轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)

轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)xxx公司轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計(jì)，管理制度轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)研究進(jìn)展摘要：轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)是最近發(fā)展起來的利用細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，它是以動(dòng)物體細(xì)胞為受體，將目的基因以DNA轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入能進(jìn)行傳代培養(yǎng)的動(dòng)物體細(xì)胞，再以這些體細(xì)胞為核供體，進(jìn)行動(dòng)物克隆。與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因方法相比具有明顯的優(yōu)勢。本文概述了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的缺陷、轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)的優(yōu)越性、研究概況以及目前存在的問題等。關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物克隆轉(zhuǎn)基因克隆引言：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenicanimal)是指用人工方法將外源基因?qū)雱?dòng)物受精卵或早期胚胎細(xì)胞，使外源基因與動(dòng)物本身的基因組整合，并隨細(xì)胞的分裂而增殖，從而將外源基因穩(wěn)定地遺傳給下一代的工程化動(dòng)物。[1]在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為當(dāng)今生命科學(xué)中一個(gè)發(fā)展最快、最熱門的領(lǐng)域正在改變著生物醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)、生物材料，甚至是整個(gè)生命科學(xué)的研究與發(fā)展面貌的時(shí)代背景下，如何高效率低成本的生產(chǎn)出所期望的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已成為科學(xué)界甚至商界關(guān)注的熱點(diǎn)?？寺?cloning)是英語“clone”音譯，來源于希臘語“klon”[2]，原意是扦插枝條，即無性繁殖。動(dòng)物克隆指不通過精子和卵子受精過程而獲得與親本具有相同遺傳物質(zhì)后代的過程。由于細(xì)胞核移植是產(chǎn)生克隆動(dòng)物的有效方法，所以在一般情況下人們往往把它稱為動(dòng)物克隆技術(shù)。克隆技術(shù)的發(fā)展為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究應(yīng)用帶來了契機(jī)，兩者的結(jié)合既有迫切性又有必然性。而且，這種結(jié)合不僅僅是簡單的技術(shù)疊加，而是技術(shù)的重組、綜合和優(yōu)化[3]。轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物技術(shù)是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)與克隆動(dòng)物技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，它是以動(dòng)物體細(xì)胞(包括動(dòng)物成體體細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞等)為受體，將目的基因以DNA轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入能進(jìn)行傳代培養(yǎng)的動(dòng)物體細(xì)胞，再以這些體細(xì)胞為核供體，進(jìn)行動(dòng)物克隆。[3]轉(zhuǎn)基因技術(shù)與克隆技術(shù)結(jié)合，創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物，已經(jīng)成為本世紀(jì)培育遺傳工程動(dòng)物的主導(dǎo)性技術(shù)途徑。轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)作為一種高效而低成本生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)已經(jīng)為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)帶來了新的契機(jī)。本文概述了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的缺陷、轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)的優(yōu)越性、研究概況以及目前存在的問題等。1.動(dòng)物傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)概述現(xiàn)代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究始于20世紀(jì)80年代初。1980年，Gordon等首次報(bào)道用顯微注射法獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。1982年，Palmiter等將大鼠生長激素基因?qū)胄∈笫芫训男坌栽酥校@得了個(gè)體比對照鼠增大一倍的“超級小鼠”，從此揭開了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的新篇章[1，4]。先后出現(xiàn)了顯微注射法、反轉(zhuǎn)錄病毒載體法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法、精子載體法等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)技術(shù)。但是由于這幾種方法都各自存在一些缺點(diǎn)，所以在技術(shù)上制約了轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的發(fā)展速度，現(xiàn)分述如下。顯微注射法存在轉(zhuǎn)基因的整合是隨機(jī)的，因此整合的位點(diǎn)、拷貝等均難以精確控制。同時(shí)隨機(jī)整合也可造成較嚴(yán)重的插入突變，影響受體動(dòng)物基因組的其他結(jié)構(gòu)和功能，無法滿足精確修飾的要求。