分子遺傳學(xué)要點(diǎn)總結(jié)

第一章.理解Genomes,Transcriptomes和Proteomes三個(gè)名詞，并闡明它們?cè)诨蚪M表達(dá)過(guò)程中是如何聯(lián)系在一起的；Genomes：基因組（Genome）：由德國(guó)漢堡大學(xué)威克勒教授于1920年首創(chuàng)，指生物的整套染色體所含有的全部DNA或RNA序列?；蚪M是地球上每一物種具有的生物學(xué)信息的存儲(chǔ)庫(kù)?；蚪M學(xué)（Genomics）：由羅德里克于1986年首創(chuàng)，指研究生物的整個(gè)基因組，涉及基因組作圖、測(cè)序和功能分析的一門學(xué)科。Transcriptomes：基因組表達(dá)的最初產(chǎn)物是轉(zhuǎn)錄組，即那些含有細(xì)胞在特定時(shí)間所需生物信息、編碼蛋白質(zhì)的基因衍生而來(lái)的RNA分子的集合。轉(zhuǎn)錄組中的RNA分子以及其他來(lái)自非編碼基因的RNA都由轉(zhuǎn)錄過(guò)程產(chǎn)生。Proteomes：基因組表達(dá)的第二個(gè)產(chǎn)物是蛋白質(zhì)組，即細(xì)胞中那些決定細(xì)胞能夠進(jìn)行生化反應(yīng)的所有蛋白質(zhì)組分。這些蛋白質(zhì)是通過(guò)翻譯那些組成轉(zhuǎn)錄組的mRNA分子而合成的。蛋白質(zhì)組包括了在特定時(shí)間存在于細(xì)胞中的所有蛋白質(zhì)。闡明三者在基因組表達(dá)過(guò)程中是如何聯(lián)系在一起的？基因組所包含的生物信息的利用需要酶及其他參與基因組表達(dá)過(guò)程中一系列復(fù)雜生化反應(yīng)的蛋白質(zhì)的協(xié)同活性?；蚪M表達(dá)的最初產(chǎn)物是轉(zhuǎn)錄組，即那些含有細(xì)胞在特定時(shí)間所需生物信息、編碼蛋白質(zhì)的基因衍生而來(lái)的RNA分子的集合。轉(zhuǎn)錄組由轉(zhuǎn)錄過(guò)程來(lái)維持?；蚪M表達(dá)的第二個(gè)產(chǎn)物是蛋白質(zhì)組，即細(xì)胞中那些決定細(xì)胞能夠進(jìn)行生化反應(yīng)的所有蛋白質(zhì)組分。這是通過(guò)翻譯過(guò)程來(lái)完成的。Thegenometellsyouwhatcouldbehappenedtheoreticallyinthecell.Transcriptometellsyouwhatmightbehappened.Andtheproteometellsyouwhatishappening..掌握雙螺旋結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵特征；WatsonandCrick（1953）提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型：DNA分子通常以右手雙螺旋形式存在，兩條核苷酸鏈反向平行，且互為互補(bǔ)鏈；戊糖一磷酸骨架在分子的外鍘，在分子表面形成大溝和小溝，堿基堆積于螺旋內(nèi)部;堿基間通過(guò)氫鍵相互連接，A和T以2個(gè)氫鍵配對(duì)，G和C以3個(gè)氫鍵配對(duì)；螺旋中相鄰堿基間相隔0.34nm，每10個(gè)堿基對(duì)螺旋上升一圈，螺距為3.4nm，直徑為2.37nm。.正確區(qū)分編碼RNA和功能性RNA；.描述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同層次；蛋白質(zhì)和DNA分子一樣，是一個(gè)線性的無(wú)分支的多聚體。蛋白質(zhì)中的單體亞單位稱為氨基酸。氨基酸形成的多聚體或多肽在長(zhǎng)度上很少超過(guò)2000個(gè)單位。a.primarystructure氨基酸通過(guò)肽鍵連接成一條多肽鏈。b.secondarystructure指多肽采取的不同構(gòu)象，由不同氨基酸之間形成的氫鍵所穩(wěn)定。a螺旋；。片層c.tertiarystructure是將多肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)組分折疊成為三維構(gòu)型而形成的。d.quaternarystructure兩條或更多已形成三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈組合在一起形成一個(gè)多亞基蛋白質(zhì)。不是所有蛋白質(zhì)都有四級(jí)結(jié)構(gòu).掌握轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的一般研究方法，特別是SAGE技術(shù)、微陣列和基因芯片技術(shù)以及鑒定蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)（噬菌體展示、酵母雙雜交等）。轉(zhuǎn)錄組研究的方法通過(guò)序列分析研究轉(zhuǎn)錄組研究轉(zhuǎn)錄組最直接的方法是將其中的mRNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，并對(duì)所有cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序，再與基因組序列進(jìn)行比較分析。還可以借助第二、三代測(cè)序技術(shù)直接對(duì)RNA進(jìn)行測(cè)序?；虮磉_(dá)系列分析（Serialanalysisofgeneexpresion,SAGE）SAGE技術(shù)不是研究完整的cDNA，它產(chǎn)生長(zhǎng)度12bp的短序列，每一條都代表了轉(zhuǎn)錄組中存在的一種mRNA。技術(shù)基礎(chǔ)：412=16,777,216bp，真核mRNA平均1500bp，412相當(dāng)于11,000個(gè)轉(zhuǎn)錄物，這比最復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄組中存在轉(zhuǎn)錄物數(shù)目還多，因此12bp序列能夠代表某一種mRNA。F1是一種不常見(jiàn)的限制性內(nèi)切酶，它不在其識(shí)別序列內(nèi)部，而是在識(shí)別位點(diǎn)下游10-14個(gè)nt處切割。切下來(lái)的片段被收集起來(lái)，頭尾相連以產(chǎn)生一個(gè)串聯(lián)體，進(jìn)行測(cè)序分析。串聯(lián)體中的各個(gè)標(biāo)簽序列信息被讀取并與基因組中的基因序列比對(duì)，從而可以分析哪些基因被轉(zhuǎn)錄，表達(dá)水平如何。通過(guò)微陣列或芯片分析來(lái)研究轉(zhuǎn)錄組構(gòu)成轉(zhuǎn)錄組的mRNA總體被反轉(zhuǎn)錄成一個(gè)cDNA的混合物，然后被標(biāo)記，用于和芯片或微陣列雜交。優(yōu)點(diǎn)：可用于快速評(píng)估兩個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄組間的差異。Microarray:玻璃片，尼龍膜（PCR產(chǎn)物或cDNA）DNAchip:玻璃片，硅片（原位合成并固化的寡聚核苷酸）用不同的熒光來(lái)標(biāo)記cDNA樣品，微陣列與兩個(gè)樣品同時(shí)雜交，可以減少由于試驗(yàn)誤差引起的差異。蛋白質(zhì)組研究的方法A.蛋白譜（表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)）用來(lái)研究一個(gè)蛋白質(zhì)組組成的特定技術(shù)。蛋白譜基于兩項(xiàng)技術(shù)：蛋白電泳和質(zhì)譜a.雙向電泳：等電點(diǎn)：蛋白質(zhì)的凈電荷為零時(shí)溶液的PH值。b.MALDI-TOF（基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜）用于鑒定蛋白組中的蛋白質(zhì)，最多可以分析出50個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽，因此一個(gè)蛋白質(zhì)可以通過(guò)胰酶將其消化后進(jìn)行測(cè)定。一旦多肽片段被離子化，多肽的質(zhì)量/電荷比就可以通過(guò)它在質(zhì)譜儀中從電離源到檢測(cè)器的“飛行時(shí)間”來(lái)確定。通過(guò)質(zhì)荷比能夠確認(rèn)多肽片段的分子質(zhì)量。計(jì)算機(jī)中含有一個(gè)由所研究的物種基因組編碼的每一個(gè)蛋白質(zhì)經(jīng)胰酶消化后各個(gè)片段的預(yù)計(jì)相對(duì)分子質(zhì)量的數(shù)據(jù)庫(kù)，計(jì)算機(jī)通過(guò)比較數(shù)據(jù)庫(kù)與檢測(cè)到的多肽片段的分子質(zhì)量來(lái)確認(rèn)最可能的初始蛋白質(zhì)。B.蛋白質(zhì)印跡法（Western雜交）Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測(cè)定融為一體的特異性蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法。其原理是：生物中含有一定量的目標(biāo)蛋白。先從生物細(xì)胞中提取總蛋白或目標(biāo)蛋白，將蛋白質(zhì)樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)SDS電泳將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，再把分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉(zhuǎn)移到固相膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，以封閉其非特異性位點(diǎn)。然后加入特異性抗體（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結(jié)合后，再加入能與一抗專一性結(jié)合的帶標(biāo)記的二抗（通常一抗用兔來(lái)源的抗體時(shí)，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體），最后通過(guò)二抗上帶標(biāo)記化合物（一般為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶，或用同位素或生物素標(biāo)記）的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，從而可得知被檢生物細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的表達(dá)與否、表達(dá)量及分子量等情況。