雞胚培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)

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第一節(jié)

雞胚接種一、雞胚的結(jié)構(gòu)雞胚是正在發(fā)育的活的機(jī)體，組織分化程度低，細(xì)胞代謝旺盛，適于許多人類和動(dòng)物病毒的生長(zhǎng)增殖，是常用的病毒分離培養(yǎng)方法之一（衣原體、立克次體的分離亦用雞胚）。目前，雞胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、皰疹病毒及腦炎病毒，尤其在禽類病毒的研究上應(yīng)用較多?？捎糜诓《镜姆蛛x、鑒定，抗原和疫苗制備，以及病毒性質(zhì)的研究等。雖然隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，不少病毒已不再用雞胚來(lái)分離培養(yǎng)，但對(duì)某些病毒來(lái)說(shuō)，雞胚仍是一種不可缺少的培養(yǎng)手段。雞胚培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是，來(lái)源充足，價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊設(shè)備或條件，易感病毒譜較廣，對(duì)接種的病毒不產(chǎn)生抗體等。當(dāng)然，雞胚培養(yǎng)也有其缺點(diǎn)，即除痘斑和雞胚死亡是特異性感染指征外，多需用第二試驗(yàn)系統(tǒng)來(lái)測(cè)定病毒存在與否；非SPF雞胚，亦可能含有對(duì)某些家禽病毒的母源抗體，甚至還可能帶有雞白痢沙門氏菌、霉形體、雞白血病等病毒。因此，用雞胚分離培養(yǎng)病毒時(shí)，必須考慮這些問(wèn)題。原則上應(yīng)使用非免疫蛋來(lái)孵雞胚，最好用SPF雞胚。一般說(shuō)來(lái)，孵育至8-14天的雞胚最有利于病毒的生長(zhǎng)，因?yàn)榇穗A段雞胚發(fā)育日趨完善，各種臟器均已形成，已能經(jīng)受接種物的適當(dāng)刺激，同時(shí)胚胎細(xì)胞幼嫩，骨胳不健全，還未長(zhǎng)出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同時(shí)也有利于收獲高滴度的病毒，14天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛漸生，已不便感染病毒，特別是已不利于收獲病毒材料。在操作雞胚時(shí)）一定要注意到這一點(diǎn)。孵育至21天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黃陷入胚胎腹部，另一部分則仍留在體外，胚胎已發(fā)育成小雞，破殼而出。雞胚的基本結(jié)構(gòu)如圖，從圖中可以看出，雞胚的最外層為石灰質(zhì)的卵殼，上有氣孔供氣體交換，卵殼之下為殼膜，很易與卵殼分離，其功能是使氣體分子與胚胎內(nèi)的液體分子在內(nèi)外進(jìn)行交換，因此在孵育時(shí)需要有一定的濕度和空氣。如果濕度太低，雞胚就容易脫水、引起雞胚死亡。氣流不通，雞胚缺氧，同樣會(huì)造成雞胚死亡。雞胚的鈍頭（俗稱“大頭”），是氣室，其功能是呼吸和調(diào)節(jié)胚內(nèi)壓力。殼膜之下為血管豐富的絨毛尿囊膜，其外層為絨毛膜，系外胚層形成，內(nèi)層為尿囊膜，系內(nèi)胚層形成，兩膜所夾為中胚層。由于胚胎的肺發(fā)育不完善，此時(shí)絨毛尿囊膜代行胚胎呼吸器官的作用，氣體的交換是在絨毛尿囊膜的血管內(nèi)通過(guò)卵殼進(jìn)行的。 尿囊腔是胚胎的排泄器官，內(nèi)含的尿囊液初為透明液體，成分極類似于生理鹽水溶液，以后則尿酸鹽含量增高。尿囊液量在11-13日齡時(shí)最高，平均達(dá)6毫升左右。羊膜是胚胎的最內(nèi)層包被，系外胚層和中胚層形成，羊膜腔內(nèi)含羊水，胚胎浸于其中，羊水在起初是單純的生理鹽水溶液，以后蛋白質(zhì)含量增加。羊水量在8-15日齡時(shí)最高，平均約為1毫升左右。附著于胚胎上的是卵黃囊，其膜系由內(nèi)胚層和中胚層形成，內(nèi)包卵黃，是胚胎發(fā)育的養(yǎng)料。卵的尖端（俗稱“小頭”）是卵白，是胚胎發(fā)育晚期的養(yǎng)料二、 雞胚培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用器械不雞胚培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)便，但一些最基本的設(shè)備仍需具備，它們包括：孵化箱、檢卵器、卵架、打孔器、鑷子、酒精燈、無(wú)菌眼科鑷子和剪刀、吸頭、洗耳球、注射器、適用的針頭、無(wú)菌試營(yíng)、平皿、三角瓶、燒杯、消毒膠布、石蠟和滅菌生理鹽水等。下面就一些最基本的設(shè)備作一簡(jiǎn)單介紹：孵化箱是給受精卵提供發(fā)育條件的設(shè)備，要求恒溫恒濕。市售專用孵化箱可自動(dòng)進(jìn)行氣體交換和翻蛋。實(shí)驗(yàn)室中，常用普通恒溫培養(yǎng)箱或恒溫室代替，要注意保持室內(nèi)濕度和人工翻蛋。檢卵器有市售專用檢卵器，在暗室中操作。也可根據(jù)條件向行設(shè)計(jì)，用木板制成一大小為35X25.5X15厘米的木盒，上半層為一暗室，上方開一小孔，以便于用眼檢視雞胚，兩側(cè)開大孔以供雙手伸入小暗室轉(zhuǎn)動(dòng)雞胚蛋和進(jìn)行標(biāo)記。木盒中間有一隔板，其中間部位開一卵形圓孔，木盒下層安裝有 100瓦燈泡，待檢胚蛋置于卵形孔上。開燈檢查，不必在暗室中進(jìn)行。打孔器可用剪刀代替.卵架孵育用盛放雞胚蛋的卵盤有市售專用者，實(shí)驗(yàn)操作中所用卵架可用木板制成小方盒，上面開一卵形孔。三、 雞胚的實(shí)驗(yàn)室孵育選擇實(shí)驗(yàn)室用雞卵，最好用白色薄殼雞蛋，其易于觀察胚胎的生活情況。實(shí)驗(yàn)用卵一般不宜保存過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，通常保存期不應(yīng)超過(guò) 10天，5天以內(nèi)最好。而且不宜在高溫下保存，通常保存于4~20C以10C條件下最好。適宜的孵育溫度為38~39C，相對(duì)濕度為45~60%，并注意空氣流通。孵育3天后每天應(yīng)翻卵1~2次，以保證氣體交換均勻，發(fā)育齊全，從而避免半邊發(fā)育現(xiàn)象的出現(xiàn)。孵后第四天用檢卵器對(duì)雞卵進(jìn)行檢視，檢出未受精卵和死亡的雞胚。經(jīng)四天孵育后，未受精卵不見有雞胚跡象，僅見模糊的卵黃暗影；受精卵則可見清晰的血管小團(tuán)，其中有雞胚跡象，較大的雞胚可見到胚胎主動(dòng)運(yùn)動(dòng)；瀕死或死亡的雞胚則見到胚胎運(yùn)動(dòng)呆滯或不運(yùn)動(dòng)，血管昏暗、折斷或漂落，這種雞胚應(yīng)剔出不用。四、雞胚的接種絨毛尿囊膜接種主要用于痘病毒和皰疹病毒的分離和增殖，這些病毒可在雞胚絨毛尿囊膜上形成痘斑和病斑。此外其它用于絨毛尿囊腔接種的病毒也可使用，而且收毒量更高，缺點(diǎn)是操作不易成功。選取10-13日齡的雞胚，照檢后，將氣室及胚胎位劃出，并在胚位附近無(wú)大血管處，劃一記號(hào)，用蛋鉆在卵殼上磨一裂縫（或用電烙器在卵殼上烙出一個(gè)直徑為2-3mm的烤焦圈），小心將蛋殼去掉，注意切勿損傷殼膜；在氣室中央也鉆一個(gè)小口，用針尖挑破殼膜，切勿損傷其下的絨毛尿囊膜，滴加1滴無(wú)菌生理鹽水于刺破處，用吸耳球緊貼氣室中央小口，造成負(fù)壓，即可見生理鹽水下沉，絨毛尿囊膜凹下，和殼膜分開，造成人工氣室。滴加0.05-0.1ml接種物于絨毛尿囊膜上，臘封口，封口部位朝上，不要翻動(dòng)， 37c培養(yǎng)。尿囊腔接種主要用于正粘病毒和副粘病毒，例如禽流感病毒和新城疫病毒的分離和增殖，馬腦炎病毒也常用、舊D、IBDV也可。選取9-11日齡的雞胚，照檢后，將氣室及胚胎位劃出，在氣室邊緣上打一小口，避開大血管處，注射器沿小口插入1-1.5cm，注入接種物0.1-0.2ml，臘封口。卵黃囊接種主要用于蟲媒批膜病毒以及鸚鵡熱衣原體和立克次氏體的分離和增殖。選取6-8日齡的雞胚，照檢后，將氣室及胚胎位劃出；垂直放置在卵座上，在氣室中央鉆一個(gè)小口，注射器沿小口插入3cm,注入接種物0.1-0.5ml，臘封口。羊膜腔接種主要用于正粘病毒和副粘病毒的分離和增殖，操作技術(shù)比較困難。開窗法：從氣室處去蛋殼開窗，從窗口用小鑷子剝開蛋膜，一手用平頭鑷子夾住羊膜腔向上提，另一手注射0.05-0.1ml接種物于腔內(nèi)，使蛋直立孵化，此法可靠，但胚胎易受傷而死，而且易污染。盲刺法：將雞胚放在燈光向上照射的蛋座上，使蛋轉(zhuǎn)動(dòng)使胚胎面向術(shù)者。在氣室頂部到邊緣的一半處打一孔，用40mn長(zhǎng)的針頭垂直插入，月深30mm以上。如已刺如羊膜腔，能使針頭撥動(dòng)胚即可注入接種物0.1-0.2ml，如針頭左右移動(dòng)時(shí)胚胎隨著移動(dòng)，則針頭已刺入胚胎，這時(shí)應(yīng)將針頭稍提起后再注射，石蠟封口。五.雞胚材料的收獲原則上接種什么部位，收獲什么部位。（1） 絨毛尿囊膜：用碘酊、酒精消毒接種部位及四周，揭去封閉處的卵殼。用滅菌鑷子擴(kuò)大開口處，輕輕夾起絨毛尿囊膜，用消毒剪刀剪下接種面及周圍的膜，置于滅菌生理鹽水的平皿中。（2） 尿囊腔接種：收獲前將雞胚置4°c冰箱中6h或過(guò)夜將雞胚凍死而使血液凝固，以免收獲時(shí)流血。用碘酊、酒精消毒氣室部位卵殼，以無(wú)菌鑷子擊破氣室端卵殼，沿氣室周圍剪去卵殼，撕去殼膜和絨毛尿囊膜，用鑷子輕輕壓住胚胎，以無(wú)菌吸管或注射器吸取尿囊液于滅菌試管內(nèi)。收集的液體應(yīng)清亮，渾濁則表明有細(xì)菌污染；呈血紅色，說(shuō)明血管破裂；黃色液體，可能卵黃囊被刺破。應(yīng)做無(wú)菌檢驗(yàn)。（3） 羊膜腔：首先收取尿囊液，方法同上。后用注射器插入羊膜腔內(nèi)收集，約可收到1ml液體，無(wú)菌檢測(cè)。（4） 卵黃囊：先首先收取尿囊液和羊膜腔液，后用吸管吸卵黃液。將整個(gè)內(nèi)容物傾入無(wú)菌平皿中，剪取卵黃膜保存。第四節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)常用設(shè)備準(zhǔn)備室的設(shè)備：?jiǎn)握粼魉粼髌?、雙蒸憎水蒸憎器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲(chǔ)品柜（放置未消毒物品）、儲(chǔ)品規(guī)（放置消毒過(guò)的物品）、包裝臺(tái)。配液室的設(shè)備：扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計(jì)（測(cè)量培養(yǎng)用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。