重組dna技術(shù)0分子生物學(xué)名師優(yōu)質(zhì)課賽課一等獎市公開課獲獎?wù)n件

重組DNA技術(shù)(DNA克隆或分子克隆)

DNARecombinationTechnique

(DNACloningorMolecularClone)

第二章第1頁1944年O.T.Avery肺炎球菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn):從S型細(xì)菌中分別抽提出DNA、蛋白質(zhì)和莢膜物質(zhì)，并把每一個成份同活R型細(xì)菌混合，懸浮在合成培養(yǎng)液中。結(jié)果發(fā)覺只有DNA組分能夠把R型細(xì)菌轉(zhuǎn)變成S型細(xì)菌第2頁重組DNA技術(shù)發(fā)展史O.T.Avery（1944年）證實(shí)，遺傳信息攜帶者是DNA；1953年,

Watson和Crick提出了DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型1958年,Meselson和Stahl證實(shí)了DNA半保留復(fù)制同年，Crick提出遺傳信息傳遞“中心法則”1961年，

F.Jacob和J.Monod提出了操縱子模型1966年，Nirenberg等人破譯了氨基酸64個遺傳密碼1972年，P.Berg等率先完成DNA體外重組(諾貝爾化學(xué)獎)1973年，S.Cohen等深入實(shí)現(xiàn)了重組DNA轉(zhuǎn)化1977年美國南舊金山建立世界上第一家遺傳工程企業(yè)，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上主要藥品。1980年，第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素工廠。1982年，美國FDA同意首例基因工程產(chǎn)品--人胰島素1997年英國羅林研究所成功克隆了多莉。第3頁人體生長激素釋放激素(SS)抑制和調(diào)整各種激素作用從動物腦中提取:5mg---50萬只羊腦基因工程9升大腸桿菌培養(yǎng)液第4頁相關(guān)概念DNA克隆工具酶目標(biāo)基因基因載體基本原理

重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)關(guān)系主要內(nèi)容：第5頁第一節(jié)、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念ConceptAssociatedtoRecombinantDNATechnology克隆(clone):是指從一個共同祖先無性繁殖下來一群遺傳上同一DNA分子、細(xì)胞或個體所組成群體獲取同一拷貝過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆第6頁技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)（即DNA克?。?/p>

細(xì)胞克隆個體克?。▌游锘蛑参铮?/p>

第7頁是在體外將不一樣起源特異基因或DNA片段插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)建重組DNA分子，然后將重組DNA導(dǎo)入到適當(dāng)受體細(xì)胞中，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖（稱之為“克隆”），篩選出含有目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取取得大量同一DNA分子(recombinantDNA,chimeraDNA），即DNA克隆，所以DNA重組技術(shù)又稱為DNA克?。―NAcloning）。DNA克隆第8頁生物技術(shù)工程:基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等

基因工程(geneticengineering)

——實(shí)現(xiàn)基因克隆所用方法及相關(guān)工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)或重組DNA技術(shù)(recombinationDNAtechnique)，基因操作(genemanipulation)、遺傳工程(genedcengineering)。第9頁(二)目基因進(jìn)行DNA重組目標(biāo)主要有兩方面：①分離取得某一感興趣基因或DNA②取得感興趣基因表示產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）這些使我們感興趣基因或DNA序列就是目標(biāo)基因(targetDNA)。目標(biāo)基因有兩種類型：cDNA(complementaryDNA):在體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成．與mRNA互補(bǔ)DNA?；蚪MDNA(GenomicDNA):代表一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息全部DNA序列。第10頁(三)載體一.表示載體(expressionvector):為使插入外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計載體稱為表示載體。二.克隆載體(Cloningvector):為使插入外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計載體稱為克隆載體。第11頁第二節(jié)重組DNA技術(shù)操作基本過程基本原理目標(biāo)基因獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體連接克隆載體選擇和構(gòu)建重組體篩選克隆基因表示

第12頁重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為：分分離目基因切限制酶切目基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩篩選重組體

第13頁

目基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線第14頁以質(zhì)粒為載體

DNA克隆過程第15頁第16頁第三節(jié)主要工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，含有完整DNA聚合酶I53聚合、35外切活性，而無53外切活性。慣用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)識等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替換DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)識或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)識探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第17頁一.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA特異序列,并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義：第18頁第一個字母取自產(chǎn)生該酶細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)覺先后次序。命名：Hin

dⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株第三種酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中慣用Ⅱ型）分類：第19頁Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶作用特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

大部分Ⅱ型限制酶能夠識別由4個～8個核苷酸組成特定序列。Ⅱ型酶識別含有回文結(jié)構(gòu)核苷酸序列（圖2-2）。“回文”意為順讀和倒讀都一樣詞語切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第20頁BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口第21頁起源不一樣限制酶，但能識別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功異源酶：第22頁有些限制性內(nèi)切酶即使識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶第23頁名稱識別序列及切割位點(diǎn)名稱識別序列及切割點(diǎn)切割后產(chǎn)生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’MboⅠ