反轉(zhuǎn)錄病毒載體法只能通過嵌合體途徑獲取純系轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)周期長;目的基因不能超過100kb;由于含有病毒DNA，可能會(huì)出現(xiàn)病毒自身復(fù)制和表達(dá)的現(xiàn)象，安全性令人擔(dān)憂。胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法適用物種少[5，6]，只能適用于已建立了真正的ES細(xì)胞系的小鼠。此外動(dòng)物育種需經(jīng)過嵌合體途徑，受ES細(xì)胞的生殖嵌合能力以及交配機(jī)率的影響，實(shí)驗(yàn)周期較長。精子載體法和"受精卵顯微注射"途徑一樣具有目的基因整合的隨機(jī)性和無法早期驗(yàn)證修飾事件等不足之處。上述幾種轉(zhuǎn)基因技術(shù)中常用的方法的不足的確在技術(shù)上制約了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在各個(gè)方面的應(yīng)用范圍，總的來說轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在以下問題：(1)整合和表達(dá)效率低用顯微注射法一次可向一個(gè)卵中注射幾百個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝，但總是單位點(diǎn)整合或單位點(diǎn)多拷貝整合，Hochic等[7]研究了顯微注射法的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物總效率為%，田小利等[8]對大鼠的統(tǒng)計(jì)結(jié)果陽性率為%，總效率為1%。說明轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的總效率很低。轉(zhuǎn)基因的整合還可造成宿主細(xì)胞基因的突變，導(dǎo)致四肢畸形、死胎、木乃伊等現(xiàn)象的發(fā)生。(2)轉(zhuǎn)基因的遺傳率低許多研究表明，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其后代并不能夠保證外源基因世代傳遞，外源基因整合后容易從基因組型中消失，并不能在任何情況下連續(xù)傳代。只有單位點(diǎn)整合才能以孟德爾方式遺傳[9]。(3)生產(chǎn)成本高由于基因整合與表達(dá)效率較低，生產(chǎn)一頭有用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，需用大量供體和受體動(dòng)物，涉及很高的研究費(fèi)用，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)業(yè)化受到很大限制。據(jù)Wall等[10]計(jì)算，生產(chǎn)一頭祖代轉(zhuǎn)基因豬需花費(fèi)萬美元，生產(chǎn)一頭轉(zhuǎn)基因牛需要50萬美元。如果用體外成熟和體外授精方法，成本約可降低1/3。2.轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的優(yōu)越性轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的可行性和優(yōu)越性在于它直接以胎兒體細(xì)胞為轉(zhuǎn)基因受體細(xì)胞，繼而以轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞為核供體制作轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物。其采用簡便的體細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)實(shí)施目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)移，可以避免家畜生殖細(xì)胞來源困難和低效率。同時(shí)，采用轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞系，可以在實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行轉(zhuǎn)基因整合預(yù)檢，減少了受體動(dòng)物的數(shù)目，不需要用受體母畜來承擔(dān)那些非轉(zhuǎn)基因的胚胎。同時(shí)，可事先在細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移和對陽性細(xì)胞進(jìn)行篩選，簡化了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的許多環(huán)節(jié)，節(jié)約了人力，具有很大的優(yōu)越性。另外，結(jié)合胚胎性別鑒定技術(shù)可以通過鑒別核供體的核型而預(yù)先得知轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的性別，從而選擇性地制備雌性的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，有利于外源基因在母乳中的表達(dá)以使生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物獲得期望的性狀。用轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率提高了。這是因?yàn)橛米骱斯w的細(xì)胞是確證整合了某一外源結(jié)構(gòu)基因的細(xì)胞，一旦核移植成功，就意味著得到了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。3.轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)的研究概況轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)在國外的發(fā)展自從多莉誕生的近十年來，轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)不斷的被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的的制作，并且越來越向服務(wù)于人類服務(wù)于生產(chǎn)靠近。1997年，第一只成年體細(xì)胞克隆綿羊“多莉”誕生后不久，Wilmut研究小組[11]于1997年6月報(bào)道用胚胎細(xì)胞為核供體，獲得了表達(dá)治療人血友病的凝血因子IX轉(zhuǎn)基因克隆綿羊“波利”(Polly)，由此第一只轉(zhuǎn)染了人凝血因子IX基因的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊也順利誕生。1998年，Cibelli等[12]成功制備出轉(zhuǎn)LacZ基因的克隆牛。