培養(yǎng)室的設(shè)備：液氮罐、儲(chǔ)品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（-80°C）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺(tái)（書寫實(shí)驗(yàn)記錄）。必須放在無(wú)菌間的設(shè)備：離心機(jī)（收集細(xì)胞）、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、CO2孵箱（孵育培養(yǎng)物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機(jī)、4C冰箱（放置serum和培養(yǎng)用液）。無(wú)菌操作無(wú)菌室的滅菌：定期打掃無(wú)菌室：每周打掃一次，先用自來(lái)水拖地、擦桌子、超凈工作臺(tái)等，然后用3%。來(lái)蘇爾或者新潔爾滅或者0.5%過(guò)氧乙酸擦拭。CO2孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3%。新潔爾滅擦拭，然后用75%酒精擦拭或者0.5%過(guò)氧乙酸，再用紫外燈照射實(shí)驗(yàn)前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機(jī)、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘實(shí)驗(yàn)后滅菌：用75%酒精（3%新潔爾滅）擦拭超凈臺(tái)、邊臺(tái)、倒置顯微鏡的載物臺(tái)。實(shí)驗(yàn)人員的無(wú)菌準(zhǔn)備：肥皂洗手?？蓽p少手上的微生物。穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋。但是在潔凈工作臺(tái)上時(shí)就無(wú)需上述防護(hù)。如果你有長(zhǎng)頭發(fā)，則應(yīng)把它系在腦后。不要說(shuō)話或少說(shuō)話。如果感冒，則最好不要做組織培養(yǎng)工作。用75%酒精棉球擦凈雙手。無(wú)菌操作的演示：凡是帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)的酒精、PBS培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面靠近酒精燈火焰操作。器皿使用前必須過(guò)火滅菌繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時(shí)仍要過(guò)火。各種操作要靠近酒精燈，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。吸取兩種以上的使用液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。器械的清洗和消毒一、新的玻璃器皿的洗消：自來(lái)水刷洗，除去灰塵。烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5%稀鹽酸中12小時(shí)以除去臟物、鉛、砷等物。刷洗、烘干：12小時(shí)后立即用自來(lái)水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來(lái)水沖干凈后用烤箱烘干。泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml:蒸餾水1000ml）浸泡12小時(shí)，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來(lái)水沖洗15次，最后蒸餾水沖洗3-5次和用雙蒸水過(guò)3次。烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，當(dāng)蒸氣成直線上升時(shí)，關(guān)閉安全閥，當(dāng)指針指向15磅時(shí)，維持20-30分鐘。高壓消毒后烘干二、舊的玻璃器皿的洗消：1.刷洗、烘干：使用過(guò)的玻璃器皿可直接泡入來(lái)蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過(guò)來(lái)蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液），12小時(shí)后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來(lái)水沖洗（避免蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗3次烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲(chǔ)存及防止灰塵和再次被污染。高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)，蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣，當(dāng)蒸氣成直線冒出3-5分鐘后，關(guān)閉安全閥，氣壓表指數(shù)隨之上升，當(dāng)指針指向15磅時(shí)，調(diào)節(jié)電開關(guān)維持20-30分鐘即可。（玻璃培養(yǎng)瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上）烘干備用：因?yàn)楦邏合竞笃髅髸?huì)被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內(nèi)烘干備用。金屬器械洗消：金屬器皿不能泡酸，洗消時(shí)可先用洗滌劑刷洗，后用自來(lái)水沖干凈，然后用75%酒精擦拭，再用自來(lái)水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi)15磅高壓（30分鐘）消毒，再烘干備用。橡膠和塑料：橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來(lái)水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據(jù)不同品質(zhì)進(jìn)行如下的處理程序：1.針式濾器帽不能泡酸液，用NaOHfi6-12小時(shí)，或者煮沸20分鐘，在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時(shí)注意光面朝上（凹向上），然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內(nèi)15磅30分鐘消毒，再烘干備用。注意在超凈臺(tái)內(nèi)取出使用時(shí)應(yīng)該立即將螺旋旋緊。膠塞烘干后用2%氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過(guò)的膠塞只要用沸水處理30分鐘），自來(lái)水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來(lái)水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。膠帽，離心管帽烘干后只能在2%氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時(shí)（切記時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)），自來(lái)水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來(lái)水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。膠頭可用75%酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，凍存管：其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用 70%酒精浸泡消毒。塑料培養(yǎng)皿打開蓋子，放在超凈臺(tái)臺(tái)面上，直接暴露在紫外線下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周時(shí)間洗除殘留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射線消毒塑料制品效果最好。為了防止清洗器材已消毒與末消毒發(fā)生混淆，可在紙包裝后，用密寫墨水作好標(biāo)記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水，在包裝紙上作一記號(hào)，平時(shí)這種墨水不帶痕跡，一經(jīng)高溫，即出現(xiàn)字跡，從而可以判定它們是否消毒。密寫墨水的配制：氯化鉆（CoC126H2o）2g,30%鹽酸10m1,蒸餾水88m1。注意事項(xiàng)：嚴(yán)格執(zhí)行高壓鍋的操作規(guī)程：高壓消毒時(shí)，先檢查鍋內(nèi)是否有蒸餾水，以防高壓時(shí)燒干，水不能過(guò)多因?yàn)槠鋵⑹箍諝饬鲿呈茏?，?huì)降低高壓消毒效果。檢查安全閥是否通暢，以防高壓時(shí)爆炸。安裝濾膜時(shí)注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過(guò)濾的作用。注意人體的防護(hù)和器皿的完全浸泡：A.泡酸時(shí)要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。B.從酸缸內(nèi)撈取器皿時(shí)防止酸液濺到地面，會(huì)腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制與消毒器材與試劑：干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素.純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計(jì)、磁力攪拌器。具體步驟：水的制備：細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水二PBS的制備與消毒（也可用于其它BSS女口：Hanks,D-Hanks液的配制）:溶解定容：將藥品（NaCI8.0g,KCl0.2g,Na2HPO4H2O1.56g,KH2PO40.2g）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。移入溶液瓶?jī)?nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。