鑒定與某一蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)通過(guò)鑒定有相互作用的成對(duì)或成組的蛋白質(zhì)能夠獲得基因組活性相關(guān)的重要數(shù)據(jù)。構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用圖譜被視為是連接蛋白質(zhì)組學(xué)與細(xì)胞生物化學(xué)過(guò)程的一個(gè)重要步驟。噬菌體展示該技術(shù)采用了一種基于■噬菌體或某種絲狀噬菌體的獨(dú)特的克隆載體。待測(cè)基因被插入載體后，它的蛋白質(zhì)產(chǎn)物能與噬菌體外殼蛋白以融合形式表達(dá)。使用噬菌體展示庫(kù)來(lái)尋找與待測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的噬菌體。酵母雙雜交激活因子（轉(zhuǎn)錄因子）：一類控制基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。雙雜交系統(tǒng)使用缺乏某一報(bào)告基因相應(yīng)激活因子的釀酒酵母菌株，此時(shí)報(bào)告基因是不表達(dá)的。蛋白質(zhì)相互作用圖譜也叫蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，能展現(xiàn)一個(gè)蛋白質(zhì)組中各成員間發(fā)生的相互作用。第二章1.列舉用于DNA操作的不同類型酶的特征及主要作用；⑴末端修飾酶：改變DNA分子末端，為連接實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)增加可操作空間。A.末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶：屬于模板非依賴的DNA聚合酶。B.堿性磷酸酶：去掉DNA分子5端磷酸基團(tuán)，從而阻止這些分子連接到其他分子上。C.T4多聚核苷酸激酶：向DNA分子5端添加磷酸基團(tuán)，主要用于DNA分子的末端標(biāo)記。（2）DNA聚合酶:以現(xiàn)有DNA或RNA分子為模板合成DNA的酶，稱為（依賴模板的）DNA聚合酶。DNA聚合酶I（Kornberg聚合酶）：53聚合酶功能53外切功能35外切功能Klenow聚合酶：用枯草桿菌蛋白酶處理DNA聚合酶I,可獲得兩個(gè)片段，大片段的分子質(zhì)量約76kDa，保留聚合酶活性和35外切核酸酶活性，又叫Klenow片段。小片段的分子質(zhì)量約34kDa，具有53外切核酸酶活性。（3）核酸酶:外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶（4）DNA連接酶:通過(guò)DNA連接酶可以將限制性內(nèi)切核酸酶消化產(chǎn)生的DNA片段重新連接起來(lái)，或者連接到一個(gè)新的分子上。T4DNA連接酶：從T4噬菌體感染后的大腸桿菌細(xì)胞中提取。.說(shuō)明三種類型的限制性內(nèi)切酶切割DNA的方式；限制性內(nèi)切核酸酶在特定的位置切割DNA分子：按限制性內(nèi)切酶的組成、是否具有修飾酶活性以及切斷核酸的情況不同，限制酶可分為三類：I型，II型和III型。I和III型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的降解，但切割位置不固定。II型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的降解（無(wú)修飾酶活性），且具有識(shí)別位點(diǎn)的專一性和切割位點(diǎn)的專一性，一般在識(shí)別序列內(nèi)切割，不需要ATP提供能量，是重組DNA技術(shù)中常用的限制性內(nèi)切酶。細(xì)菌中三種不同類型的限制-修飾酶IIIIII酶分子雙功能不同酶雙功能識(shí)別位點(diǎn)兩部分/不對(duì)稱4-8bp回文結(jié)構(gòu)5-7bp不對(duì)稱切割位點(diǎn)非?；?gt;1000bpfromRS與識(shí)別位點(diǎn)同/附近識(shí)別位點(diǎn)下游24-26bpR&M相互排斥不在同一個(gè)分子中同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)ATP需要不需要需要.區(qū)分平端與粘端連接，并說(shuō)明如何提高平端連接的效率；粘性末端連接的高效率推動(dòng)了將鈍末端轉(zhuǎn)變成粘性末端方法的發(fā)展。一種方法是將稱為連接子（linker）或接頭（adaptor）的小雙鏈分子連接到鈍末端。?另一種方法是利用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行同聚物加尾，即在鈍末端的3’末尾一個(gè)接一個(gè)地添加核苷酸。.詳述克隆載體的主要特征；質(zhì)粒，噬菌體，人工染色體等，它們都含有復(fù)制起始位點(diǎn)。以大腸桿菌質(zhì)粒為基礎(chǔ)的載體pUC系列：pUC8,2.7kb，除了起始位點(diǎn)外，還攜帶氨芐青霉素抗性基因（pUC8的選擇性標(biāo)記）和hcZ基因（編碼■-半乳糖苷酶的一部分）。某些大腸桿菌菌株具有一個(gè)修飾的基因，該基因中缺失hcZ部分。建立在大腸桿菌噬菌體基因組基礎(chǔ)上的克隆載體最初嘗試著發(fā)展能操作大片段DNA分子的載體集中在九噬菌體上。九噬菌體存在兩種感染周期：裂解性感染周期；溶源性感染周期九噬菌體基因組大小為48.5kb，其中有15kb為隨意區(qū)域，可以被刪除而不影響噬菌體感染細(xì)菌的能力。據(jù)此，目前發(fā)明了兩種類型的載體：插入型載體：該載體中部分或全部隨意DNA被刪除，并在刪切后的基因組內(nèi)部的某些位點(diǎn)引入一個(gè)單一的限制性酶切位點(diǎn)。用插入型載體進(jìn)行克隆：九噬菌體基因組是一個(gè)線性分子，但其兩個(gè)末端具有12個(gè)核苷酸的單鏈突出，稱為cos位點(diǎn)。cos位點(diǎn)序列與九噬菌體的體外包裝密切相關(guān)。替代型載體：該載體中隨意DNA位于一填充片段內(nèi)，兩側(cè)有一對(duì)限制性酶切位點(diǎn)，當(dāng)要克隆的DNA連接到該載體時(shí)，這個(gè)區(qū)段就被取代。C.用于更長(zhǎng)DNA片段的載體a.考斯質(zhì)粒（cosmid）、黏粒具有九cos位點(diǎn)的質(zhì)粒，與九噬菌體一樣具有感染性。插入片段可高達(dá)44kb。b.酵母人工染色體（YAC）在YAC中，構(gòu)成這些染色體組件的DNA序列與一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記物，至少一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)連接起來(lái)，酶切位點(diǎn)是為了插入新的DNA，可用來(lái)克隆600-1400kb的片段。一些類型的YAC載體有插入不穩(wěn)定的問(wèn)題，即克隆的DNA重排形成新的序列組合。c.細(xì)菌人工染色體（BAC）是基于天然的大腸桿菌F質(zhì)粒構(gòu)建的；能夠克隆300kb及更長(zhǎng)的片段，并且插入的片段很穩(wěn)定；可以通過(guò)Lac篩選來(lái)鑒定重組體，是目前克隆大片段DNA最常用的載體。P1噬菌體載體與九載體相似，以天然噬菌體基因組的缺失形式為基礎(chǔ)；P1基因組比九基因組大，因此能克隆的DNA片段比九載體大；運(yùn)用目前的技術(shù)可以克隆長(zhǎng)達(dá)125kb的片段。P1衍生的人工染色體（PAC）綜合了P1載體和BAC的特點(diǎn)，具有克隆長(zhǎng)達(dá)300kb片段的容量。Fosmids包含F(xiàn)質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)和九載體的cos位點(diǎn)，有出現(xiàn)不穩(wěn)定問(wèn)題的傾向。5.列舉用于克隆長(zhǎng)片段DNA的載體，并評(píng)價(jià)每種載體的優(yōu)缺點(diǎn)；a.考斯質(zhì)粒（cosmid）、黏粒具有九cos位點(diǎn)的質(zhì)粒，與九噬菌體一樣具有感染性。插入片段可高達(dá)44kbb.酵母人工染色體（YAC）在YAC中，構(gòu)成這些染色體組件的DNA序列與一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記物，至少一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)連接起來(lái)，酶切位點(diǎn)是為了插入新的DNA，可用來(lái)克隆600-1400kb的片段。一些類型的YAC載體有插入不穩(wěn)定的問(wèn)題，即克隆的DNA重排形成新的序列組合。c.細(xì)菌人工染色體（BAC）是基于天然的大腸桿菌F質(zhì)粒構(gòu)建的；能夠克隆300kb及更長(zhǎng)的片段，并且插入的片段很穩(wěn)定；可以通過(guò)Lac篩選來(lái)鑒定重組體，是目前克隆大片段DNA最常用的載體。P1噬菌體載體與九載體相似，以天然噬菌體基因組的缺失形式為基礎(chǔ)；P1基因組比九基因組大，因此能克隆的DNA片段比九載體大；運(yùn)用目前的技術(shù)可以克隆長(zhǎng)達(dá)125kb的片段。P1衍生的人工染色體（PAC）綜合了P1載體和BAC的特點(diǎn)，具有克隆長(zhǎng)達(dá)300kb片段的容量。Fosmids包含F(xiàn)質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)和■載體的cos位點(diǎn)，有出現(xiàn)不穩(wěn)定問(wèn)題的傾向。6.描述如何進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR是一種在體外借助于DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)特定基因或DNA序列擴(kuò)增的方法。1983年，由美國(guó)西特斯公司穆利斯發(fā)明了該技術(shù)。參與PCR反應(yīng)體系的因素模板核酸：基因組DNA(genomicDNA,gDNA)，互補(bǔ)DNA(complementaryDNA,cDNA)。