1999年，Baguisi等[13]用含人抗凝血酶基因的山羊胎兒體細(xì)胞進(jìn)行核移植，得到了三只轉(zhuǎn)基因克隆山羊，經(jīng)誘導(dǎo)泌乳證明能高效表達(dá)人抗凝血酶，首次證實(shí)含外源基因的山羊胎兒細(xì)胞能克隆得到轉(zhuǎn)基因的個(gè)體，為轉(zhuǎn)基因克隆法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊展示了廣闊的前景。2000年McCreath等[14]報(bào)道了世界上第一只基因打靶克隆綿羊的誕生，為特定基因修飾的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究帶來了全新的方法。2001年，曾經(jīng)參與克隆小羊多利的英國PPL醫(yī)療公司4月宣布，該公司研究人員成功地培育出5只轉(zhuǎn)基因克隆豬。這是人類首次培育出轉(zhuǎn)基因克隆豬，標(biāo)志著異種器官移植研究又向前邁進(jìn)了重要的一步。同年，Denning等[15]成功制備出滅活了原蛋白基因〔PrP)、α-1，3半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因(GGTA1)的克隆綿羊。2002年，Dai等[16]以及Lai等[17]獲得了滅活了α-1，3半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因(GGTA1)的克隆豬。特別是Lai等[17]通過兩次核移植制備出完全滅活兩條α-1，3半乳糖轉(zhuǎn)移酶等位基因的克隆豬，向著為人類提供異種器官的目標(biāo)邁出了堅(jiān)實(shí)的一步。轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)在我國的發(fā)展在多莉誕生之后，我國的科學(xué)家奮起直追。2002年，成勇等[18]用成年轉(zhuǎn)基因山羊的成纖維細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞克隆得到轉(zhuǎn)基因克隆山羊，首次證實(shí)含外源基因的成年山羊體細(xì)胞也能克隆得到個(gè)體。鄒賢剛、成勇等[19]用轉(zhuǎn)染了外源基因(neo)的山羊胎兒成纖維細(xì)胞克隆得到5只轉(zhuǎn)基因克隆山羊，并且在克隆羊的體細(xì)胞中仍能檢測到外源基因(neo)的表達(dá)。經(jīng)過不懈努力，2003年，李寧等[20]的實(shí)驗(yàn)室培育出了轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆?！皹吠蕖焙汀皫r娃”。其中，“巖娃”創(chuàng)造了兩個(gè)世界紀(jì)錄：一是首次轉(zhuǎn)有人巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因，使轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆牛的牛奶，可望成為一種口服液用于治療或預(yù)防人類胃潰瘍疾病；二是首次在同一頭牛中轉(zhuǎn)有3種外源基因。在世界上首次克隆出了轉(zhuǎn)巖藻糖基因，轉(zhuǎn)人乳鐵基因，轉(zhuǎn)溶菌酶基因。之后龔國春等以不同類型的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為核供體生產(chǎn)牛的轉(zhuǎn)基因克隆胚胎。2004年，龔國春等[21]又利用轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)成功的獲得了轉(zhuǎn)基因牛。2005年，張運(yùn)海，潘登科等[22]利用轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)生產(chǎn)了表達(dá)綠色熒光蛋白的豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎。2006年，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉忠華教授帶領(lǐng)的課題組[23]成功培育出我國首例綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬，是世界上繼美國、韓國、日本之后的第四例成功通過轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)生產(chǎn)出的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因豬。4.轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)目前存在的問題轉(zhuǎn)基因的供體細(xì)胞核是否會(huì)影響核移植效果關(guān)于外源基因?qū)艘浦彩欠裼杏绊懀煌膶?shí)驗(yàn)得出的結(jié)論不同。有報(bào)道稱，轉(zhuǎn)入的外源基因?qū)ε５捏w細(xì)胞核移植有負(fù)面影響[[24，25]。而Rohet等人[26]報(bào)道，將轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋白基因(GFP)的牛胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行核移植時(shí)，重構(gòu)胚的體外發(fā)育等情況與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無差異。外源基因在制備的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)效果不一在已制備的轉(zhuǎn)基因克隆山羊中，外源基因的表達(dá)效果也不相同。Baguisi等[12]用轉(zhuǎn)基因山羊F代的胎兒體細(xì)胞克隆得到個(gè)體，外源基因的表達(dá)量與其F1代轉(zhuǎn)基因山羊的表達(dá)量相似。Keefer等[27]將綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染到山羊胎兒成纖維細(xì)胞中，并克隆得到一只轉(zhuǎn)基因克隆山羊，可是，在轉(zhuǎn)基因克隆山羊的細(xì)胞中不能直接檢測到綠色熒光蛋白基因的表達(dá)。鄒賢剛、成勇等[28]用轉(zhuǎn)染了neor基因的山羊胎兒成纖維細(xì)胞克隆得到轉(zhuǎn)基因克隆山羊，并在其細(xì)胞中檢測到neor基因的表達(dá)。5.展望轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物技術(shù)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究開發(fā)已成為當(dāng)今動(dòng)物克隆技術(shù)最重要的應(yīng)用方向之一。轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)是21世紀(jì)創(chuàng)建遺傳工程動(dòng)物的主導(dǎo)性技術(shù)，對該技術(shù)的研究可以迅速實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用推廣和產(chǎn)業(yè)化。