胰蛋白酶溶液的配制與消毒：胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37C時(shí)，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時(shí),應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過(guò)度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS女口：D-Hanks液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25%，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4°C內(nèi)過(guò)夜。用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20C保存以備使用。青、鏈霉素溶液的配制于消毒所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是80萬(wàn)單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬(wàn)單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬(wàn)單位。使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。1單位=1微克？RPMI1640的制備與消毒：溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中，并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次（沖洗液一并加入培養(yǎng)基中），充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙獠凑瞻b說(shuō)明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml,使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml。然后用一個(gè)當(dāng)量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。最后定容至1000ml，搖勻。安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過(guò)濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過(guò)濾。分裝：將過(guò)濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶?jī)?nèi)置于4C冰箱內(nèi)待用。使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4C時(shí)兩周有效）六?血清的滅火：細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來(lái)的血清要在 56C水浴中滅火30分鐘后，再經(jīng)過(guò)抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。HEPES溶液：HEPES勺化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N'-a-hydroxythylpiperazine-N'-ethanesulfanicacid）。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的 pH范圍。使用終濃度為 10-50mmol/L,一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES口可達(dá)到緩沖能力。1mol/LHEPE緩沖液配制方法如下：準(zhǔn)確稱取HEPTS238.3g,加入新鮮三蒸水定容至1L。過(guò)濾除菌，分裝后4C保存。注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售HEPE為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES勺終濃度仍然為20mmol/L。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過(guò)濾除菌后可完全（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。谷氨酰胺：合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定， 4°C下放置1周可分解50%，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20C冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4C冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來(lái)的谷氨酰胺。一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為14mmol/L?？梢耘渲?00mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時(shí)加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過(guò)濾除菌，分裝小瓶，-20C保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。肝素溶液的配制：含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時(shí)，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過(guò)夜，然后過(guò)濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為-C。使用時(shí)，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可。十J型膠原酶：0.1%1型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)?型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過(guò)濾，因此可以用蔡式濾器過(guò)濾除菌。分裝入10ml小瓶-20C保存。十一.明膠溶液：因?yàn)槊髂z難于過(guò)濾，所以配制0.1%明膠溶液必須用無(wú)菌的PBS配制。所以制備過(guò)程中必須要注意無(wú)菌操作。首要的問(wèn)題是如何無(wú)菌準(zhǔn)確稱量0.1克（配成100ml溶液）一即解決無(wú)菌分裝藥品的問(wèn)題。其次要注意即使是01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過(guò)夜放置，然后無(wú)菌分裝入 50ml小瓶中，4C保存。其他培養(yǎng)用液的配制：20ug/ml內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，注意事項(xiàng)：配制溶液時(shí)必須用新鮮的蒸餾水。安裝蔡式濾器時(shí)通常使用孔徑0.45微米和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。配制RPMI1640培養(yǎng)基時(shí)因?yàn)檫€要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液PH值最終為7.2,可在配制時(shí)調(diào)PH至7.4。細(xì)胞傳代培養(yǎng)（消化法）具體操作：傳代前準(zhǔn)備：預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、 PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37C水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。用75%酒精擦拭經(jīng)過(guò)紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手。正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞。打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。胰蛋白酶消化；加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS青洗湃洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫度是37CO 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。吹打分散細(xì)胞：吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。分裝稀釋細(xì)胞：分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。注意密度過(guò)小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5X105/ml。最后要做好標(biāo)記。繼續(xù)培養(yǎng)：用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時(shí)后開始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長(zhǎng)細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25%時(shí)為一個(gè)+,占50%為+十，占75%時(shí)為++十。傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)：嚴(yán)格的無(wú)菌操作適度消化：消化的時(shí)間受消化液的種類、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過(guò)程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。