引物：16-30bp，四種堿基隨機(jī)發(fā)布，G+C%=40-60%,引物3端不能錯(cuò)配。DNA聚合酶：來(lái)自嗜熱水生古細(xì)菌，耐高溫，不具35外切酶活性。緩沖液Mg2+：與Taq酶的活性有關(guān)。dNTP(脫氧核糖核苷三磷酸)PCR儀：自動(dòng)升降溫，程序化。30個(gè)循環(huán)后能將目標(biāo)序列擴(kuò)增10億倍以上。PCR的局限性和應(yīng)用局限性：a.必需知道被擴(kuò)增DNA的邊界序列才能PCR，因此不能用來(lái)純化從未被研究過(guò)的基因片段。b.擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。一般擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)5kb的片段不會(huì)有太大困難，但要擴(kuò)增更長(zhǎng)片段存在麻煩。c.存在非特異性擴(kuò)增的問(wèn)題。主要是由于Taq酶缺少35外切酶的功能。應(yīng)用：基于PCR的分子標(biāo)記；臨床診斷；考古研究；基因表達(dá)分析(RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR)等。第三章.遺傳圖譜和物理圖譜的區(qū)別；遺傳圖譜：指應(yīng)用遺傳學(xué)技術(shù)(遺傳重組)構(gòu)建的能在基因組上顯示基因和其它序列特征位置的線性排列圖，反映了基因或標(biāo)記間的相對(duì)距離和順序。cM物理圖譜：指應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)直接分析DNA分子，從而構(gòu)建的能顯示包括基因在內(nèi)的序列特征位置的圖譜，它反映了基因或標(biāo)記間的實(shí)際距離。bp，kb，Mb.描述用于構(gòu)建遺傳圖譜的分子標(biāo)記，以及每種標(biāo)記是如何檢測(cè)的；DNA分子標(biāo)記：簡(jiǎn)稱分子標(biāo)記，指在DNA水平，具有相對(duì)差異的等位基因的DNA多態(tài)性標(biāo)記，是DNA水平上遺傳變異的直接反映。A.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)用限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA時(shí)，在同一種生物的不同個(gè)體間出現(xiàn)含同源序列的酶切片段長(zhǎng)度的差異。人的基因組中大約有105個(gè)RFLP。確定RFLP的兩種方法

SouthernhybridizationPolymorphicsite1%%RestrictionsitemapHybridizingbandsNylonmembraneFigureGenomes32GariajidSckhcje2007)NylonmembraneFigureGenomes32GariajidSckhcje2007)Autoradiograph酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CleavedAmplifiedPolymorphicSequencesCAPS)B.簡(jiǎn)單重復(fù)序列Simplesequencerepeat,SSR,Microsatellite微衛(wèi)星)指重復(fù)單位相對(duì)較小(2-6bp的基序)，由于重復(fù)單位數(shù)目的變化而形成的多態(tài)性。人的基因組中大約有5x105個(gè)SSR。SSR的檢測(cè)方法PCR+平板PAGE電泳PCR+毛細(xì)管電泳：引物需要熒光標(biāo)記，可獲得片段的準(zhǔn)確長(zhǎng)度。C.單核苷酸多態(tài)性(Simplenucleotidepolymorphism,SNP)基因組中的某些位點(diǎn)上，有些個(gè)體只有一個(gè)核苷酸與其它個(gè)體不同，這種分散在基因組中的單個(gè)堿基的差異就稱為SNP。人的基因組中大約有4x106個(gè)SNP;絕大多數(shù)SNP是雙等位基因；有的能形成RFLP，絕大多數(shù)不能。a.通過(guò)寡核苷酸雜交分析檢測(cè)SNP寡核苷酸是在試管中合成的長(zhǎng)度小于50bp的DNA分子，在高嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，寡核苷酸只有與待測(cè)DNA分子形成完全的堿基配對(duì)時(shí)，二者才能雜交；如果有一個(gè)堿基錯(cuò)配，雜交體會(huì)非常不穩(wěn)定，不能形成雜交信號(hào)。⑴DNA芯片技術(shù)：應(yīng)用面積為2cm2或更小的玻璃或硅質(zhì)晶片，在上面高密度的排列著許多寡核苷酸，待測(cè)DNA用熒光標(biāo)記后與芯片雜交，再用熒光顯微鏡檢測(cè)，發(fā)出熒光的表明寡核苷酸與待測(cè)DNA雜交上了。此方法在一次實(shí)驗(yàn)中可以檢測(cè)許多個(gè)SNP。(2)液相雜交技術(shù)：在微量滴定板的孔中進(jìn)行，每個(gè)孔中含有一種不同的寡核苷酸；寡核苷酸的一端與熒光染料連接，另一端與熒光淬滅復(fù)合物連接，且其兩個(gè)末端可以形成堿基配對(duì)；當(dāng)淬滅復(fù)合物與熒光染料相鄰時(shí)，無(wú)熒光發(fā)出；如果寡核苷酸與待測(cè)DNA能夠雜交，則會(huì)破壞環(huán)形結(jié)構(gòu)，此時(shí)淬滅復(fù)合物遠(yuǎn)離熒光染料，有熒光發(fā)出。b.通過(guò)耐擴(kuò)增突變系統(tǒng)檢測(cè)SNP(AmplificationRefractoryMutationSystem,ARMS)將SNP位點(diǎn)引入PCR引物端的最后一個(gè)堿基，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腜CR條件下，存在SNP的引物對(duì)不能擴(kuò)增出目的條帶。.描述用于遺傳作圖的群體，以及它們是如何構(gòu)建的；分離群體和收集的品種群體.掌握構(gòu)建物理圖譜的三種方法，特別是限制酶切圖譜的構(gòu)建方法和STS圖譜的構(gòu)建方法，并評(píng)價(jià)三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)；物理作圖的常用方法：1)限制性作圖(Restrictionmapping)：在DNA分子上定位限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的相對(duì)位置；A.限制性作圖的基本方法1)雙酶解(doubledigest)Key：分析重疊片段2)部分酶解+完全酶解：比較分析這兩種情況下的片段大小。3)末端標(biāo)記+部分酶解利用放射性的同位素標(biāo)記DNA的端或5端部分酶解放射自顯影多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsites,MCS)：指多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)簇，由許多限制酶切位點(diǎn)組成。MCS往往是人工合成的一段外源基因的插入部位的DNA序列。B.限制性作圖的規(guī)模受限于限制性片段的大小如果使用的限制酶在DNA上切點(diǎn)相對(duì)較少，構(gòu)建限制性圖譜就比較容易。限制性作圖更適用于小分子。如果DNA分子小于50kb，通常選用6堿基識(shí)別序列的限制性酶來(lái)構(gòu)建限制圖譜。對(duì)于大于50kb的DNA分子，可以選用稀有酶進(jìn)行構(gòu)建。稀有酶:選用識(shí)別序列為7或8堿基的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割。如：SapI(7)；SgfI(8)。選用識(shí)別序列所含基序在靶DNA分子中稀少的酶。如人類基因組中，5-CG-序列就比較稀少，如果選用NotI(5-GCGGCCGC-)進(jìn)行消化，平均約10Mb才有一個(gè)切點(diǎn)?？捎迷摷夹g(shù)構(gòu)建原核生物和低等真核生物(酵母和真菌)等染色體較小的生物的限制圖譜。限制性作圖不能用于大型基因組。如果用普通瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分離大片段DNA分子，電泳分辨率會(huì)大大降低。交變脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)：1984年，Schwartz和Centor發(fā)明；這項(xiàng)技術(shù)采用定時(shí)改變電場(chǎng)方向的交變電源，每次電流方向改變后持續(xù)1s到5min左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以稱之為脈沖式交變電場(chǎng)。正交變電場(chǎng)凝膠電泳(OFAGE)電場(chǎng)轉(zhuǎn)換凝膠電泳(FIGE)等高加壓均勻電場(chǎng)（CHEF）?兩對(duì)電極間的電場(chǎng)可以改變，每對(duì)電極與凝膠長(zhǎng)度方向成45度角；?電場(chǎng)的每次改變都迫使DNA分子重新排列，從而提高分辨率。2）熒光原位雜交（FISH）：將分子標(biāo)記與完整染色體雜交來(lái)確定標(biāo)記的位置；A.用熒光探針進(jìn)行原位雜交原位雜交是以標(biāo)記的DNA分子為探針，檢測(cè)完整染色體的一種雜交分析方法。用于原位雜交的探針的標(biāo)記要同時(shí)滿足高靈敏度和高分辨率兩個(gè)條件，非放射性的DNA熒光標(biāo)記技術(shù)能滿足這一要求?，F(xiàn)已設(shè)計(jì)出具有不同發(fā)光特性的熒光標(biāo)記物，可以將一組不同的探針與單個(gè)染色體雜交，并分辨出每種雜交信號(hào)，從而檢測(cè)出各探針的相對(duì)位置。在過(guò)去，探針必須是相當(dāng)長(zhǎng)的DNA的分子，通常至少是40kb的克隆片段；隨著熒光信號(hào)放大技術(shù)的應(yīng)用，現(xiàn)在最小可以檢測(cè)500bp的DNA片段。如果探針中含有一些重復(fù)序列，它可能會(huì)和染色體上的多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生非特異性雜交；因此，探針在使用前要和來(lái)自被研究組織中的未標(biāo)記DNA混合；用于混合的未標(biāo)記DNA可以是總的核DNA,但最好是富含重復(fù)序列的DNA片段。B.FISH應(yīng)用的局限性中期染色體是高度凝聚的，每條染色體都具有可識(shí)別的形態(tài)。