5’…▼GATC...3’NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產(chǎn)生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后產(chǎn)生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’限制性內(nèi)切核酸酶第24頁二、DNA連接酶(基因工程“縫紉針”)：

1.T4噬菌體DNA連接酶：兩個不一樣片段雙鏈DNA存在互補(bǔ)粘性末端（Km=0.6μmol/L)或平末端(Km=50μmol/L)。DNA連接反應(yīng)都是由T4DNA連接酶介導(dǎo)2.大腸桿菌DNA連接酶:不能催化平末端DNA分子連接三、DNA聚合酶1.大腸桿菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段):大腸桿菌DNA聚合酶I含有三種酶活性。Klenow片段含有二種酶活性（去除5’3’外切酶活性）。2.TaqDNA聚合酶:耐熱（75-80℃），分子量65kD,也具5’3’外切酶活性。反轉(zhuǎn)錄酶(RDDP):多功效酶，無3’5’DNA外切酶活性，含有3’5’RNA外切酶活性。第25頁工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，含有完整DNA聚合酶I53聚合、35外切活性，而無53外切活性。慣用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)識等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替換DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)識或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)識探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第26頁第四節(jié)慣用載體

定義載體是攜帶目標(biāo)基因進(jìn)入宿主細(xì)胞擴(kuò)增和表示工具。具備條件:①含有自主復(fù)制能力②有多個單一限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)（MCS）③含有選擇性遺傳標(biāo)識④分子量小⑤拷貝數(shù)高（10個～200個/細(xì)胞）⑥含有較高遺傳穩(wěn)定性。慣用載體:質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA第27頁EcoRⅠSacⅠKpnⅠSmaⅠBamHⅠXbaⅠSalⅠPstⅠSphⅠHindⅢpUC19(2686bp)AmprLacZ′

Oriori

pUC19質(zhì)粒載體圖第28頁質(zhì)粒

(plasmid):是細(xì)菌內(nèi)攜帶染色體外小型雙鏈環(huán)狀DNA，能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制。特點(diǎn):1.分子量相對較小能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在，能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；有較高拷貝數(shù)。2.含有一個以上遺傳標(biāo)志，便于在宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇。3.含有多個限制性酶單一切口，稱為多克隆位點(diǎn)。便于外源基因插入。第29頁慣用質(zhì)粒載體（一）

pBR322質(zhì)粒：由一系列大腸桿菌質(zhì)粒DNA經(jīng)過重組技術(shù)構(gòu)建成，長度為4.36kb，特點(diǎn)：（1）含有復(fù)制起始點(diǎn)和復(fù)制調(diào)整信號；（2）有單個EcoRI酶切位點(diǎn)，可切開插入目標(biāo)基因；（3）有抗四環(huán)素基因Ter+和抗氨芐青霉素基因Amp+，便于重組體細(xì)胞篩選。第30頁第31頁1.抗藥性標(biāo)識選擇第32頁（二）

pUC系列載體:由pBR質(zhì)粒與M13噬菌體構(gòu)建而成，長度為2.674kb，特點(diǎn)：①含有更小分子量和更高拷貝數(shù)。②“藍(lán)白斑”篩選:

pUC載體中LacZ′基因可編碼β-半乳糖苷酶（β-Gal）N端α-肽鏈，該α-肽與宿主細(xì)胞(如E.coliJM109）中F′因子上LacZ′△M15基因（α-肽缺點(diǎn)型）產(chǎn)物互補(bǔ)，產(chǎn)生完整、有活性β-半乳糖苷酶，分解生色底物（X-gal）形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因插入MCS后，LacZ′α-肽基因讀碼框被破壞，不能合成完整β-半乳糖苷酶分解底物X-gal，菌落呈白色。稱為“藍(lán)白斑”篩選。第33頁EcoRⅠSacⅠKpnⅠSmaⅠBamHⅠXbaⅠSalⅠPstⅠSphⅠHindⅢpUC19(2686bp)AmprLacZ′

Oriori

pUC19質(zhì)粒載體圖第34頁3．依據(jù)β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選:標(biāo)志補(bǔ)救lacZAmN2H片段COOH片段第35頁X-galLacZ藍(lán)色化合物X-gal第36頁第五節(jié)目標(biāo)基因獲取和體外重組化學(xué)合成法：較短基因（60-80bp）基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)一.目標(biāo)基因獲取:第37頁1.化學(xué)合成法獲取目基因由已知氨基酸序列推測可能DNA序列。較短基因（60-80bp）用途：PCR引物,測序引物,定點(diǎn)突變,核酸雜交探針第38頁組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶全部基因組DNA集合2.從基因組DNA文庫獲取目基因基因組DNA(genomicDNA):指代表一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息全部DNA序列第39頁構(gòu)建基因組DNA文庫基本過程