附：EDTA（0.02%乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：EDTA0.20g,NaCl8.00g,KCl0.20g,KH2PO40.02g,葡萄糖2.00g,0.5%酚紅4ml,加入蒸餾水定容至1000mlo10磅20min高壓滅菌，使用時(shí)調(diào)節(jié)PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培養(yǎng)瓶要徹底清洗，否則再培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞容易脫壁.細(xì)胞的復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇的原則-快速融化：必須將凍存在-196C液氮中的細(xì)胞快速融化至37C，使細(xì)胞夕卜凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶， 對(duì)細(xì)胞造成損害。具體操作一.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：將水浴鍋預(yù)熱至37r用75%酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。二?取出凍存管：根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)。從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。迅速解凍：迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。平衡離心：用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min離心3min制備細(xì)胞懸液：吸棄上清液。向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)：細(xì)胞濃度以5X105/ml為宜。培養(yǎng)細(xì)胞將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶放入 37C和5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(shí)（或者24-48小時(shí)）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。初學(xué)者易犯錯(cuò)誤：1水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37r。水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長(zhǎng)。離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。一次復(fù)蘇細(xì)胞過(guò)多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過(guò)測(cè)定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。具體操作：一.準(zhǔn)備工作：取一瓶傳代的細(xì)胞，按照《傳代細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）》中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層后以被使用。細(xì)胞懸液制備：細(xì)胞懸液的制備方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測(cè)細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)：蓋好蓋玻片：取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中，加入5滴臺(tái)盼藍(lán)染液（0.4%）或苯胺黑，活細(xì)胞不會(huì)被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測(cè)細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個(gè)大鉻（每個(gè)大格含有16個(gè)中鉻）中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)：按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml= （四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4）x2X104說(shuō)明：公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。公式中乘以2因?yàn)榧?xì)胞懸液于染液是1：1稀釋。公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：四.細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/ml,如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)右線，不計(jì)左線。操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤：計(jì)數(shù)前未將待測(cè)懸液吹打均勻。滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。滴入懸液時(shí)的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。本實(shí)驗(yàn)特殊試劑的配制：4%臺(tái)盼藍(lán)母液：稱取4克臺(tái)盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過(guò)濾，4°C保存。使用液：使用時(shí)，用PBS稀釋母液至0.4%即可。細(xì)胞的凍存先將凍存管放入4C冰箱，約40min。接著置于-20C冰箱，約30-60min。置于-80超低溫冰箱中放置過(guò)夜。置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。5同時(shí)做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄注意事項(xiàng)：使用DMSOU，不需要進(jìn)行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會(huì)破華它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下， DMS對(duì)人體有害，故在配制時(shí)最好戴上手套操作。不宜將凍存細(xì)胞放置在0C-60C這一溫度范圍內(nèi)過(guò)以，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危險(xiǎn)溫區(qū)”。注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時(shí)添加。雞胚原代細(xì)胞培養(yǎng)（雞胚成纖維細(xì)胞的制作）取9-11日齡的雞胚，將胚蛋氣管端向上，用碘酊、酒精消毒氣室，以鑷子擊碎卵殼并棄之，沿氣室周圍剪去卵殼，撕去殼膜和絨毛尿囊膜，取出胚胎于滅菌平皿中。剪去頭部、翅爪及內(nèi)臟，以Hanks液沖洗體表數(shù)次，移入滅菌小瓶中，在用剪刀剪成小塊，使其成為約1mm3t小的碎塊，以Hanks液沖洗體表數(shù)次；自水浴中取出預(yù)熱的0.25%胰酶適量，一個(gè)雞胚約需5ml胰酶，37C水浴消化15-20分鐘，其間每5分鐘輕搖一次，至液體變得混而稍稠，此時(shí)再輕搖可見組織塊懸浮在液體內(nèi)而不易下降時(shí)則終止消化，吸棄胰酶，再以Hanks液沖洗三次，經(jīng)大口吸管吹打分散，以少許營(yíng)養(yǎng)液（DME培養(yǎng)液、10%賣牛血清、青鏈霉素500U/ml，PH7.2-7.4）輕輕懸浮，經(jīng)8層紗布過(guò)率，收集的細(xì)胞經(jīng)計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度至106個(gè)/ml，混勻，分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于CO2培養(yǎng)箱中37C培養(yǎng)24h-48h。長(zhǎng)成單層的細(xì)胞換液，加入維持液：DME培養(yǎng)液、5%賣牛血清、青鏈霉素500U/ml，PH7.2第三章電子顯微鏡技術(shù)觀察病毒（2學(xué)時(shí)）教學(xué)目的：熟悉掌握病毒的電子顯微鏡觀察技術(shù)。教學(xué)重點(diǎn)：樣品的基本制備技術(shù)。教學(xué)難點(diǎn)：病毒電鏡樣品的制備?；窘虒W(xué)內(nèi)容：第一節(jié)電子顯微鏡技術(shù)概述電子顯微鏡的發(fā)展光學(xué)顯微鏡發(fā)明后，即成為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和其他學(xué)科不可缺少的研究工具?？梢钥吹皆S多微生物和構(gòu)成生物的基本單元一細(xì)胞。但隨著人類認(rèn)識(shí)的逐步深化，對(duì)觀察微小物體的要求越來(lái)越高。大型電子顯微鏡20~100萬(wàn)倍0.144~0.34nm中型電子顯微鏡5~20萬(wàn)倍0.34~1.0nm小型電子顯微鏡5萬(wàn)倍以下1.0nm以上電子顯微鏡的分類透射電子顯微鏡2掃描電子顯微鏡其主要特點(diǎn)是景深大，圖像富有立體感，制樣簡(jiǎn)便，在觀察形貌的同時(shí)，還可以利用樣品發(fā)出的其他信息在微小區(qū)域上作成份分析和晶體結(jié)構(gòu)分析。第二節(jié)電鏡樣品的基本制備技術(shù)一.超薄切片超薄切片法是研究病毒特征以及病毒與細(xì)胞之間相互作用的有效手段。將組織或細(xì)胞樣品，加入2.5%PH7.2戊二醛進(jìn)行前固定，4C24小時(shí)；用PH7.2PBS中洗三次，每次10分鐘；用2%四氧化餓在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行后固定1.5-2小時(shí)；用PH7.2PBS?中洗三次，每次10分鐘；分別用濃度為50%、70%、80%、90%、100%的乙醇進(jìn)行脫水，每次10-15分鐘，100%乙醇中脫水三次，其它濃度中各一次；用1：1的100%乙醇和丙酮、純丙酮各置換一次，每次10分鐘；用純丙酮和環(huán)氧樹脂包埋劑按濃度梯度對(duì)樣品進(jìn)行浸透；將樣品置于恒溫培養(yǎng)箱中聚合；用ULTRACDTB超薄切片機(jī)進(jìn)行切片，將切片用載網(wǎng)撈起，放入培養(yǎng)皿中；用醛酸雙氧鉑、檸檬酸鉛分別對(duì)樣品染色15-20分鐘，雙蒸水中洗干燥后放入培養(yǎng)皿中待檢。