植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生

關(guān)于植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生第1頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五體細(xì)胞胚（somaticembryo）又叫胚狀體，是指離體培養(yǎng)條件下沒有經(jīng)過受精過程而形成的胚胎類似物。胚的發(fā)育圖一、體細(xì)胞胚的概念第2頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五(A)伸長期合子；(B)合子經(jīng)過第一次分裂,產(chǎn)生1個頂細(xì)胞(綠色)和一個基細(xì)胞(粉紅色)；(C)四分體胚:頂細(xì)胞經(jīng)歷2次縱向分裂，產(chǎn)生含有4個細(xì)胞的胚體和2個細(xì)胞的胚柄；(D)16細(xì)胞球形胚:8細(xì)胞胚的所有細(xì)胞經(jīng)過1次平周分裂,產(chǎn)生包含8個細(xì)胞的表皮原和8個細(xì)胞的內(nèi)部組織；(E)早期心形胚；(F)心形胚:子葉和胚根原基已經(jīng)出現(xiàn)；(G)成熟胚胎。1:頂細(xì)胞;2:基細(xì)胞;3:胚根原細(xì)胞,形成未來的ROC和根冠中央?yún)^(qū);RM:根尖生長點;SM:莖尖生長點雙子葉植物的胚胎發(fā)育過程第3頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五花粉培養(yǎng)單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)組織器官培養(yǎng)體細(xì)胞胚花粉胚非合子胚非合子細(xì)胞合子胚無融合生殖胚**大量研究表明，大多數(shù)植物組織培養(yǎng)，單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)中都觀察到體細(xì)胞胚胎發(fā)生或花粉胚胎發(fā)生（pollenembryogenesis）**前者為二倍體的體細(xì)胞產(chǎn)生的胚狀結(jié)構(gòu)

**后者是由小孢子或其分裂產(chǎn)物等單倍體細(xì)胞產(chǎn)生的體細(xì)胞胚，通常稱花粉胚（pollenembryos），可發(fā)育成單倍體植株。體細(xì)胞胚的產(chǎn)生第4頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五**體細(xì)胞胚或花粉胚都是指在植物組織培養(yǎng)中起源于一個非合子細(xì)胞，經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形成的胚狀結(jié)構(gòu)，包括以下幾點含義：1、體細(xì)胞胚是組織培養(yǎng)的產(chǎn)物，區(qū)別于無融合生殖的胚，只限于在組織培養(yǎng)范圍使用；2、體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，區(qū)別于合子胚；3、體細(xì)胞胚的形成經(jīng)歷胚胎發(fā)育過程，區(qū)別于組織培養(yǎng)的器官發(fā)生中芽與根的分化。胚胎發(fā)生過程：原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚期和子葉形胚期第5頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生和誘導(dǎo)器官發(fā)生相比具有明顯的特點：1、具有兩極性2、存在生理隔離3、遺傳性相對穩(wěn)定4、重演受精卵形態(tài)發(fā)生的特性第6頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五二優(yōu)點數(shù)量多速度快結(jié)構(gòu)完整第7頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五三、體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方式**植物組織培養(yǎng)過程中植物體細(xì)胞胚胎途徑可歸納為兩類：直接途徑和間接途徑。**直接途徑是直接從原外植體不經(jīng)愈傷組織階段發(fā)育而成**間接方式是體胚從愈傷組織或懸浮細(xì)胞、有時也從已形成的體胚的一組細(xì)胞中發(fā)育而成，如香雪蘭（Freesiarefracta）花序外植體經(jīng)直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑形成再生植株。**外植體形態(tài)學(xué)極性決定體細(xì)胞胚胎發(fā)生，所有體細(xì)胞胚都出現(xiàn)在花序軸切段的原形態(tài)學(xué)下端。第8頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五1直接途徑

直接發(fā)生體胚的來源細(xì)胞可以是外植體表皮、亞表皮、幼胚、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞和原生質(zhì)體。一般認(rèn)為直接方式發(fā)生體胚是由原先就存在于外植體中的胚性細(xì)胞――預(yù)胚胎決定細(xì)胞（PEDCs）培養(yǎng)后直接進入胚胎發(fā)生而形成體胚，如柑桔屬的珠心組織（在體內(nèi)或離體情況）通過預(yù)胚胎決定細(xì)胞直接進行體胚發(fā)生的最好例子.