第40頁mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制3.從cDNA文庫獲取目基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTTcDNA:指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成、與RNA(mRNA或病毒RNA)互補(bǔ)單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈cDNA第41頁基因組文庫和cDNA文庫比較

第42頁P(yáng)CR技術(shù)基本過程模板DNAdNTP引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶循環(huán)儀94oC5’94℃55℃72℃4.PCR技術(shù)獲取目基因:第43頁二.外源基因與載體連接:體外重組DNA體外重組本質(zhì)上是一個酶促反應(yīng)過程，在DNA連接酶催化作用下，將外源DNA分子與載體DNA分子連接成一個重組分子過程。連接方式:（一）黏性末端連接（二）平末端連接（三）同聚物加尾連接（四）人工接頭連接（五）T-A克隆第44頁BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接1.粘性末端連接第45頁不一樣限制酶切位點(diǎn)連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體第46頁目基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目基因自連2.平端連接

第47頁DNA連接酶同聚物尾巴同聚物加尾法連接重組DNA分子同聚物加尾連接:在末端轉(zhuǎn)移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。第48頁利用人工合成接頭連接重組DNA分子4.人工接頭(linker)連接:由平端加上新酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接第49頁5.T-A克隆T-A克隆策略是一個直接將PCR產(chǎn)物插入到載體中方法。第50頁一、重組DNA分子導(dǎo)入選定受體細(xì)胞應(yīng)具備條件：1.易于接納重組DNA分子導(dǎo)入；2.對載體復(fù)制、擴(kuò)增和表示無嚴(yán)格限制；3.不存在特異性降解外源DNA酶系統(tǒng)；不對外源DNA進(jìn)行修飾；能表示重組體分子所提供某種表型特征。慣用導(dǎo)入方法:

（一）轉(zhuǎn)化（transformation）（二）轉(zhuǎn)染（transfection）（三）感染（infection）第六節(jié)重組DNA分子導(dǎo)入和篩選與判定第51頁轉(zhuǎn)化方法：1.氯化鈣法：細(xì)菌處于低溫、低滲CaCl2溶液中，菌細(xì)胞壁通透性增加，菌體膨脹成球形，經(jīng)短暫熱休克后重組DNA易進(jìn)入2.電穿孔法：除特殊儀器外比氯化鈣法更簡單，使用時注意電場強(qiáng)度、電脈沖長度、DNA濃度等參數(shù)。特殊處理受體細(xì)胞細(xì)胞膜特征改變（一）轉(zhuǎn)化（transformation）第52頁CaCl2處理受體細(xì)菌50-100mmol/LCaCl2

感受態(tài)細(xì)菌重組體轉(zhuǎn)入細(xì)菌第53頁（二）轉(zhuǎn)染

——將表示載體導(dǎo)入真核細(xì)胞過程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染

電穿孔:操作簡單且轉(zhuǎn)染效率高，幾乎可轉(zhuǎn)染任何細(xì)胞用于瞬時表示或穩(wěn)定表示。不過它需要專門儀器，確定最正確試驗(yàn)條件。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染:脂質(zhì)體（liposomes）是一個人造類脂膜.用脂質(zhì)體包裹DNA，瞬時表示和穩(wěn)定表示，操作簡單，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，且毒性低、包裝容量大，昂貴。

顯微注射:轉(zhuǎn)染效率高，但需要一定儀器和操作技巧。主要用于穩(wěn)定表示第54頁（三）感染（infection）感染是指以人工改造噬菌體或病毒為載體構(gòu)建重組體DNA，經(jīng)體外包裝成含有感染性噬菌體顆粒和病毒顆粒后，借助噬菌體或病毒外殼蛋白將重組DNA注入細(xì)菌或真核細(xì)胞。感染效率很高，但重組體DNA需經(jīng)過較為復(fù)雜體外包裝過程。第55頁(一）依據(jù)重組載體遺傳表型進(jìn)行篩選1．依據(jù)載體抗藥性標(biāo)識篩選2．依據(jù)載體抗藥性標(biāo)識插入失活選擇3．依據(jù)β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選4．依據(jù)插入外源基因性狀進(jìn)行篩選(二）限制性核酸內(nèi)切酶酶切判定（三）核酸分子雜交法（四）PCR法（五）免疫化學(xué)檢測法（六）DNA序列檢測：二.重組體篩選與判定第56頁1.抗藥性標(biāo)識選擇第57頁AmprTetrBamHⅠ位點(diǎn)BamHⅠ酶切BamHⅠ酶切DNA連接酶目DNA重組質(zhì)粒大腸桿菌含Amp平板含Amp平板含Tet平板