二.負(fù)染色負(fù)染色也叫陰性反差染色。這種染色法是用重金屬鹽類溶液與樣品混合而使樣品呈現(xiàn)出良好的反差。經(jīng)這種方法染色的生物樣品，在電鏡下是暗背景下的亮物體像，與通常的染色性質(zhì)相反，所以稱之為負(fù)染色。分辨力高，可以看到病毒的亞單位結(jié)構(gòu)；在較段時(shí)間內(nèi)可得負(fù)染色的主要特點(diǎn)是反差強(qiáng)，分辨力高，可以看到病毒的亞單位結(jié)構(gòu)；在較段時(shí)間內(nèi)可得出結(jié)果。磷鑰酸、醋酸鈾等。最常用的是：PH6.8磷鑰酸、醋酸鈾等。最常用的是：PH6.8的2%被觀察的材料最好是比較純凈的病毒懸液。磷鴇酸溶液適用于多種病毒。被觀察的材料最好是比較純凈的病毒懸液。掃描電鏡樣品的制備掃描電鏡具有分辨率高和景深長(zhǎng)等特點(diǎn)，因此圖像層次豐富，立體感強(qiáng)，能夠顯示細(xì)胞和組織的三維結(jié)構(gòu)形貌，廣泛應(yīng)用于生物樣品表面及其斷面微結(jié)構(gòu)的觀察.免疫電鏡免疫電鏡技術(shù)是把免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，使之兼有兩方面的特性,所以是研究抗原-抗體相互作用的一種方法.抗原-抗體之間的相互作用是免疫化學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)，它具有高度的特異性，結(jié)合電鏡的高分辨能力和放大本領(lǐng)，可在超微結(jié)構(gòu)和分子水平研究各種組織和細(xì)胞內(nèi)的免疫反應(yīng)，并能精確定性、定位和半定量，使形態(tài)與機(jī)能緊密結(jié)合。第四章病毒和病毒成分的提純（2學(xué)時(shí)）教學(xué)目的：熟悉掌握病毒和病毒成分的提純。教學(xué)重點(diǎn)：病毒提純的具體操作方法。教學(xué)難點(diǎn)：超速離心法提純病毒的原理和方法。基本教學(xué)內(nèi)容：第一節(jié)病毒的提純病毒的提純，就是應(yīng)用各種物理、化學(xué)方法，以不使病毒受損傷和失活為前提，去除宿主細(xì)胞組分等非病毒雜質(zhì)，提取出高純度濃度的病毒樣品。病毒的純度只是一個(gè)相對(duì)的概念，通常以下列幾點(diǎn)作為判定依據(jù)（1）物理均一性（2） 病毒滴度與蛋白質(zhì)含量的比例（3） 免疫學(xué)反應(yīng)（4） 結(jié)晶形成一-沉淀法中性鹽沉淀法病毒一般在45%以上飽和度的硫酸銨溶液中沉淀，保持其感染性。聚乙二醇沉淀法聚乙二醇（PEG為水溶性非離子型聚合物，具有各種不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量為2000~6000的PEG將PEG配置成50流右的溶液，或直接將固體PEG加于病毒懸液中，使其達(dá)到所需濃度，通常在 4c攪拌過(guò)夜，然后離心使病毒沉淀。3有機(jī)溶劑沉淀法4等電點(diǎn)沉淀法二.層析法葡聚糖柱層析法凝膠層析法離子交換纖維素柱層析法親和層析法.紅細(xì)胞吸附法所謂病毒的紅細(xì)胞凝集反應(yīng)，就是指病毒被紅細(xì)胞表面粘蛋白吸附的現(xiàn)象。電泳法超速離心法病毒經(jīng)初步濃縮之后，要進(jìn)一步純化，通常采用超速離心法差速離心法差速離心法適用于從組織培養(yǎng)液、雞胚尿囊液或經(jīng)過(guò)紅細(xì)胞吸附-釋放的病毒懸液中提純病毒。以差速離心法分離提純病毒時(shí)，經(jīng)常以低速（2000~3000rpm，20-30分鐘）及中速（10000rpm，20-30分鐘）去除較大的宿主細(xì)胞碎片、污染的細(xì)菌及其他較大的雜質(zhì)。然后，選擇在60分鐘內(nèi)能夠沉淀80%以上的病毒粒子的較高速度，離心1-2小時(shí)，使病毒沉淀。對(duì)中、大型病毒如流行性感冒病毒，在經(jīng)紅細(xì)胞吸附一稀釋后，于25000rpm,離心60分鐘，即可達(dá)到目的。小型病毒如脊髓灰質(zhì)炎、披膜病毒，則需以35000-45000rpm離心1-2小時(shí)。速度區(qū)帶離心法是根據(jù)被分離物質(zhì)在強(qiáng)大離心力中沉降速度不同而進(jìn)行的分離方法。介質(zhì)可以為均一密度，也可以梯度密度。當(dāng)被分離的物質(zhì)沉降到與介質(zhì)密度相等的區(qū)域是就不再沉降。不同分子形成不同的區(qū)帶，稱為速度區(qū)帶。常用的介質(zhì)為蔗糖、甘油、聚蔗糖。常用的梯度范圍從5%-20%:10%-60%。3-平衡密度梯度離心法大多數(shù)病毒的浮密度在1.10-1.40范圍內(nèi)；所制備密度范圍為1.0-1.7的懸浮介質(zhì)，便可滿足大多數(shù)病毒密度梯度離心的需要。超濾法利用超濾膜將水、鹽及小分子濾過(guò)，將一定大小的大分子或病毒等顆粒截住從而使后者得到濃縮的一種方法。第二節(jié)病毒蛋白亞單位的分離第三節(jié)病毒核酸的抽提第五章病毒的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷（4學(xué)時(shí)）教學(xué)目的：熟悉掌握病毒的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷方法。教學(xué)重點(diǎn)：病毒的血清學(xué)診斷。教學(xué)難點(diǎn)：病毒感染力的滴定和中和實(shí)驗(yàn)?；窘虒W(xué)內(nèi)容：第一節(jié)病毒的初步鑒定病毒增殖的判定病毒在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體、雞胚和組織培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)增殖，顯然都會(huì)影響機(jī)體和細(xì)胞和生命活動(dòng)，并經(jīng)常通過(guò)一定的形態(tài)學(xué)和病理學(xué)變化表現(xiàn)出來(lái)。細(xì)胞病變（CPE細(xì)胞病變是病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖內(nèi)增殖及其對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損害的最明顯的表現(xiàn)， 包括胞漿的顆粒變性、胞核的變形和破裂。細(xì)胞病變經(jīng)常具有病毒“種”的特性，可以作為病毒鑒定的依據(jù)之一。細(xì)胞代謝的測(cè)定PH值下降抗原的測(cè)定病毒間的干擾現(xiàn)象病毒感染力的滴定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物測(cè)定LD50（半數(shù)致死量）雞胚上的EID50（半數(shù)雞胚感染量組織細(xì)胞上測(cè)定TCID50（半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量）Reed-Muench法病毒液稀釋度細(xì)胞管觀察結(jié)果累計(jì)細(xì)胞管樹E細(xì)胞管總數(shù)出現(xiàn)CPEffl胞管所占的％ /—-—\—出現(xiàn)CPE管不出現(xiàn)CP管E出BCPE管不出現(xiàn)CP管10-180270:27[100（27/27）10-2801901910010-371111129119/19）10-4354610（40偵勸0）10-517113140.7（1/14）10-608021210（0/21）出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE以及血凝素等的細(xì)胞管數(shù)分別列于表14-2的第2和第3列，它們的累計(jì)數(shù)分別列于第4和第5列（根據(jù)箭頭所示方向），第6列為細(xì)胞管總數(shù)，第7列為出現(xiàn)細(xì)胞病變的細(xì)胞管數(shù)占細(xì)胞管總數(shù)的百分率。 可見該病毒株的TCID。在10-3（91.6%）和10-4（40%之間，其確切稀釋倍數(shù)可按下列公式計(jì)算:91.6（高于50%勺百分?jǐn)?shù)）一50 41.60.891.6（高于50%勺百分?jǐn)?shù)）一40（低于50%勺百分?jǐn)?shù)）51.6將由上式獲得的0.8加在高于50溉亡的稀釋度的對(duì)數(shù)（3）上，因此該病毒的TCID50應(yīng)是0.1ml10-3.8稀釋的病毒液。查反對(duì)數(shù)，得6310,即該病毒6310倍稀釋液0.1ml等于1個(gè)TCID。5。病毒理化特性的測(cè)定病毒核酸型鑒定是DNA病毒，還是RNA病毒？脂溶性敏感性試驗(yàn)（1） 乙醚敏感性試驗(yàn)（2） 氯仿敏感性試驗(yàn)?zāi)退嵝栽囼?yàn)胰蛋白酶敏感試驗(yàn)?zāi)蜔嵝栽囼?yàn)病毒粒子大小測(cè)定第二節(jié)病毒的免疫-血清學(xué)檢測(cè)1.中和試驗(yàn)中和抗體：動(dòng)物在受到病毒感染后，體內(nèi)產(chǎn)生抗體，如果該抗體能與相應(yīng)的病毒粒子特意性地結(jié)合，使后者喪失感染力，這種抗體稱為中和抗體。中和抗體一般是針對(duì)病毒的蛋白衣殼或囊膜抗原的， 并不是針對(duì)病毒粒子的內(nèi)部成分。應(yīng)用已知的病毒或病毒抗原，可以測(cè)知患病動(dòng)物體內(nèi)中和抗體的存在及其效價(jià)。應(yīng)用已知的抗病毒血清或中和性單克隆抗體， 也可以進(jìn)行病毒的鑒定，因此中和試驗(yàn)也常用于新分離病毒株的鑒定。中和試驗(yàn)具有高度的敏感性和免疫特意性，?？捎靡詡刹炱渌鍖W(xué)反應(yīng)難以測(cè)出的病毒株之間的抗原差異。進(jìn)行中和試驗(yàn)，首先要選擇試驗(yàn)宿主。（1）終點(diǎn)法中和試驗(yàn)有固定病毒一稀釋血清法和固定血清一稀釋病毒法固定病毒一稀釋血清法：將不同稀釋度的血清與固定量的病毒液（一般100個(gè)TCID50EID50、LD50混合，置適當(dāng)?shù)臈l件下感作一定時(shí)間以后，再將血清-病毒混合物接種于敏感細(xì)胞、雞胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物，測(cè)定被檢血清阻止組織培養(yǎng)細(xì)胞、雞胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物發(fā)生病毒感染的能力及其效價(jià)。以能保護(hù)50%&織培養(yǎng)細(xì)胞、雞胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物不發(fā)生病變、感染或死亡的血清最高稀釋倍數(shù)，作為該血清的50呦和效價(jià)。病毒稀釋---血清---感作一