使用中期染色體的缺點(diǎn)在于，由于它的高度濃縮的性質(zhì)，只能進(jìn)行低分辨率作圖，兩個(gè)標(biāo)記間至少相隔1Mb才能分辨出來(lái)。因此，中期染色體FISH主要用于確定新標(biāo)記在染色體上的大概位置，為更精細(xì)的作圖做準(zhǔn)備。操作較繁瑣，數(shù)據(jù)積累速度太慢。更精細(xì)作圖的兩種途徑：機(jī)械伸展的染色體：通過(guò)離心產(chǎn)生的剪切力可將染色體伸展到正常長(zhǎng)度的20倍，這樣分辨率可明顯提高，能夠區(qū)分出相隔200-300kb的標(biāo)記。非中期染色體：相比之下，分裂間期的染色體更為有用，因?yàn)榇藭r(shí)的染色體包裝程度最低，分辨率有可能達(dá)到25kb以下。但染色體形態(tài)特征消失，失去了定位探針位置所必需的外部參照位點(diǎn)。因此，一般在獲得粗略圖譜后，用該技術(shù)來(lái)確定染色體一小段區(qū)域內(nèi)一系列標(biāo)記間的順序。3）序列標(biāo)簽位點(diǎn)（STS）作圖：通過(guò)對(duì)批量的基因組片段進(jìn)行PCR和（或）雜交分析，來(lái)對(duì)短序列進(jìn)行定位作圖。用STS技術(shù)繪制物理圖是到目前為止最為有效的方法。STS其實(shí)只是基因組中任何單拷貝的短DNA序列，長(zhǎng)度在100-500bp,但要求序列已知且在染色體上有唯一的定位。要得到至少5套包含相關(guān)染色體或整個(gè)基因組的DNA片段（染色體上每一點(diǎn)平均有5個(gè)片段相對(duì)應(yīng)），然后用各個(gè)DNA片段做模板，用不同STS標(biāo)簽上的序列做引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選陽(yáng)性克隆。如果某兩個(gè)STS標(biāo)簽在基因組上靠的很近，它們同時(shí)出現(xiàn)在一個(gè)DNA大片段上的概率就會(huì)很大，反之就會(huì)很小。因此，可以根據(jù)兩個(gè)STS的分離頻率來(lái)計(jì)算它們間的圖距。只要有一定數(shù)量的STS標(biāo)簽，所有DNA大片段在染色體上的位置就能被確定下來(lái)，從而構(gòu)建由DNA大片段（YAC/BAC克?。┲丿B群組成的物理圖譜。現(xiàn)在已有包含22,582個(gè)STS的人類基因組物理圖，分辨率達(dá)到每136kb有一個(gè)STS標(biāo)簽。A.任何一個(gè)唯一的DNA序列均可作為STS一個(gè)DNA序列要成為STS,要滿足兩個(gè)條件：它的序列必須是已知的，以便于用RCR方法檢測(cè)該STS在不同DNA片段中存在與否；STS必須在擬研究的染色體或基因組上有唯一的定位。因此，需要確保STS不位于重復(fù)DNA區(qū)域。可以通過(guò)以下途徑獲得STS：表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）：通過(guò)對(duì)cDNA克隆測(cè)序獲得的短序列，代表了表達(dá)的基因的一部分。如果EST來(lái)自單一序列DNA，不是基因家族中的某一成員，可以被用作STS；簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性（SSLP）：如果將被遺傳定位的SSLP用作STS進(jìn)行物理定位，會(huì)很有價(jià)值,因?yàn)樗鼈兛梢栽谶z傳圖譜和物理圖譜間提供直接聯(lián)系；隨機(jī)基因組序列：通過(guò)對(duì)克隆的基因組DNA隨機(jī)小片段測(cè)序獲得。B.用于STS作圖的DNA片段群STS作圖必需的第二個(gè)要素是覆蓋擬研究的染色體或基因組5倍以上的DNA片段群（作圖試劑）。作圖試劑可以來(lái)自克隆文庫(kù)和放射雜交體組。a.克隆文庫(kù)可用于STS分析基因組計(jì)劃進(jìn)入測(cè)序階段的前提是將基因組或分離的染色體斷裂成片段,并將每個(gè)片段克隆到高容量載體中，這樣產(chǎn)生的一個(gè)克隆文庫(kù)，即DNA片段的集合，它可用于STS分析。利用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分離染色體熒光染色的染色體混合物通過(guò)一個(gè)小孔,使產(chǎn)生的每一個(gè)液滴只含有一條染色體；熒光探測(cè)器檢測(cè)到含有目標(biāo)染色體的液滴發(fā)出的信號(hào),并將一個(gè)電荷加到液滴上；當(dāng)液滴到達(dá)偏轉(zhuǎn)電板時(shí),帶電荷的液滴偏轉(zhuǎn)進(jìn)入收集器中?？寺∥膸?kù)用于STS作圖有一個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)，就是單個(gè)克隆即為可提供測(cè)序的DNA；來(lái)自STS分析的數(shù)據(jù)既可用作STS作圖，又可用于構(gòu)建克隆重疊群（clonecontig）；如果STS也包括已遺傳定位的SSLP，那么DNA序列、物理圖譜和遺傳圖譜就可以有機(jī)結(jié)合在一起。b.放射雜交體組可用于STS分析放射雜交體：利用高劑量的射線將供體細(xì)胞染色體打斷成若干小片段，再與近緣物種的受體細(xì)胞融合，形成放射雜交體；該方法由GossandHarris（1975,1977）最先提出，后又經(jīng)Benhametal.（1989）逐步完善，早期主要被用于人類及其它哺乳動(dòng)物高通量染色體圖譜的構(gòu)建。目前，放射雜交作圖已從最初僅適用于單條染色體作圖發(fā)展到全基因組作圖。放射雜交作圖是基于染色體上的兩個(gè)STS相距越近其通過(guò)斷裂分開(kāi)的頻率越低的原理，通過(guò)PCR方法研究細(xì)胞中供體的STS的分布，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的手段計(jì)算STS間的斷裂分離頻率，從而可以推算出STS間的距離和在染色體上的排列順序。使用PCR方法鑒定STS時(shí)，必需保證其只能從供體，而不能從受體基因組中擴(kuò)增出相應(yīng)片段。目前，在大麥、小麥、玉米、棉花中都有構(gòu)建放射雜交圖譜的報(bào)道。5.描述放射雜交體是如何產(chǎn)生的？放射雜交體：利用高劑量的射線將供體細(xì)胞染色體打斷成若干小片段，再與近緣物種的受體細(xì)胞融合，形成放射雜交體；該方法由GossandHarris（1975,1977）最先提出，后又經(jīng)Benhametal.（1989）逐步完善，早期主要被用于人類及其它哺乳動(dòng)物高通量染色體圖譜的構(gòu)建。目前，放射雜交作圖已從最初僅適用于單條染色體作圖發(fā)展到全基因組作圖。放射雜交作圖是基于染色體上的兩個(gè)STS相距越近其通過(guò)斷裂分開(kāi)的頻率越低的原理，通過(guò)PCR方法研究細(xì)胞中供體的STS的分布，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的手段計(jì)算STS間的斷裂分離頻率，從而可以推算出STS間的距離和在染色體上的排列順序。使用PCR方法鑒定STS時(shí)，必需保證其只能從供體，而不能從受體基因組中擴(kuò)增出相應(yīng)片段。目前，在大麥、小麥、玉米、棉花中都有構(gòu)建放射雜交圖譜的報(bào)道。第四章.掌握鏈終止DNA測(cè)序法、化學(xué)降解測(cè)序法和焦磷酸測(cè)序法；鏈終止DNA測(cè)序法基本依據(jù)：聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）能夠把長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸的單鏈DNA分子區(qū)分開(kāi)。10-1500bp鏈終止法測(cè)序的起始材料是均一的單鏈DNA分子。首先由短寡聚核苷酸在每個(gè)分子的相同位置上退火，并充當(dāng)引物合成與模板互補(bǔ)的新DNA鏈。在測(cè)序反應(yīng)體系中加入少量的被不同熒光標(biāo)記物標(biāo)記的雙脫氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）后，合成的互補(bǔ)鏈可在不同位置隨機(jī)終止反應(yīng)，產(chǎn)生一系列只差一個(gè)核苷酸的DNA分子。通過(guò)PAGE電泳可以讀出待測(cè)DNA分子的序列。技術(shù)路線與要求制備單鏈模板將單鏈模板與一小段引物退火加入DNA聚合酶（4種脫氧核苷酸）分別加入少量4種雙脫氧核苷酸將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳根據(jù)4個(gè)堿基在4條泳道的終止位置讀出DNA序列A.克隆于質(zhì)粒中的DNA用堿或熱變性B.M13克隆單鏈DNAC.噬菌?？寺NAA.高酶活性(5-3’聚合酶活性)B.無(wú)5f3’外切酶活性C.無(wú)3'-5’外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3’碳原子連接的是氫原子，不是羥基。制備單鏈DNA的方法：(1)把DNA克隆到質(zhì)粒載體中，再通過(guò)堿或煮沸變性形成單鏈DNA。缺點(diǎn)是質(zhì)粒DNA會(huì)被少量的細(xì)菌DNA或RNA污染。(2)把DNA克隆到M13噬菌體載體中。在噬菌體顆粒中，DNA分子以單鏈形式存在。缺點(diǎn)是該系統(tǒng)只能用于短片段DNA,大于3kb的片段被克隆到M13載體后會(huì)發(fā)生缺失和重排。通過(guò)在M13噬菌體載體中克隆獲得單鏈DNA。M13載體有兩種形式：雙鏈復(fù)制型分子和在噬菌體顆粒中發(fā)現(xiàn)的單鏈型。⑶把DNA克隆到噬菌粒中。噬菌粒是一種質(zhì)?？寺≥d體，除含有自身的復(fù)制起點(diǎn)外，還包含來(lái)源于M13噬菌體的起始位點(diǎn)。如果大腸桿菌中既有噬菌粒又有噬菌體，噬菌粒上的噬菌體起始位點(diǎn)就會(huì)被激活，產(chǎn)生含有噬菌粒單鏈形式的噬菌體顆粒，雙鏈質(zhì)粒DNA就被轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂淒NA。這一系統(tǒng)避免了M13克隆的不穩(wěn)定性，可用于克隆10kb或更長(zhǎng)的片段?；瘜W(xué)降解法測(cè)序鏈終止法測(cè)序的一個(gè)局限性是：如果模板DNA能形成鏈內(nèi)堿基配對(duì)的話，那么它就可能不會(huì)提供正確序列。