2.抗藥性標(biāo)識插入失活選擇第58頁3．依據(jù)β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選:標(biāo)志補(bǔ)救lacZAmN2H片段COOH片段第59頁X-galLacZ藍(lán)色化合物X-gal第60頁4．依據(jù)插入外源基因性狀進(jìn)行篩選

如把酵母基因組DNA隨機(jī)切割后插入到質(zhì)粒載體中，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到組氨酸缺點(diǎn)型大腸桿菌細(xì)胞中，并在無組氨酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這么只有含酵母組氨酸基因并取得表示轉(zhuǎn)化菌才能在無組氨酸培養(yǎng)基中生長。第61頁（二）.限制性核酸內(nèi)切酶酶切判定凝膠電泳檢測加樣孔DNAMarker空質(zhì)粒重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒酶切重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增片段第62頁原位雜交（三）.核酸分子雜交法:菌落雜交篩選法第63頁（四）.PCR法一些載體MCS兩側(cè)存在保守序列，如pGEM系列載體MCS兩側(cè)是T7及SP6開啟子序列，可依據(jù)此序列設(shè)計引物，對提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。假如已知目標(biāo)基因全序列或其兩端序列與全長，可設(shè)計合成一對引物，以轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若PCR產(chǎn)物與目標(biāo)基因預(yù)期長度相一致，那么即可初步篩選出含重組體陽性菌落。第64頁雞β肌球蛋白克隆和檢出（五）.免疫化學(xué)檢測法第65頁（六）.DNA序列檢測ACTGAAGGCT第66頁標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志，強(qiáng)開啟子，翻譯調(diào)控序列，多接頭克隆位點(diǎn)外源基因在原核細(xì)胞中表示：1．融合型表示蛋白所謂融合型表示是指將外源目標(biāo)基因與另一基因相拼接構(gòu)建成融合基因進(jìn)行表示。2．非融合型表示蛋白3．分泌型表示蛋白利用分泌型表示載體，需要在信號肽幫助下進(jìn)行。4．包涵體

1.原核表示體系第七節(jié)克隆基因表示第67頁E.coli表示體系不足：不宜表示真核基因組DNA；不能加工表示真核蛋白質(zhì)；表示蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusionbody)；極難表示大量可溶性蛋白第68頁優(yōu)點(diǎn)：可表示克隆cDNA及真核基因組DNA可適當(dāng)修飾表示蛋白質(zhì)表示產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時、經(jīng)濟(jì)2.真核表示體系（酵母、昆蟲、乳類動物細(xì)胞）第69頁真核表示載體大多是穿梭載體,通常包含以下元件：1．開啟子包含SV40、CMV、RSV及LTR等。2．增強(qiáng)子3．剪接信號4．終止信號和PolyA化信號5．遺傳選擇標(biāo)識：胸苷激酶基因（tk）、二氫葉酸還原酶基因（dhfr）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）、新霉素抗性基因（neor）等。第70頁新霉素抗性選擇系統(tǒng)

新霉素類似物G418（geneticin）對真核和原核細(xì)胞都有毒性。表示載體中攜帶neor基因編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶能使G418失活，所以當(dāng)真核細(xì)胞中導(dǎo)入了含neor基因載體后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞就能夠在含有G418培養(yǎng)基中生長而得以篩選。該選擇系統(tǒng)適合用于全部真核細(xì)胞。第71頁重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)關(guān)系非常親密并前景遠(yuǎn)大DNARecombinationTechniqueisCloslyRelatedwithMedicineandhasaGoodPerspective第72頁重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細(xì)胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及一些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診療試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂第73頁重組DNA技術(shù)操作主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體宿主篩選表型篩選酶切電泳判定菌落原位雜交第74頁一、A型題：1．以質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w菌過程稱為：A．轉(zhuǎn)化B．轉(zhuǎn)染C．轉(zhuǎn)導(dǎo)D．轉(zhuǎn)位E．感染2．最慣用篩選轉(zhuǎn)化細(xì)菌是否含有質(zhì)粒方法是：A．營養(yǎng)互補(bǔ)篩選B．抗藥性篩選C．免疫化學(xué)篩選D．原位雜交篩選E．Southern印跡篩選3.α互補(bǔ)篩選屬于：A．抗藥性標(biāo)志篩選B．酶聯(lián)免疫篩選C．標(biāo)志補(bǔ)救篩選D．原位雜交篩選E．免疫化學(xué)篩選4.溶原菌是指：

A．整合了噬菌體基因組細(xì)菌B．整合了質(zhì)粒基因組細(xì)菌

C．含有獨(dú)立噬菌體基因組細(xì)菌

D．含有獨(dú)立質(zhì)?；蚪M細(xì)菌