對(duì)照一接種一觀察和解釋一蝕斑減數(shù)試驗(yàn)蝕斑：用稀釋的病毒液感染單層細(xì)胞，由于其致細(xì)胞病變作用，而在單層細(xì)胞上形成蝕斑。從理論上講，一個(gè)病毒粒子形成一個(gè)蝕斑，因此根據(jù)蝕斑的大小、形狀和色澤等性狀，選擇不同的代表進(jìn)行移植傳代，就有可能獲得若干不同的純系毒株。但在實(shí)際上，一個(gè)蝕斑往往由幾十個(gè)乃至幾百個(gè)病毒粒子形成。因此，由一個(gè)蝕斑分離獲得的毒株常是許多個(gè)病毒的后代，需要進(jìn)行反復(fù)多次的蝕斑分離，才有可能獲得來(lái)源一個(gè)病毒粒子的“純系”病毒。病毒+正常動(dòng)物血清蝕斑數(shù)（平均）待檢血清稀釋+病毒中和后蝕斑數(shù)（平均）能使病毒蝕斑減少50%勺血清稀釋度。交叉保護(hù)試驗(yàn)血凝和血凝抑制實(shí)驗(yàn)病毒+紅細(xì)胞f凝集血凝的條件和特點(diǎn)：1822C最適宜操作方法：取血凝板，做好標(biāo)記.按表1順序和劑量加入各種材料表1.紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)的操作程序 單位：ul病毒稀1:2121:231:231:241:251:261:271:281:291:2101:211對(duì)釋度生理鹽25T25]25252525)25[}\}\2525}\}\25 25[2525 2525}\}\25}\25棄照八水 }\病毒25液}\}\25252525251%紅細(xì)25252525252525 2525252525搖勻，放室溫30min，觀察結(jié)果。結(jié)果判定操作方法：2取血凝板作好標(biāo)記按表4表搠順紅緬劑量加入各種材料操作順序按表4表搠順紅緬劑量加入各種材料操作順序單位：ul血清稀釋度1:211:221:241:2525、1:261:271:281:291:210血1清病毒血球?qū)φ諏?duì)照對(duì)照生理鹽水252&\J25rA2525J\2525252550抗血清252525252525252525棄25——病毒液252525252525252525—25—1。卸細(xì)胞252525252525252525252525提高了病毒病的診斷水平。病毒病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)已從常規(guī)的病毒分離鑒定以及抗原和抗體的免疫學(xué)檢測(cè)，進(jìn)入可對(duì)病毒基因序列和結(jié)構(gòu)直接進(jìn)行測(cè)定的分子生物學(xué)水平。病毒病的分子生物學(xué)診斷，包括對(duì)病毒核酸（ DNA或RNA和蛋白等的測(cè)定，關(guān)鍵在于測(cè)定這些分子的特異性序列或結(jié)構(gòu)。病毒基因往往含有特異序列，可以用核酸雜交的方法予以檢出，而這段序列的存在則說(shuō)明了相應(yīng)病毒的存在。雖然病毒是嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的最小、最簡(jiǎn)單的生命形式，但也具有與宿主細(xì)胞不同的獨(dú)特的核酸序列和基因結(jié)構(gòu)。常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)包括基因組電泳分析、DNA酶切圖譜分析、寡核苷酸指紋圖、核酸雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR等。其中核酸雜交和PCF技術(shù)又以其特異、快速、敏感、適于早期和大量樣品的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)今病毒病診斷中最具有應(yīng)用價(jià)值的方法。DNA雜交的靈敏度已經(jīng)提高到0.05pg/ul，也就是說(shuō)，只要有1000個(gè)DNA拷貝，就可能被檢測(cè)出來(lái)。使用PCRS至可以檢測(cè)出一個(gè)拷貝的DNA分子。第一節(jié)病毒核酸的提取技術(shù)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或組織單細(xì)胞懸液的裂解a） 于4C以2000g離心5分鐘收集細(xì)胞，以10倍體積用冰預(yù)冷的無(wú)鈣鎂離子磷酸緩沖液懸沉淀，洗滌細(xì)胞3次，每次均用大口徑的吸管輕輕吹打細(xì)胞沉淀， 使其徹底分散。b） 估計(jì)細(xì)胞沉淀的體積，用10-20倍體積的RNA提取緩沖液重懸之。c） 加入與步驟b）所加RNA提取緩沖液體相同的蛋白酶消化緩沖液，用振蕩器迅速混勻。用裝有21號(hào)針頭的皮下注射器抽吸細(xì)胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內(nèi)。重復(fù)3-4次，剪切DNA。d）加蛋白酶K至終濃度為200pg/ml,充分混勻后置于37C溫育30分鐘。蛋白酶K以貯存的形式保存，貯存液為20pg/ml蛋白酶K水溶液。二提取步驟1） 用等體積酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白質(zhì)。2） 用吊桶式轉(zhuǎn)頭于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機(jī)相分相，將水相吸至一個(gè)新的離心管內(nèi)，加2.5倍體積用冰預(yù)次序的乙醇，充分混勻，于0C放置1小時(shí)。3） 于0C以5000g離心10分鐘沉淀RNA棄上清，用含0.1mol/L乙酸鈉（pH5.2）的70%乙酸洗滌沉淀，用自動(dòng)微量移液器盡可能將乙醇吸盡，隨后于室溫放置幾分鐘，晾干沉淀。切勿抽干沉淀，因?yàn)楦傻暮怂岢恋砗茈y溶解。4）每個(gè)直徑為90mm的培養(yǎng)皿或每107細(xì)胞加200pl50mmol/LTris.Cl（pH7.8）1mmol/LEDTA（pH8.0）溶液重溶沉淀。5） 分別按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫蘇糖醇（DTT，然后分別按1000單位/或10mmol/L的終深度加臺(tái)盤RNA酶抑制劑或氧釩核苷復(fù)合物。6） 加入無(wú)RNA酶的胰DNA酶I至終濃度為2pg/ml,混勻，于37C溫育60分鐘7） 分別按10mmol/L和0.2%的終濃度加EDTA和SDS8）用等體積酚：氯仿抽提1次。9）于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機(jī)相分相，將水相吸至另一個(gè)離心管內(nèi)，加3mol/L乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L,加2.5倍體積用冰預(yù)次的乙醇，充分混勻，冰浴放置2小時(shí)。10） 用微量離心機(jī)于4C以12000g離心5分鐘沉淀RNA11）吸出所有的乙醇，將打開管蓋的離心管在實(shí)驗(yàn)臺(tái)放置幾分鐘，讓最后殘存的痕量乙醇揮發(fā)干凈。12）用200plTE（pH7.6）重溶沉淀，力口500Pl乙醇，于一70C貯存?zhèn)溆?。回收DNA時(shí)，只須取出1小份貯存液，加入3mol/L乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L，充分混勻，用微量離心機(jī)于4C以12000g離心5分鐘即可。三注意事項(xiàng)1測(cè)定最終所得溶液的OD260值可以確定RNA的濃度。取10Pl乙醇/TE混合液［步驟13） ］離心沉淀RNA以400水重溶，測(cè)定OD260值，OD260=1的RNA溶液每毫升約含40pgRNA如果需要，可用oligo（dT）一纖維素層析法從所制備的細(xì)胞總RNA中純化無(wú)寡脫氧核糖核苷酸污染的mRNA或購(gòu)買試劑盒進(jìn)行mRNA勺純化。某些情況下（例如從感染了DNA病毒或用DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中制備RNA寸），必須從細(xì)胞總RNA中去除寡脫氧核核苷酸。否則，當(dāng)用這種RNA勾建cDNA庫(kù)或進(jìn)行引物延伸反應(yīng)時(shí)應(yīng)會(huì)出問(wèn)題，反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中法染的模板DNA片段可能會(huì)與RNA雜交而充當(dāng)引物，從而導(dǎo)致物定mRNA5末端定位的錯(cuò)誤或產(chǎn)生截短的cDNA克隆。a） 步驟12后，加200pl3mol/L乙酸鈉（pH5.2），用自動(dòng)微量移液器反復(fù)吹吸，以重懸核酸沉淀，將懸浮液移至另一個(gè)滅菌的微量離心管內(nèi)。b）用微量離心機(jī)于室溫以12000g離心10分鐘，RNA沉于管底，而絕大部分寡脫氧核糖核苷酸仍在上清中。c）棄上清液，用200plT（pH7.6）重溶沉淀。加入20pl3mol/L乙酸鈉（pH5.2）,分混勻，加入550pl用冰預(yù)冷的乙醇?；靹蛉芤海诒象E冷30分鐘。用微量離心機(jī)于4C以12000g離主10分鐘，以回收RNA小心吸出上清。d）棄上清液，用300plTE（pH7.6）重溶沉淀，力p1ml乙醇，一70C貯存?zhèn)溆??；厥誖NA時(shí)，只需取出1小份貯存液，加3mol乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L充分混勻，用微量離心機(jī)于4C以12000g離心5分鐘即可。如需去除氧釩核糖核苷復(fù)合物，用含0.1%羥喹啉的苯酚［用0.01mol/LTris.Cl（pH7.8）平衡］將RNA終溶液抽提數(shù)次即可。對(duì)大多數(shù)細(xì)胞株來(lái)說(shuō)，一個(gè)直徑90mm培養(yǎng)甲中培養(yǎng)的RNA攵率為100-200pg第二節(jié)病毒的PCR僉測(cè)技術(shù)PCF技術(shù)概論P(yáng)CF技術(shù)簡(jiǎn)史PCF技術(shù)的基本原理PCF反應(yīng)體系與反應(yīng)條件PCF反應(yīng)特點(diǎn)PCRT增產(chǎn)物的分析聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR）是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。過(guò)去幾天幾星期才能做到的事情，用 PCF幾小時(shí)便可完成。PCF技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。PCF技術(shù)簡(jiǎn)史PCR勺最早設(shè)想核酸研究已有100多年的歷史，本世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因”。