化學(xué)降解法也是通過(guò)檢查末端核苷酸已知的分子長(zhǎng)度來(lái)確定序列的。這些不同長(zhǎng)度的分子是通過(guò)能在特定的核苷酸處進(jìn)行特異切割的化學(xué)試劑的處理而產(chǎn)生的。利用化學(xué)降解法測(cè)序，至少需要進(jìn)行4個(gè)單獨(dú)的測(cè)序反應(yīng)，每種核苷酸對(duì)應(yīng)一個(gè)反應(yīng)。起始材料是雙鏈DNA。每條鏈的5端連接一個(gè)放射性的磷基團(tuán)對(duì)DNA進(jìn)行標(biāo)記。雙鏈中的一條鏈可能比另一條鏈含有更多的嘌呤核苷酸，因此就稍微重一些，電泳過(guò)程中就遷移得慢。從凝膠中純化出一條鏈后，分成4份樣品，每份樣品都用一種切割試劑進(jìn)行處理。有限量：保證每條鏈上平均只有一個(gè)G殘基被甲基化修飾。每個(gè)反應(yīng)所產(chǎn)生的分子上樣到PAGE平板凝膠的一個(gè)泳道上，電泳后條帶在凝膠上的位置通過(guò)放射自顯影來(lái)觀察。移動(dòng)最遠(yuǎn)的條帶代表最小的DNA片段。焦磷酸測(cè)序：邊合成邊測(cè)序(Sequencingbysynthesis)每種核苷酸分別依此加入；如果核苷酸未滲入到正在合成的鏈中，就會(huì)被反應(yīng)體系中的核苷酸酶降解；如果核苷酸滲入到正在合成的鏈中，釋放的焦磷酸鹽會(huì)引起化學(xué)發(fā)光，發(fā)出的熒光信號(hào)可以被檢測(cè)到。在6.4cm2的芯片上可以同時(shí)進(jìn)行160萬(wàn)個(gè)反應(yīng)，4h內(nèi)可以獲得包含2500萬(wàn)個(gè)核苷酸的序列。.掌握鳥(niǎo)槍法、全基因組鳥(niǎo)槍法和克隆重疊群法等基因組測(cè)序方法及其優(yōu)缺點(diǎn)；鳥(niǎo)槍法對(duì)于相對(duì)較小的原核生物基因組，可以通過(guò)鳥(niǎo)槍法直接進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序?qū)嶒?yàn)中得到的短序列可通過(guò)檢查重疊區(qū)而直接疊加成主要序列。現(xiàn)在普遍認(rèn)為，任何小于5Mb的基因組序列，即使在計(jì)劃開(kāi)始前不知道基因組的任何信息，幾個(gè)月的時(shí)間足夠獲得它的全部序列。因此，鳥(niǎo)槍法的優(yōu)點(diǎn)在于測(cè)序速度快，并且能夠在遺傳圖譜和物理圖譜不存在的情況下進(jìn)行工作。全基因組鳥(niǎo)槍法該方法最早由CraigVenter和他的同事提出。經(jīng)驗(yàn)表明，如果所獲得的序列總長(zhǎng)度是所研究基因組長(zhǎng)度的6.5-8倍，那么所得到的序列重疊群就覆蓋了99.8%以上的基因組序列。對(duì)于一個(gè)3500Mb的哺乳動(dòng)物基因組而言，就要測(cè)7000萬(wàn)個(gè)左右的獨(dú)立序列。如此多的序列能借助計(jì)算機(jī)正確組裝起來(lái)嗎？如果用傳統(tǒng)的鳥(niǎo)槍法而不借助基因組圖譜信息，答案肯定是不可能。鳥(niǎo)槍法測(cè)序中最費(fèi)時(shí)的地方是將單個(gè)序列重疊群通過(guò)封閉序列間隙和物理間隙而連在一起的階段。通過(guò)使用兩種或兩種以上的不同載體中所克隆的片段產(chǎn)生的序列能夠有效提高基因組的整體覆蓋面。解決由于重復(fù)序列引起的組裝問(wèn)題的有效策略是確保其中一個(gè)克隆文庫(kù)中插入片段的長(zhǎng)度大于所研究基因組中最長(zhǎng)的重復(fù)序列。序列組裝的最初結(jié)果是一系列骨架（scaffold），每個(gè)骨架包括一組被序列間隙分開(kāi)的序列重疊群，骨架與骨架間被物理間隙分開(kāi)。序列間隙位于成對(duì)端點(diǎn)序列之間，通過(guò)成對(duì)端點(diǎn)序列篩選文庫(kù)，獲得陽(yáng)性克隆并測(cè)序，可以封閉間隙。全基因組鳥(niǎo)槍法在果蠅和人類基因組中的應(yīng)用已經(jīng)證明了它的可行性，但得到的基因組序列的準(zhǔn)確性方面仍存在問(wèn)題。部分問(wèn)題是序列產(chǎn)生的隨機(jī)性，基因組的某些部分被微小片段覆蓋許多次，而其他部分只被覆蓋一兩次?；蚪M的某些部分比其他部分有更多的微小序列所覆蓋?？寺≈丿B群法克隆重疊群方法被看作是獲得真核生物基因組序列的傳統(tǒng)方法。在該方法中，基因組通常經(jīng)部分酶切而產(chǎn)生較長(zhǎng)的DNA片段，再把這些片段克隆到高容量載體，如BAC中。借助基因組圖譜的信息，建立BAC克隆重疊群，然后通過(guò)鳥(niǎo)槍法對(duì)克隆群進(jìn)行分別測(cè)序再組裝。3.說(shuō)明建立克隆重疊群的方法；可以通過(guò)染色體步移來(lái)建立克隆重疊群，但該方法費(fèi)力最簡(jiǎn)單的構(gòu)建克隆重疊群的方法是從基因組文庫(kù)的一個(gè)克隆開(kāi)始，鑒定出與第一個(gè)克隆中的插入片段重疊的第二個(gè)克隆，依此類推。這就是染色體步移法。該方法的存在問(wèn)題是，如果用作探針的插入片段含有重復(fù)序列，那么它不僅能與重疊的克隆雜交，還能與含有重復(fù)序列拷貝的非重疊克隆雜交。如果用插入片段末端的一個(gè)片段作為探針，出現(xiàn)重復(fù)序列的機(jī)會(huì)就回減少。還可對(duì)末端序列進(jìn)行測(cè)序來(lái)確保不存在重復(fù)DNA。如果末端片段序列已知，可以通過(guò)PCR而不是雜交來(lái)篩選，這樣可以加速步移的速度。更快的克隆重疊群組裝方法染色體步移是一個(gè)比較慢的過(guò)程，幾乎不可能用該方法拼接出多于15-20個(gè)克隆的重疊群。一個(gè)改進(jìn)的方法是使用克隆指紋圖譜技術(shù)。該技術(shù)提供了待克隆DNA片段的物理結(jié)構(gòu)信息，將這些物理結(jié)構(gòu)信息和其它克隆的相關(guān)信息做一些比較分析，就能鑒定出重疊序列?？寺≈讣y圖譜技術(shù)限制性圖譜：通過(guò)用多種限制性內(nèi)切酶消化克隆，并在瓊脂糖凝膠上分離消化產(chǎn)物而得到。重復(fù)DNA指紋圖譜：通過(guò)對(duì)利用一類或多類重復(fù)序列特異的探針進(jìn)行Southern雜交所得到的一系列限制性片段進(jìn)行分析而獲得的。重復(fù)DNA的PCR或散步重復(fù)元件的PCR：運(yùn)用在重復(fù)序列內(nèi)退火的引物，能夠擴(kuò)增出兩相鄰重復(fù)序列之間的單拷貝DNA。為了鑒定出可能的重疊區(qū)，重復(fù)DNA進(jìn)行PCR之后獲得的產(chǎn)物大小可以作為與其他克隆相比較的指紋。STS作圖：非常有用，因?yàn)樗軌虍a(chǎn)生一個(gè)定位于STS物理圖譜上的克隆重疊群。.說(shuō)明利用鳥(niǎo)槍法進(jìn)行基因組測(cè)序如何保證所獲序列的準(zhǔn)確性和完整性。序列間隙”：可以通過(guò)對(duì)文庫(kù)中已經(jīng)存在的克隆進(jìn)一步篩選和測(cè)序來(lái)封閉。物理間隙：指克隆文庫(kù)中不存在的序列，可能是因?yàn)檫@些序列在所使用的克隆載體中不穩(wěn)定造成的。兩種解決策略：a.用噬菌體載體重新構(gòu)建一個(gè)克隆文庫(kù)，用與重疊群末端相對(duì)應(yīng)的寡聚核苷酸與該文庫(kù)進(jìn)行雜交。b.用成對(duì)的寡聚核苷酸為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。.描述ORF掃描的原理，并解釋該方法在真核生物基因組中定位基因不一定成功的原因以及改進(jìn)方法；基因不是核苷酸的隨機(jī)排列，而是具有明顯的特征：A.基因的編碼區(qū)是可讀框編碼蛋白質(zhì)的基因含有可讀框(ORF)，可讀框包含一系列能規(guī)定基因編碼蛋白質(zhì)中氨基酸序列的密碼子，并開(kāi)始于起始密碼子(通常是ATG)，結(jié)束于終止密碼子(TAA,TAGTGA)。因此，可以通過(guò)尋找ORF序列的方法來(lái)尋找基因。成功尋找ORF的關(guān)鍵在于終止密碼子在DNA序列中出現(xiàn)的頻率。如果一段DNA具有隨機(jī)序列且GC含量為50%，三個(gè)終止密碼子中的每一個(gè)將平均64bp出現(xiàn)一次。假定每100-200bp會(huì)出現(xiàn)一次終止密碼子，那么隨機(jī)DNA不會(huì)出現(xiàn)許多長(zhǎng)度超過(guò)50個(gè)密碼子的ORF。另一方面，大多數(shù)基因的長(zhǎng)度都大于50個(gè)密碼子，比如大腸桿菌：317個(gè)密碼子，釀酒酵母：483，人平均為450個(gè)密碼子。因此，最簡(jiǎn)單的尋找ORF的方式是將100個(gè)密碼子作為一個(gè)假定基因長(zhǎng)度的下限，并記錄所有大于此值的ORF的陽(yáng)性數(shù)據(jù)。B.單純的ORF掃描對(duì)高等真核生物DNA效果不佳雖然ORF掃描對(duì)細(xì)菌基因組很有效，但在高等真核生物的DNA序列中定位基因的效果不佳。原因之一是真核生物基因組中基因間的間隔很大，發(fā)現(xiàn)假ORF的概率就會(huì)增加。原因之二是真核生物的ORF是不連續(xù)的，經(jīng)常被內(nèi)含子所隔開(kāi)，而且單個(gè)外顯子的長(zhǎng)度一般小于100個(gè)密碼子。內(nèi)含子使ORF掃描復(fù)雜化對(duì)ORF掃描的基本程序已經(jīng)作了三項(xiàng)改良：密碼子偏倚(codonbias)被考慮在內(nèi)。密碼子偏倚：指特定生物體的基因中，并不是所有密碼子的使用頻率都是平等的。如亮氨酸可由6種密碼子編碼，但在人類基因組中，亮氨酸大多由CTG編碼。外顯子-內(nèi)含子邊界。GU-AG規(guī)則：核mRNA的剪接點(diǎn)一般都為GAG。上游調(diào)控序列可用來(lái)定位基因起始區(qū)。上游調(diào)控序列也具有顯著的序列特征，它們作為識(shí)別信號(hào)在參與基因表達(dá)的DNA結(jié)合蛋白中起重要作用。但調(diào)控序列是易于變化的，對(duì)于真核生物尤為明顯，因此通過(guò)該方法定位基因也存在很大局限性。盡管上述三種ORF掃描方法都有局限性，但普遍適用于所有高等真核生物基因組。另外的可能適用于單個(gè)生物體的策略：脊椎動(dòng)物基因組中，許多基因的上游都有CpG島。CpG島一般位于基因上游區(qū)域，大約有1kb長(zhǎng)，其中GC含量比整個(gè)基因組的平均含量要高。人類基因中40-50%的基因上游都含有CpG島。C.為功能性RNA定位基因功能RNA基因不包含ORF，所以不能用前面講的方法進(jìn)行定位。