2間接途徑

間接體細(xì)胞胚胎發(fā)生中，外植體已分化的細(xì)胞先脫分化，并對其發(fā)育命運重決定而誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞――誘導(dǎo)胚胎決定細(xì)胞（IEDCs），進而形成體細(xì)胞胚。

第9頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五石龍芮下胚軸培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體過程第10頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五第11頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五1莖尖培養(yǎng)誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織MS培養(yǎng)基附加2.0mg/L2,4-D2胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)增殖MS培養(yǎng)基附加2.0mg/L2,4-D3由細(xì)胞集合體形成體細(xì)胞胚MS培養(yǎng)基附加2.0mg/L2,4-D4體細(xì)胞胚萌發(fā)并形成小植株MS培養(yǎng)基附加1.0mg/LABA

圖甘薯品種栗子香胚性愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚和再生小植株第12頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五胚性愈傷組織非胚性愈傷組織顏色淡黃白色表面光滑粗糙質(zhì)地堅硬但易碎松散，水漬狀胚性細(xì)胞的多少大量極少或無細(xì)胞形態(tài)小，圓球形管狀或不規(guī)則形細(xì)胞質(zhì)濃厚，染色深稀薄，染色淺內(nèi)含物多少細(xì)胞核及核仁核明顯，大，核仁多核小，核仁少，或無核胚性細(xì)胞團特征：成簇、成團，體積小，細(xì)胞質(zhì)致密第13頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五四.體細(xì)胞胚的結(jié)構(gòu)與發(fā)育特點體細(xì)胞胚多起源于一個胚性細(xì)胞,胚性細(xì)胞經(jīng)過首次分裂形成二細(xì)胞原胚,以后經(jīng)過細(xì)胞分裂形成多細(xì)胞原胚.在多數(shù)情況下,胚性細(xì)胞的第一次分裂為平周分裂,形成的2個子細(xì)胞,處于上部的頂細(xì)胞繼續(xù)進行細(xì)胞分裂形成多細(xì)胞原胚,而下部的基細(xì)胞成為胚柄類似物.第14頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五四、體細(xì)胞胚的起源**體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑有直接途徑和間接途徑，但無論哪一種發(fā)生途徑，絕大多數(shù)研究報道認(rèn)為體細(xì)胞胚胎起源于單細(xì)胞,從多種植物中都觀察到單個胚性細(xì)胞，有不均等分裂的二細(xì)胞原胚和均等分裂的二細(xì)胞原胚、多細(xì)胞原胚、球形胚直到成熟胚。也有研究認(rèn)為起源于多細(xì)胞。第15頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五**在同一塊愈傷組織或一個胚性細(xì)胞復(fù)合體上可以觀察到多個不同發(fā)育時期的體細(xì)胞胚，從單個原始細(xì)胞到多細(xì)胞的原胚、球形胚、魚雷胚直至具子葉的胚狀體，這是由體細(xì)胞胚發(fā)生和分裂的不同步所致。香蕉心形體細(xì)胞胚可可心形胚A和球形胚BAB1體細(xì)胞胚的單細(xì)胞起源第16頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五野胡蘿卜的胚狀體

A.心形期胚狀體B.成熟胚狀體

C.早心形期胚狀體D.兩個成熟胚狀體共一個胚柄

第17頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五a)胚性細(xì)胞第一次分裂；b-d)原胚第一次細(xì)胞分裂，鱷梨樹形胚柄細(xì)胞仍保持單個細(xì)胞；

e)胚柄細(xì)胞開始增殖；f-k)原胚和胚柄發(fā)育的不同時期；l)球形體細(xì)胞胚。(ep)=原胚；(s)=胚柄圖仙人掌科體細(xì)胞胚胎早期發(fā)育（由單細(xì)胞形成球形胚時期）第18頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五a胚性葉片愈傷組織；b球形細(xì)胞；c伸長細(xì)胞；d兩個細(xì)胞時期；e四個細(xì)胞時期；f原胚；g球形胚；h心形胚；i早期魚雷胚；j成熟魚雷胚；k不同時期的體細(xì)胞胚；l體細(xì)胞胚的萌發(fā)；m再生小植株。圖木豆幼苗葉片愈傷組織懸浮培養(yǎng)體細(xì)胞胚發(fā)育過程第19頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五**有的學(xué)者觀察到體細(xì)胞胚來源于多細(xì)胞組成的胚性細(xì)胞復(fù)合體，王亞馥等人也觀察到這種胚性細(xì)胞團，但用同位素脈沖標(biāo)記實驗即可證明這些細(xì)胞團也是由一個單細(xì)胞連續(xù)分裂而形成，經(jīng)進一步分化和分裂形成不同發(fā)育時期的體細(xì)胞胚，因而這些體細(xì)胞胚實質(zhì)也可能是起源于單細(xì)胞。當(dāng)然也不排除有些植物的體細(xì)胞胚的確是起源于多細(xì)胞，仍有待深入研究。**總之，體細(xì)胞胚胎的發(fā)生是一個非常復(fù)雜的生理過程，仍有許多問題尚需進一步研究。2體細(xì)胞胚的多細(xì)胞起源第20頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五大多數(shù)體細(xì)胞胚起源于單細(xì)胞,通過體細(xì)胞胚胎形成的再生植株,其遺傳特性相對穩(wěn)定.而器官發(fā)生途徑的再生植株來源復(fù)雜,形成的個體常為嵌合植株;從體細(xì)胞胚形成的過程可知,體細(xì)胞胚的發(fā)育過程與合子胚基本相同.但在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特性與合子胚有一定的區(qū)別.第21頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五1.合子胚在發(fā)育初期具有明顯的胚柄,而體細(xì)胞胚一般沒有真正的胚柄,只有類似胚柄的結(jié)構(gòu).特別是那些發(fā)育初期類似于動物胚胎發(fā)育途徑的體細(xì)胞胚,這一點更為明顯.2.合子胚的子葉相當(dāng)規(guī)范,可以作為分類的依據(jù),如單子葉植物只有一片子葉,雙子葉植物有兩片子葉.而體細(xì)胞胚的子葉不規(guī)范,有時具有兩片以上的子葉.