PCF的實(shí)現(xiàn)1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA勺體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA勺體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。PCR勺改進(jìn)與完善Mullis最初使用的DNAK合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺點(diǎn)是：①Klenow酶不耐高溫，90°C會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應(yīng)在 37C下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCF技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，但由于 Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCF技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR其擴(kuò)增的DNA片段很均一,真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌（thermusaquaticus）中提取到一種耐熱DNA聚合酶。酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫，在 70C下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來(lái)的90%在93C下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的60%在95C下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的40%②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度（2.0Kb）。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區(qū)別，將此酶命名為TaqDNA多聚酶（TaqDNAPolymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。PCR技術(shù)的基本原理PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93C左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCRT增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNAS加熱變性成單鏈后，溫度降至55C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNAR合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。 (Plateau)。到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNAt增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴(kuò)增量可用Y=(1+X)n計(jì)算。丫代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，門代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。 反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下，平臺(tái)期的到來(lái)是不可避免的。PCRt增產(chǎn)物可分為長(zhǎng)產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5'端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長(zhǎng)產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3'端開始延伸，其5'端是固定的，3'端則沒有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時(shí)，由于新鏈模板的5'端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3'端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、 形成長(zhǎng)短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加， 而“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加， 幾乎可以忽略不計(jì)，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測(cè)用。PCRS應(yīng)體系與反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)的PCF反應(yīng)體系：10X擴(kuò)增緩沖液10ul4種dNTP昆合物各200umol/L引物模板DNATaqDNA引物模板DNATaqDNA聚合酶Mg2+加雙或三蒸水至各10100pmol0.12ug2.5u1.5mmol/L100ulPCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTR模板和Mg2+。引物：弓］物是PCF特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：①引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C3多易出現(xiàn)非特異條帶。ATG（最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的瞟吟或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1lumol或10100pmol,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2。5U（指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)），濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCRT增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。 dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝，-20C冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+吉合，使游離的Mg2濃度降低。模板（靶基因）核酸模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA屯化方法通常采用SDS和蛋白酶K來(lái)消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA吉合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PC皈應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCRT增。RNA莫板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNAMg24濃度Mg2+寸PCRT增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PC皈應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2?濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+ft度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。PCF反應(yīng)條件的選擇PCF反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCF原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在9095C變性，再迅速冷卻至4060C,引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075C,在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94E變性，65C左右退火與延伸（此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性）。①變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCF失敗的最主要原因。一般情況下，93C94rlmin足以使模板DNA變性，若低于93C則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCF產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCF失敗。②退火（復(fù)性）溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40C60C，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%勺引物，55r為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）+2（A+T）復(fù)性溫度=Tm值-（510E）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCF反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。③延伸溫度與時(shí)間：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：7080r150核苷酸借/酶分子；70r60核苷酸/S/酶分子;55r24核苷酸/S/酶分子；高于90r時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行。PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075r之間，常用溫度為72r，過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠的。