這些功能RNA分子具有它們自己的特征，其中最重要的是它們能折疊形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。如tRNA分子具有三葉草結(jié)構(gòu)。tRNA的特征有助于為這些功能RNA定位基因?qū)τ谄渌恍┕δ躌NA可用如下方法進(jìn)行定位：?大多數(shù)功能RNA都包含一個(gè)或多個(gè)莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，搜尋DNA序列中這樣結(jié)構(gòu)的程序就能鑒別出功能RNA基因可能的存在區(qū)域。?搜尋與功能RNA基因相關(guān)的調(diào)控序列（前面/內(nèi)部）。?在基因組較小的基因組中，仔細(xì)檢查蛋白質(zhì)編碼基因廣泛搜尋之后留下的“空位置”區(qū)域，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)功能RNA基因的存在。同源性搜索和比較基因組學(xué)為序列篩查提供了一個(gè)特殊的方向同源性搜索：通過(guò)查詢DNA數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)判斷所檢測(cè)序列是否與已知基因的序列相同或相似。通過(guò)同源性搜索可以來(lái)檢驗(yàn)一系列三聯(lián)體密碼子是真正外顯子還是隨機(jī)序列，一定程度上可以彌補(bǔ)ORF識(shí)別的局限性。同源性搜索的另一個(gè)主要用途是為新基因確定功能。比較基因組學(xué)：相關(guān)種屬的基因組序列既具有從它們的共同祖先繼承過(guò)來(lái)的相似性，又具有由于物種開(kāi)始單獨(dú)進(jìn)化而產(chǎn)生的種屬特異性。由于自然選擇，序列相似性在基因內(nèi)部最大，而在基因間區(qū)域最小，當(dāng)相關(guān)基因組進(jìn)行比較時(shí)，同源基因由于它們的序列相似性很高，就很容易被鑒定出來(lái)。可以通過(guò)比較基因組學(xué)來(lái)檢測(cè)ORF的真實(shí)性，如果某一個(gè)新定位的ORF在相關(guān)基因組中都不存在，那么它很有可能不是一個(gè)真正基因。自動(dòng)標(biāo)注基因組序列運(yùn)用計(jì)算機(jī)方法進(jìn)行基因組標(biāo)注是從序列分析開(kāi)始的，運(yùn)用能掃描ORF、外顯子-內(nèi)含子邊界及上游調(diào)控區(qū)并能在數(shù)據(jù)庫(kù)中檢測(cè)同源基因ORF的程序進(jìn)行序列分析，這些程序同時(shí)也用于尋找重復(fù)序列及功能RNA基因的特異性特征。運(yùn)用這些程序還可以掃描cDNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)，以尋找與基因組序列中任何相匹配的片段，任何這樣的匹配都表明是一段能轉(zhuǎn)錄成mRNA的區(qū)域。6.掌握運(yùn)用同源性搜索和比較基因組學(xué)以及掃描cDNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)等定位基因的方法；同源性搜索和比較基因組學(xué)為序列篩查提供了一個(gè)特殊的方向同源性搜索：通過(guò)查詢DNA數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)判斷所檢測(cè)序列是否與已知基因的序列相同或相似。通過(guò)同源性搜索可以來(lái)檢驗(yàn)一系列三聯(lián)體密碼子是真正外顯子還是隨機(jī)序列，一定程度上可以彌補(bǔ)ORF識(shí)別的局限性。同源性搜索的另一個(gè)主要用途是為新基因確定功能。比較基因組學(xué)：相關(guān)種屬的基因組序列既具有從它們的共同祖先繼承過(guò)來(lái)的相似性，又具有由于物種開(kāi)始單獨(dú)進(jìn)化而產(chǎn)生的種屬特異性。由于自然選擇，序列相似性在基因內(nèi)部最大，而在基因間區(qū)域最小，當(dāng)相關(guān)基因組進(jìn)行比較時(shí)，同源基因由于它們的序列相似性很高，就很容易被鑒定出來(lái)。可以通過(guò)比較基因組學(xué)來(lái)檢測(cè)ORF的真實(shí)性，如果某一個(gè)新定位的ORF在相關(guān)基因組中都不存在，那么它很有可能不是一個(gè)真正基因。自動(dòng)標(biāo)注基因組序列運(yùn)用計(jì)算機(jī)方法進(jìn)行基因組標(biāo)注是從序列分析開(kāi)始的，運(yùn)用能掃描ORF、外顯子-內(nèi)含子邊界及上游調(diào)控區(qū)并能在數(shù)據(jù)庫(kù)中檢測(cè)同源基因ORF的程序進(jìn)行序列分析，這些程序同時(shí)也用于尋找重復(fù)序列及功能RNA基因的特異性特征。運(yùn)用這些程序還可以掃描cDNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)，以尋找與基因組序列中任何相匹配的片段，任何這樣的匹配都表明是一段能轉(zhuǎn)錄成mRNA的區(qū)域。7.掌握基因定位的實(shí)驗(yàn)方法特別是定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的方法以及定位外顯子-內(nèi)含子邊界的方法；大多數(shù)基因定位的實(shí)驗(yàn)方法不是直接檢測(cè)DNA分子，而是檢測(cè)由基因轉(zhuǎn)錄成的mRNA分子。轉(zhuǎn)錄物通常比基因編碼部分要長(zhǎng)，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄物中包含-UTR區(qū)和-UTR區(qū)。因此，轉(zhuǎn)錄物分析不能準(zhǔn)確定位基因編碼區(qū)的起始和終止點(diǎn)，但能告訴你一個(gè)基因確實(shí)存在于某特定區(qū)域中，并且可以定位外顯子-內(nèi)含子邊界。A.雜交實(shí)驗(yàn)可以判斷某一片段是否含有轉(zhuǎn)錄序列可通過(guò)northern雜交檢測(cè)某一DNA片段是否含有轉(zhuǎn)錄序列。由GeorgeStark發(fā)明。說(shuō)明用作探針的DNA片段包含部分或全部轉(zhuǎn)錄序列。通過(guò)northern雜交檢測(cè)有兩個(gè)缺點(diǎn)：一些單個(gè)基因有兩個(gè)或更多長(zhǎng)度不等的轉(zhuǎn)錄物，因此雜交后可能會(huì)檢測(cè)出兩條或多條雜交帶。如果該基因是多基因家族的一員也會(huì)出現(xiàn)同樣的問(wèn)題?；虮磉_(dá)具有組織特異性和發(fā)育階段特異性，因此很難制備完整的mRNA樣品。也有一些基因表達(dá)量太低，很難被雜交檢測(cè)到。原理：同源基因具有相似的序列，而基因間區(qū)域序列相似性很低。種屬間印跡(zooblotting)：用一個(gè)物種的DNA片段與相關(guān)物種的DNA進(jìn)行Southern雜交，如果能得到一個(gè)或多個(gè)雜交信號(hào)的話，就表明該探針中可能含有一個(gè)或多個(gè)基因。cDNA測(cè)序有助于在DNA片段中進(jìn)行基因作圖Northern雜交和種屬間印跡能夠判斷DNA片段中有無(wú)基因的存在，但卻不能給出基因在DNA序列上的定位信息。獲得定位信息最容易的方法是對(duì)相關(guān)cDNA進(jìn)行測(cè)序。將cDNA序列與相關(guān)基因組DNA序列進(jìn)行比較，可以描述相關(guān)基因的位置并找到外顯子-內(nèi)含子邊界。cDNA測(cè)序作為基因定位方法的成功率取決于兩個(gè)因素：⑴所研究的cDNA在文庫(kù)中出現(xiàn)的頻率。如果表達(dá)豐度很低，就很難從cDNA文庫(kù)中篩選到所需要的基因。⑵單個(gè)cDNA分子的完整性。如果反轉(zhuǎn)錄不完全，會(huì)形成截短的cDNA。截短的cDNA可能缺少定位基因起點(diǎn)和末點(diǎn)及外顯子-內(nèi)含子邊界所需要的一些信息。精確定位轉(zhuǎn)錄物末端的有效方法?快速擴(kuò)展cDNA末端(RapidamplificationofcDNAend,RACE)?異源雙鏈分析(Heteroduplexanalysis)準(zhǔn)確定位外顯子-內(nèi)含子邊界的方法?異源雙鏈分析(Heteroduplexanalysis)?外顯子捕獲(exontrapping)需要一種特殊類型的包含一個(gè)小基因的載體，此小基因包含一個(gè)內(nèi)含子和位于內(nèi)含子兩側(cè)的兩個(gè)外顯子，第一個(gè)外顯子前還要有起始轉(zhuǎn)錄所需要的序列信息(啟動(dòng)子序列)。8.掌握通過(guò)同源性比較預(yù)測(cè)基因的功能以及通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法鑒定基因的功能；像定位基因一樣，也嘗試著用計(jì)算機(jī)分析和實(shí)驗(yàn)研究來(lái)確定未知基因的功能?；蚬δ艿挠?jì)算機(jī)分析同源性反映出進(jìn)化關(guān)系:同源基因具有共同的進(jìn)化祖先，是通過(guò)基因間的序列相似性而發(fā)現(xiàn)的。同源基因分為兩類：⑴直系同源基因（orthologousgene）：是那些不同物種生物體間存在的同源物，它們的共同祖先早于物種間的分裂。同源基因通常具有相同或類似的功能。如人類和黑猩猩的肌紅蛋白基因是同源基因。⑵旁系同源基因（paralogousgene）：存在于相同生物體中的同源物，常是可識(shí)別的多基因家族的成員，它們的共同祖先可能早于或晚于物種間的分裂。如人類肌紅蛋白和球蛋白基因是旁系同源基因。由于進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生突變，同源基因間具有不完全相同的核苷酸序列。由于突變起始于相同的起始序列，因此序列又具有相似性。同源分析可以提供整個(gè)基因或基因片段的功能信息可以用DNA序列進(jìn)行同源性搜索，但一般將假定基因的序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列后再進(jìn)行同源性搜索，就不太可能得到假結(jié)果。同源性搜索程序是通過(guò)將查詢序列和數(shù)據(jù)庫(kù)序列之間進(jìn)行比較而開(kāi)始的。對(duì)于每個(gè)比較而言，都可以算出一個(gè)得分，根據(jù)得分可以估量查詢序列和數(shù)據(jù)庫(kù)序列同源的可能性。當(dāng)在氨基酸水平進(jìn)行比較時(shí)，兩個(gè)序列之間缺少同源性就更明顯。