但是由于轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)還存在著上述幾方面的問題，對于如何解決這些問題，更好的利用轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)高效而低成本的獲取期望的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將會(huì)是今后轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)走向成熟化要解決的首要問題，這些問題也將會(huì)是21世紀(jì)研究領(lǐng)域爭論的熱點(diǎn)。參考文獻(xiàn)：[1]陸得如,陳永青主編.2002.基因工程.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,121～122[2],JM.Alexander,AR.Willianm,etal.HumanfactorIXtransgenicsheepproducedbytransferofnucleifromtransfectedfetalfibroblasts.Science,1997,278:2130～2133.[3]張福德，王建榮.轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物研究[Pl.生物技術(shù)通報(bào)，1999,4:16～18.[4]劉建忠,李寧,丁翔等.1998.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究進(jìn)展,農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),6(3):269～276[5]林莉,胡佐忠.2005.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的研究進(jìn)展.畜禽業(yè),(5):20～23[6]李麗立,楊坤明主編.2002.現(xiàn)代生物技術(shù)與畜牧業(yè).北京:科學(xué)出版社,1930[7]HochiSI,NinomiyaT,HonmaM,etal.SuccessfulproductionoftransgenicBiotech.1990;1:175～184.[8]田小利,陳蘭英.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中存在問題.生物工程進(jìn)展,PROGRESSINBIOTECHNOLOGY.1995.～44

.[9]PalmiterRDBR,HammerRE,TrumbauerME,etal.Dramaticgrowthofmicethatdevelopfromeggsmicroinjectedwithmetallothionein-growthhormonefusiongenes.Nature1982;300:611～615.[10]RobertJ.Wall..ProductsofRecombination.Science1January1993259:109[11]SchniekeAEKA,RitchieWA,MycockK,etfactorIXtransgenicsheepproducedbytransferofnucleifromtransfectedfetalfibroblasts.Science.1997;278:2130-2133.[12]CibelliJBSS,GoluekePJ,KaneJJ,etal.Clonedtransgeniccalvesproducedfromnonquiescentfetalfibroblasts.Science.1998;280:1256-1258.[13]BaguisiABE,MelicanDT,PollockJS,etal.ProductionofgoatsbysomaticcellnuclearBiotechnol.1999;17:456-461.[14]McCreathKJHJ,CampbellKH,ColmanA,etal.Productionofgene-targetedsheepbynucleartransferfromculturedsomaticcells.Nature2000;405:1066-1069.[15]DenningCBS,AinslieA,BrackenJ,etal.Deletionofthealpha(1,3)galactosyltransferase(GGTA1)geneandtheprionprotein(PrP)geneinsheep.NatBiotechnol.2001;19:559-562.[16]DaiYVT,BooneJ,ChenSH,etal.Targeteddisruptionofthealphagalactosyltransferasegeneinclonedpigs.NatBiotechnol.2002;20:251-255.[17].LaiLK-SD,ParkKW,CheongHT,etal.Productionofalpha-deficientpigs.Science2002;299:411-414.[18]成勇，王玉閣，羅金平，等.由成年轉(zhuǎn)基因山羊體細(xì)胞而來的克隆山羊.生物工程學(xué)報(bào)2002;18:79-83.[19]ZouXWY,ChengY,YangY,etal.Generationofclonedgoats(Caprahircus)fromtransfectedfoetalfibroblastcells,theeffectofdonorcellcycle.MolReprodDev.2002;61:164-172.[20]龔國春,戴蘊(yùn)平,樊寶良,等.以不同類型的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為核供體生產(chǎn)牛的轉(zhuǎn)基因克隆胚胎.中國科學(xué),C輯,2003,33(6):532-538[21]龔國春((2004)利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因牛.[博士學(xué)位論文]中國農(nóng)業(yè)大學(xué)[22]張運(yùn)海，潘登科等.利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)表達(dá)綠色熒光蛋白的豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎.中國科學(xué)C輯生命科學(xué)2005,35(5):439-445[23]黑龍江日報(bào).2006年12月27日[24]Arats,Gibbons,J.,Rzucidlo,s.,etal.Invitrodevelopmentofbovinenucleartransferembryosfromtransgenicclonallinesofadultandfetalfibroblastcellsofthesamegenotype.BiolReprod.2002;66:1768-1774.[25]ZakhartchenkoV,Mueller,S.,Alberio,R.,etal.Nucleartransfer