載玻片從水浴中撈取切片，斜放在木架上，立即放入37C烘箱中過夜，一般時間越長效果越好，以切片緊貼于載玻片上呈半透明狀為佳。每個組織塊撈片2張。過夜后，將載玻片置于玻片架上，進行下面的實驗。（七） 脫蠟、染色與脫水取出玻片架后，應將玻片架傾斜，以使載玻片上的試劑流盡，然后用筒紙將玻片架和載玻片下緣的試劑吸干，以免影響其他試劑的濃度。全過程約需要50min。脫蠟到水（1） 二甲苯（I） 15分鐘（2） 二甲苯（II） 15分鐘（3） 100%乙醇 2分鐘（4） 95%乙醇（I） 1分鐘（5） 95%乙醇（II） 1分鐘（6） 蒸餾水浸洗 1分鐘染色（7） 蘇木精 30秒鐘自來水沖洗1分鐘，但應注意不能用水直接沖在玻片上，以免沖走切片。(顯微鏡下觀察效果)伊紅(著色即可) 10秒鐘蒸餾水浸洗 1分鐘脫水95%乙醇(I) 1分鐘95%乙醇(II) 1分鐘100%乙醇 2分鐘二甲苯(I) 2分鐘二甲苯(II) 3~5分鐘封片將載玻片從玻片架上取下，滴加1~2滴中性樹膠，用眼科鑷夾住蓋玻片的一角，輕輕蓋上蓋玻片，讓中性樹膠沿著蓋玻片充分展開，之后傾斜載玻片，用筒紙將多余的中性樹膠吸干，同時注意避免有氣泡的產(chǎn)生，平放載玻片，室溫下長期保存。參考文獻：杜卓民主編.實用組織學技術［M］.第2版，北京:人民衛(wèi)生出版社,1998［英］C.F.A卡林著，孔慶雷譯［M］.組織病理學和組織化學技術手冊.北京:科學出版社,1982附：中醫(yī)學綜合實驗病理組織切片制作時刻表組織取材、固定：第1天上午或中午組織修塊、固定：第1天下午或晚上組織脫水、透明、浸蠟、包埋、切片：第2天全天TOC\o"1-