產(chǎn)生得分的兩種方法：計(jì)算氨基酸在兩條序列中都存在的位點(diǎn)數(shù)。這個(gè)數(shù)值被轉(zhuǎn)化后就可以給出兩條序列間的相似程度。運(yùn)用不同氨基酸之間的化學(xué)相關(guān)性為比對(duì)中的每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行評(píng)分，相同或相近的氨基酸分?jǐn)?shù)就高（如亮氨酸-異亮氨酸，天冬氨酸-天冬酰胺），不相關(guān)的氨基酸分?jǐn)?shù)就低（半胱氨酸-酪氨酸，苯丙氨酸-絲氨酸）。Identities（低一些）；Positives（高一些）利用同源性搜索來(lái)鑒定基因功能有如下局限性：如果數(shù)據(jù)庫(kù)中描述的基因的功能不正確，就會(huì)傳遞到新序列上。同源基因可能具有不同的生物學(xué)功能。例如一些眼晶狀體的晶體蛋白和代謝酶同源。有些蛋白雖然具有相似的功能，但序列相似性不高，只是擁有某些共同的結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域在決定基因功能方面起到了關(guān)鍵作用。用實(shí)驗(yàn)分析闡明基因功能:很明顯，同源分析并不是確定所有新基因功能的萬(wàn)能藥，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)的方法來(lái)驗(yàn)證和擴(kuò)展同源性研究的結(jié)果。常規(guī)的從表型到基因的方法屬于正向遺傳學(xué)的范疇，而這里是在發(fā)現(xiàn)了新基因的基礎(chǔ)上去研究其功能，屬于反向遺傳學(xué)的范疇。A.通過(guò)基因失活進(jìn)行功能分析通過(guò)將待研究基因突變掉，觀察基因突變后引起的表型改變，這是大多數(shù)用于確定未知基因功能的技術(shù)基礎(chǔ)。同源重組可以使單個(gè)基因失活DNA重組：是指由于不同DNA鏈的斷裂和連接而產(chǎn)生的DNA片段的交換和重新組合，形成新的DNA分子的過(guò)程。同源重組：兩個(gè)具有相似序列的DNA分子同源區(qū)段間的相互交換?；蚴Щ畹牡诙€(gè)例子使用相似的方法，但使用小鼠而不是酵母。小鼠基因組中含有許多與人類相似的基因，可作為人類基因功能研究的模式生物。一個(gè)存在問(wèn)題是：我們不想只得到一個(gè)突變的細(xì)胞，而想得到整個(gè)突變小鼠，這樣才能充分評(píng)價(jià)基因失活對(duì)表型的影響。因此，必須使用一類特殊類型的小鼠細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞），它是全能細(xì)胞。制備基因敲除小鼠的過(guò)程如下：將已經(jīng)用基因工程處理過(guò)的ES細(xì)胞注射到小鼠子宮中，小鼠胚胎會(huì)發(fā)育形成一個(gè)嵌合體。嵌合體小鼠的細(xì)胞由來(lái)自￡5細(xì)胞突變體和胚胎其它細(xì)胞的非突變體混合組成。嵌合體小鼠間進(jìn)行交配，兩個(gè)突變配子的融合就會(huì)產(chǎn)生純合型的基因敲除小鼠。不用同源重組進(jìn)行基因失活轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù)：通過(guò)向基因中插入轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子使基因功能失活。正常情況下，轉(zhuǎn)座是小概率事件，但運(yùn)用DNA重組技術(shù)修飾轉(zhuǎn)座子，可使其對(duì)外界刺激產(chǎn)生反應(yīng)而發(fā)生轉(zhuǎn)座，如酵母轉(zhuǎn)座子Ty1。人工誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座?當(dāng)半乳糖缺乏時(shí)，Ty1元件不被轉(zhuǎn)錄而保持沉默；?當(dāng)細(xì)胞被轉(zhuǎn)到含有半乳糖的培養(yǎng)基上時(shí)，啟動(dòng)子被激活，Ty1元件被轉(zhuǎn)錄，從而開(kāi)始轉(zhuǎn)座過(guò)程。轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù)的缺點(diǎn)是它很難瞄準(zhǔn)單個(gè)基因，因?yàn)橐话闱闆r下轉(zhuǎn)座是一種隨機(jī)事件，轉(zhuǎn)座子跳躍后就很難預(yù)測(cè)它會(huì)在哪里定位。如果目的是失活一個(gè)特定基因，那就必須誘導(dǎo)大量的轉(zhuǎn)座，然后對(duì)已轉(zhuǎn)座的所有生物體進(jìn)行篩選，以發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因被轉(zhuǎn)座子插入的個(gè)體。因此，轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù)更適用于整體研究基因組的功能，通過(guò)檢查感興趣的表型變化的后代來(lái)鑒別出具有相似功能的各類基因。RNA干擾(RNAi)：利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源RNA，從而阻斷靶基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。為真核細(xì)胞植入一段雙鏈RNA后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Dicer酶(一種RNaselllnuclease)會(huì)識(shí)別該外來(lái)基因，并將其切斷成短鏈小干擾RNA(siRNA)。恰巧，真核細(xì)胞內(nèi)又存在一組RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體蛋白(RISC)，它能夠找到siRNA，并把它解旋為一條自由的ssRNA(singlestrandedRNA)和一條綁在RISC上的ssRNA?；趬A基互補(bǔ)配對(duì)原則，被綁在RISC上的那條ssRNA可以從細(xì)胞質(zhì)中存在的自然RNA中選出互配的mRNA序列，并引導(dǎo)RISC將其切斷，從而抑制該mRNA的翻譯過(guò)程?；蜻^(guò)表達(dá)也可以用來(lái)探索功能通過(guò)基因過(guò)表達(dá)進(jìn)行功能分析：通過(guò)使生物體中被檢測(cè)基因的活性比正常情況更高時(shí)檢測(cè)表型的改變。過(guò)表達(dá)一個(gè)基因，必須使用一種特殊類型的載體，載體必須含有高活性啟動(dòng)子，以便使每個(gè)拷貝的待測(cè)基因能被轉(zhuǎn)變成大量mRNA，從而確保合成盡可能的蛋白質(zhì)。基因失活或過(guò)表達(dá)對(duì)表型的影響可能很難辨別基因失活或過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵之處是需要鑒別表型改變。對(duì)于任何生物體，必須檢查的表型范圍是很廣的，很難全面評(píng)價(jià)。即使進(jìn)行最認(rèn)真的篩選時(shí)，許多基因失活引起的表型變化可能也辨別不出。對(duì)于秀麗隱桿線蟲來(lái)說(shuō)，大規(guī)模的基因失活計(jì)劃到目前為止只在不到10%的預(yù)測(cè)基因中發(fā)現(xiàn)到表型變化。9.描述獲得未知基因編碼蛋白質(zhì)活性的更詳細(xì)信息的方法?；蚴Щ詈瓦^(guò)表達(dá)是基因組研究人員探索新基因功能的基本技術(shù)，但并不是能提供基因活性信息的唯一方法。定點(diǎn)誘變可以用來(lái)詳細(xì)探索基因的功能定點(diǎn)誘變：為了改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和可能的活性，在基因序列中產(chǎn)生精確突變的方法。誘變后，必須將突變基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，以便用同源重組的方法將原有的基因替換掉。通常是在突變基因旁設(shè)計(jì)一個(gè)標(biāo)記基因來(lái)尋找發(fā)生了同源重組的細(xì)胞。但有可能是標(biāo)記基因而不是突變基因?qū)е铝吮硇偷母淖?。為解決這一問(wèn)題，設(shè)計(jì)了一種兩步基因替換法。(1)寡聚核苷酸定點(diǎn)誘變DNA鏈的合成通過(guò)M13載體克隆獲得目的基因的單鏈分子;含有突變的寡聚核苷酸引物與單鏈目的基因退火。鑒定突變噬菌體將攜帶有正常目的基因和突變基因的M13載體轉(zhuǎn)到大腸桿菌中；用原來(lái)的寡聚核苷酸作為探針進(jìn)行雜交，有雜交信號(hào)的即為突變的噬菌體。（2）PCR方法與寡聚核苷酸定點(diǎn)誘變相似，但一次實(shí)驗(yàn)只能產(chǎn)生一個(gè)突變。報(bào)告基因和免疫細(xì)胞化學(xué)可以用來(lái)定位基因的時(shí)空表達(dá)基因功能的線索通?？梢酝ㄟ^(guò)研究基因的時(shí)空表達(dá)來(lái)獲得。運(yùn)用報(bào)告基因，可以確定生物體內(nèi)的待測(cè)基因表達(dá)模式，這可以通過(guò)用報(bào)告基因的ORF代替待測(cè)基因的ORF，而其他調(diào)控基因不變來(lái)實(shí)現(xiàn)。表達(dá)報(bào)告基因的細(xì)胞會(huì)變藍(lán)、發(fā)熒光或釋放其它可見(jiàn)信號(hào)。知道基因的表達(dá)模式后，如果對(duì)細(xì)胞中該基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行定位，就可以獲得有關(guān)該基因功能的關(guān)鍵資料。確定蛋白質(zhì)定位的唯一方法就是直接尋找蛋白質(zhì)本身，這可以通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)做到。免疫細(xì)胞化學(xué)（Immunocytochemistry）用紅色熒光標(biāo)記物標(biāo)記的抗體處理細(xì)胞。細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明熒光信號(hào)與線粒體內(nèi)膜相結(jié)合。因此，可以推測(cè)目標(biāo)蛋白參與了電子輸送和氧化磷酸化，因?yàn)檫@些是線粒體內(nèi)膜的主要生化功能。第五章.描述核小體的概念；核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)揭示的規(guī)則性間隔表現(xiàn)為線性DNA上的核小體。