34kb的靶序列需34min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCRT增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。PCR反應(yīng)特點(diǎn)特異性強(qiáng)：PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；②堿基配對(duì)原則；^TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；④靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。靈敏度高：PCF產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克（pg=10-12）量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克（ug=-6）水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR勺靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU空斑形成單位）；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。簡(jiǎn)便、快速：PCF反應(yīng)用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在24小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。對(duì)標(biāo)本的純度要求低：不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞， DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴(kuò)增檢測(cè)。PCF擴(kuò)增產(chǎn)物的分析PCR產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增，結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定，才能得出正確的結(jié)論。PCF產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對(duì)象和目的不同而采用不同的分析方法。凝膠電泳分析：PCF產(chǎn)物電泳，EB漠乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計(jì)的一致，特別是多重PCR應(yīng)用多對(duì)引物，其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)訐的大小，這是起碼條件。瓊脂糖凝膠電泳：通常應(yīng)用12%的瓊脂糖凝膠，供檢測(cè)用。聚丙烯酰胺凝膠電泳：610%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測(cè)分析。酶切分析：根據(jù)PCF產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。分子雜交：分子雜交是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測(cè)PCR產(chǎn)物堿基突變的有效方法。Southern印跡雜交：在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內(nèi)部寡核苷酸)標(biāo)記后做探針，與PCF產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測(cè)PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。斑點(diǎn)雜交：將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無(wú)著色斑點(diǎn)，主要用于PCF產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。核酸序列分析：是檢測(cè)PCF產(chǎn)物特異性的最可靠方法。第三節(jié)病毒核酸雜交檢測(cè)技術(shù)互補(bǔ)的核苷酸序列通過(guò)Walson-Crick堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA分子的過(guò)程稱為雜交。雜交過(guò)程是高度特異性的，可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測(cè)。雜交的雙方是所使用探針和要檢測(cè)的核酸。該檢測(cè)對(duì)象可以是克隆化的基因組DNA也可以是細(xì)胞總DNA或總RNA根據(jù)使用的方法被檢測(cè)的核酸可以是提純的，也可以在細(xì)胞內(nèi)雜交，即細(xì)胞原位雜交。探針必須經(jīng)過(guò)標(biāo)記，以便示蹤和檢測(cè)。使用最普遍的探針標(biāo)記物是同位素，但由于同位素的安全性，近年來(lái)發(fā)展了許多非同位素標(biāo)記探針的方法。核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性，因而該技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域中已廣泛地使用于克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測(cè)和疾病的診斷等方面。因而它不僅在分子生物學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛地應(yīng)用，而且在臨床診斷上的應(yīng)用也日趨增多。第一節(jié)核酸探針標(biāo)記的方法核酸探針根據(jù)核酸的性質(zhì)，可分為DNA和RNA探針;根據(jù)是否使用放射性標(biāo)記物的與否,可分為放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針；根據(jù)是否存在互補(bǔ)鏈，可分為單鏈和雙鏈探針；根據(jù)放射性標(biāo)記物摻入情況，可分為均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記探針。下面將介紹各種類型的探針及標(biāo)記方法。一、雙鏈DNA探針及其標(biāo)記方法分子生物研究中，最常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應(yīng)用于基因的鑒定、臨床診斷等方面。雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種：切口平移法和隨機(jī)引物合成法。切口平移法(nicktranslation)當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時(shí),E.coliDNA聚合酶I就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。同時(shí)該酶具有從5'f3'的核酸外切酶活性，能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時(shí)又在切口的3'端補(bǔ)上核苷酸，從而使切口沿著DNA鏈移動(dòng)，用放射性核苷酸代替原先無(wú)放射性的核苷酸，將放射性同位素?fù)饺氲胶铣尚骆溨?。最合適的切口平移片段一般為50-500個(gè)核苷酸。切口平移反應(yīng)受幾種因素的影響：(a)產(chǎn)物的比活性取決于[a-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b)DNA酶1的用量和E.coliDNA聚合酶的質(zhì)量會(huì)影響產(chǎn)物片段的大小。(c)DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會(huì)抑制酶的活性，故應(yīng)使用仔細(xì)純化后的DNA。材料：待標(biāo)記的DNA。設(shè)備：高速臺(tái)式離心機(jī)，恒溫水浴鍋等。試劑：10X切口平移緩沖液：0.5mol/LTrisCl(pH7.2);0.1mol/LMgSO4;10mmol/LDTT;100pg/mlBSA。⑵未標(biāo)記的dNTP原液:除同位素標(biāo)記的脫氧三磷酸核苷酸外其余3種分別溶解于50mmol/LTrisCl(pH7.5)溶液中，濃度為0.3mmol/L。⑶[a-32P]dCTP或[a-32P]dATP:400Ci/mmol,10pCi/pl。E.coliDNA聚合酶I(4單位/pl):溶于50pg/mlBSA,1mmol/LDTT,50%甘油，50mmol/LTrisCl(pH7.5)中。DNA酶1:1mg/ml。EDTA:200mmol/L(pH8.0)。⑺10mol/LNH4Ac。操作步驟：(1)按下列配比混合：未標(biāo)記的dNTP10yl、10X切口平移緩沖液5pI、待標(biāo)記的DNA1g、［a-32P］dCTP或dATP(70pCi)7pl、E.coliDNA聚合酶4單位、DANSI1pl,加水至終體積50pl⑵置于15C水浴60分鐘。⑶加入5plEDTA終止反應(yīng)。反應(yīng)液中加入醋酸銨，使終濃度為0.5mol/L,加入兩倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇沉淀回收DNA探針。［注意］1、3H,32P及35S標(biāo)記的dNTP都可使用于探針標(biāo)記，但通常使用［a-32P］-dNTP。2、DNA酶1的活性不同，所得到的探針比活性也不同， DNA酶1活性高，則所得探針比活性高，但長(zhǎng)度比較短。2.隨機(jī)引物合成法隨機(jī)引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結(jié)合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探針。合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比活性依賴于反應(yīng)中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，產(chǎn)物平均長(zhǎng)度為400-600個(gè)核苷酸。利用隨機(jī)引物進(jìn)行反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)是：(1)Klenow片段沒有5'-3'外切酶活性,反應(yīng)