DNA在核心八聚體外纏繞兩圈，長(zhǎng)度為140-150bp，每個(gè)核小體由50-70bp的連接DNA分隔，這樣重復(fù)單位長(zhǎng)190-220bp。每個(gè)連接組蛋白附著于一個(gè)核小體，它像夾子一樣，防止卷曲的DNA從核小體上脫離下來(lái)。.比較不同生物的基因組組成，并討論基因組大小、基因組復(fù)雜性和基因數(shù)目的關(guān)系；真核生物在核基因組中基因是如何組織的基因只構(gòu)成了人類基因組中的一部分以人的第12號(hào)染色體上一個(gè)50kb的片段為例，該片段包含如下幾個(gè)遺傳學(xué)特征：（1）包含4個(gè)基因：PKP2、SYB1、FLJ10143、CD27。這4個(gè)基因都不是連續(xù)的，內(nèi)含子數(shù)目從SYB1的2個(gè)到PKP2的8個(gè)不等。（2）包含88個(gè)全基因組范圍內(nèi)的重復(fù)序列。全基因組范圍內(nèi)的重復(fù)序列（散布重復(fù)序列）：在基因組中很多地方都會(huì)出現(xiàn)的重復(fù)序列。主要有4種類型：長(zhǎng)散布核元件（LINE），短散布核元件（SINE），長(zhǎng)末端重復(fù)元件（LTR），DNA轉(zhuǎn)座子。在上述基因組片段中，4種類型的重復(fù)序列都存在，大多數(shù)位于基因間區(qū)域，個(gè)別位于內(nèi)含子中。（3）包含7個(gè)微衛(wèi)星，其中有4個(gè)位于內(nèi)含子中。（4）在觀察的50kb人的基因組片段中，約30%的部分由功能未知或不明確的非基因、非重復(fù)序列或單拷貝DNA組成。外顯子的總長(zhǎng)度為4745bp，相當(dāng)于總長(zhǎng)度的9.5%。在整個(gè)人類基因組中，外顯子加起來(lái)只有48Mb，僅占總長(zhǎng)度的1.5%。相比之下，全基因組范圍內(nèi)的重復(fù)序列卻占基因組的44%。酵母基因組是相當(dāng)緊湊的不同真核生物之間，基因組大小有很明顯的差別：最小者不到10Mb,而最大者超過(guò)10萬(wàn)Mb?；蚪M大小和物種的復(fù)雜性在一定程度上具有關(guān)聯(lián)性：最簡(jiǎn)單的真核生物如真菌的基因組最小,而相對(duì)高等的真核生物如脊椎動(dòng)物和有花植物的基因組就屬于最大的。但又不是完全一致的。C值矛盾：基因組的大小與生物的復(fù)雜性并不完全成比例增加。C值：通常是指一種生物單倍體基因組DNA的總量。事實(shí)上,答案非常簡(jiǎn)單：在相對(duì)不復(fù)雜的物種中,因?yàn)榛蚺帕懈泳o密,所以節(jié)省了基因組空間。為此，我們將剛才分析的人類基因組的一個(gè)50kb片段和酵母的一個(gè)50kb片段進(jìn)行了比較，酵母的50kb片段具有如下特點(diǎn)：(1)酵母片段包含的基因數(shù)目比人的片段多。28/4(2)酵母中不連續(xù)的基因數(shù)目相對(duì)較少(0)。在整個(gè)酵母基因組中只有239個(gè)內(nèi)含子,而在整個(gè)人類基因組中有30萬(wàn)個(gè)以上。酵母全基因組范圍的重復(fù)序列更少(5/88)。在酵母全基因組范圍內(nèi)重復(fù)序列僅占總序列的3.4%。(人：44%)因此,酵母的基因組在基因的編排方面比人基因組更加經(jīng)濟(jì),酵母基因自身更加緊密,內(nèi)含子更少,基因間的空隙也相對(duì)更短,全基因組范圍內(nèi)的重復(fù)序列和其他非編碼序列占用的空間也更少。其他真核生物中的基因編排可以建立一個(gè)假設(shè)：越是復(fù)雜的真核生物,它們的基因組越不緊湊。為此,我們將人、酵母、果蠅和玉米的基因組進(jìn)行了比較。基因組中有多少基因,它們的功能又是什么人的基因組中包含3-4萬(wàn)個(gè)基因,而在2000年草圖完成的前幾個(gè)月,最公認(rèn)的推測(cè)是8-10萬(wàn)個(gè)基因,這是根據(jù)人細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的數(shù)目預(yù)測(cè)的。我們現(xiàn)在知道,由于可變剪切的存在,基因的數(shù)目并不代表蛋白質(zhì)的數(shù)目。人類基因目錄在人的3-4萬(wàn)個(gè)基因中,約半數(shù)基因的功能是已知的,其中絕大多數(shù)是蛋白質(zhì)編碼基因,只有不到2500個(gè)基因是編碼不同類型的功能性RNA。對(duì)于這些功能已知的基因按功能分類如下：基因目錄揭示了不同生物體的各自特征真核生物基因組中,基因分類的方法：(1)按照基因的功能進(jìn)行分類。優(yōu)點(diǎn)：可進(jìn)行更具體的基因功能描述；缺點(diǎn)：有些基因功能未知,用這種方法進(jìn)行分類會(huì)遺漏部分基因。(2)按照提示基因功能的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分類。優(yōu)點(diǎn)：可以應(yīng)用于功能未知的基因,因此可以擴(kuò)大基因組中每種基因類別的份額。按此方法分類,越復(fù)雜的生物,其每一類基因的數(shù)目應(yīng)該越多。根據(jù)基因編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域推測(cè)的功能,對(duì)基因進(jìn)行分類：3.描述真核生物基因組中基因的分類方法及各自的優(yōu)缺點(diǎn)；真核生物基因組中，基因分類的方法：(1)按照基因的功能進(jìn)行分類。優(yōu)點(diǎn)：可進(jìn)行更具體的基因功能描述；缺點(diǎn)：有些基因功能未知，用這種方法進(jìn)行分類會(huì)遺漏部分基因。(2)按照提示基因功能的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分類。優(yōu)點(diǎn)：可以應(yīng)用于功能未知的基因，因此可以擴(kuò)大基因組中每種基因類別的份額。按此方法分類，越復(fù)雜的生物，其每一類基因的數(shù)目應(yīng)該越多。根據(jù)基因編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域推測(cè)的功能，對(duì)基因進(jìn)行分類：.舉例解釋什么是多基因家族；具有相同或相似序列的基因家族是許多基因組的共同特征。rRNA基因?qū)儆谧罱?jīng)典的多基因家族的例子，這些家族是基因擴(kuò)增產(chǎn)生的。有些多基因家族的成員雖然序列相似，但基因產(chǎn)物的特征卻明顯不同，如哺乳動(dòng)物的珠蛋白基因。人的a和。珠蛋白基因簇。.區(qū)分常規(guī)和已加工的假基因；假基因：指具有與功能基因相似的序列，但不能翻譯成有功能蛋白質(zhì)的無(wú)功能基因。它往往存在于真核生物的多基因家族中。假基因是一種進(jìn)化遺跡，表明基因組處于持續(xù)性變化的過(guò)程中。主要存在兩種假基因：(1)常規(guī)假基因：指基因的核苷酸序列因?yàn)橥蛔兌l(fā)生改變，導(dǎo)致基因失活。如珠蛋白假基因。⑵已加工的假基因：以某個(gè)基因的mRNA合成的cDNA拷貝再次插入到基因組后，由于缺少上游調(diào)控序列不能轉(zhuǎn)錄而引起的基因失活。除假基因外，基因組還包括截短基因和基因片段等進(jìn)化遺跡。截短基因：與完整基因相比，或多或少缺失了部分序列的基因?；蚱危褐笍哪硞€(gè)基因內(nèi)部分割出來(lái)的短的區(qū)域。.區(qū)分串聯(lián)重復(fù)序列和散布重復(fù)序列，并描述衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA的特征。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人類基因組中約62%的部分為基因間隔區(qū)(intergenicregion)，即基因與基因之間的區(qū)域，不存在已知功能的基因組成分，以前將這部分DNA稱為垃圾DNA(junkDNA)。最近的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)這部分DNA可能存在潛在的功能，人們漸漸舍棄了junkDNA這一術(shù)語(yǔ)。在大多數(shù)生物中，這些基因間隔區(qū)由重復(fù)DNA組成。重復(fù)DNA可分為兩大類：串聯(lián)重復(fù)序列和散布重復(fù)序列(全基因組范圍內(nèi)重復(fù)序列)。A.串聯(lián)重復(fù)DNA可見(jiàn)于真核生物染色體著絲粒及其他位置串聯(lián)重復(fù)DNA也叫衛(wèi)星DNA，因?yàn)樵谟妹芏忍荻入x心法分離基因組DNA時(shí)，含有串聯(lián)重復(fù)序列的DNA片段會(huì)形成衛(wèi)星帶。如將人DNA截?cái)喑?0-100kb的片段，離心后會(huì)形成一個(gè)主帶和三個(gè)衛(wèi)星帶。雖然一部分衛(wèi)星DNA散布于整個(gè)基因組，但大多位于著絲粒，它們可能作為一種或多種特殊的著絲粒蛋白的結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)揮結(jié)構(gòu)性作用。小衛(wèi)星和微衛(wèi)星雖然沒(méi)有出現(xiàn)在密度梯度的衛(wèi)星帶中，另外兩種衛(wèi)星DNA：小衛(wèi)星和微衛(wèi)星，也是串聯(lián)重復(fù)DNA。小衛(wèi)星形成長(zhǎng)達(dá)20kb的聚集區(qū)，每個(gè)重復(fù)單位最多25bp。微衛(wèi)星區(qū)較短，通常小于150bp，其重復(fù)單位為2-13bp。小衛(wèi)星DNA與染色體結(jié)構(gòu)特征有關(guān)，染色體端粒就是一種小衛(wèi)星DNA。人類端粒DNA包含數(shù)百拷貝的重復(fù)基序5-TTAGGG-3。在人類中，微衛(wèi)星最常見(jiàn)的類型是雙核苷酸重復(fù)，其中有一半重復(fù)基序是CA。目前已知，微衛(wèi)星是由于細(xì)胞分裂中負(fù)責(zé)基因組復(fù)制的過(guò)程出錯(cuò)而產(chǎn)生的，即當(dāng)DNA復(fù)制時(shí)，微衛(wèi)星拷貝有時(shí)發(fā)生滑移，導(dǎo)致插入或缺失（不常見(jiàn)）一個(gè)或多個(gè)重復(fù)單位。因此，微衛(wèi)星比較容易產(chǎn)生多態(tài)性，可以用于遺傳圖譜的構(gòu)建。散布重復(fù)序列散布重復(fù)序列最常見(jiàn)的發(fā)生機(jī)制是轉(zhuǎn)座，最分散的重復(fù)序列往往有天然的轉(zhuǎn)座活性。轉(zhuǎn)座也