第22頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五3.體細(xì)胞胚的體積明顯小于合子胚.在一些貯藏物質(zhì)的含量上也存在較大差異.如體細(xì)胞的干物質(zhì)如蛋白質(zhì),多糖等顯著低于合子胚.

4.體細(xì)胞不能有明顯的脫水干燥過程,因此體細(xì)胞胚的含水量比合子胚要高得多

第23頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五5.體細(xì)胞胚還有一個明顯的特點就是沒有休眠.合子胚在胚胎發(fā)育完全進入子葉期后,經(jīng)過一系列物質(zhì)積累和脫水進入休眠,而體細(xì)胞胚則直接形成植株.

第24頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五五、影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素1、基因型與體細(xì)胞胚發(fā)生基因型是影響體細(xì)胞胚發(fā)生的重要因素，體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率和每個胚性外植體上體細(xì)胞胚的發(fā)生率因基因型而異。第25頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五（a）不同基因型體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率；（b）不同基因型每個胚性外植體上體細(xì)胞胚的數(shù)目圖6.7在相同培養(yǎng)基上FeijoasellowianaBerg不同基因型體細(xì)胞胚誘導(dǎo)（引自Miguel等，2001）第26頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五2、植物激素與體細(xì)胞胚發(fā)生**離體植物細(xì)胞在開始往往缺乏合成生長素和細(xì)胞分裂素的能力，但是在大多數(shù)情況下，這些細(xì)胞的分裂和分化以及形態(tài)建成過程中又必需生長素和細(xì)胞分裂素兩種激素的共同作用。**在培養(yǎng)介質(zhì)中添加不同種類或不同濃度的外源激素誘導(dǎo)形態(tài)發(fā)生已受到廣泛的重視。**但最關(guān)鍵的是組織內(nèi)部和體細(xì)胞胚發(fā)生部位的內(nèi)源激素代謝動態(tài)和平衡。第27頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五（1）內(nèi)源激素與體細(xì)胞胚發(fā)生早在胡蘿卜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體細(xì)胞胚發(fā)生中發(fā)現(xiàn)，2，4-D在誘導(dǎo)胚性細(xì)胞早期是必需的，而且2，4-D是通過影響IAA結(jié)合蛋白起作用，其實質(zhì)是促進IAA結(jié)合蛋白的形成，提高細(xì)胞對IAA的敏感性從而誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的形成。水稻細(xì)胞培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)，由于2,4-D促進細(xì)胞內(nèi)源IAA含量提高進而誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的形成，并認(rèn)為內(nèi)源IAA含量上升或維持在較高水平，是胚性細(xì)胞出現(xiàn)的一個共同標(biāo)志。一些研究表明，ABA對植物體細(xì)胞胚的發(fā)生與發(fā)育具有重要作用。外源ABA與內(nèi)源ABA對體細(xì)胞胚發(fā)生起到相互調(diào)節(jié)和促進的作用，而且通過補充提高外源ABA，可以明顯提高體細(xì)胞胚發(fā)生的頻率與質(zhì)量。荔枝體細(xì)胞胚胎發(fā)生早期的內(nèi)源激素ABA與IAA和ABA與CTK（細(xì)胞分裂素）的質(zhì)量比增大，將有利于荔枝體細(xì)胞球形胚的形成。第28頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五（2）外源激素與體細(xì)胞胚發(fā)生①2，4-D與體細(xì)胞胚發(fā)生2，4-D是誘導(dǎo)多種植物離體培養(yǎng)體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞的重要激素。單子葉植物和雙子葉植物誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生時，所要求的2,4-D的濃度不同，對單子葉植物而言，一般要求較高濃度的2,4-D，其濃度范圍為0.5-5mg/L，通常使用濃度為2mg/L；而對雙子葉植物而言，一般要求較低濃度的2,4-D，其濃度范圍為0.02-1mg/L，通常使用的濃度為0.1mg/L。在體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)階段，培養(yǎng)基中必需添加2,4-D，而在體細(xì)胞胚胎形成階段，要降低培養(yǎng)基中2,4-D的濃度或去除2,4-D，以保證體細(xì)胞胚的正常生長。在胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)中，加入2，4-D后誘導(dǎo)一些特異性多肽或蛋白質(zhì)形成，當(dāng)去除生長素后，這些多肽和蛋白質(zhì)也隨之消失。但在誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞后，及時除去培養(yǎng)基中的2，4-D，胚性細(xì)胞在進一步分化和發(fā)育的同時釋放糖蛋白GP65（65kDa）第29頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五表在MS固體培養(yǎng)基上不同濃度2,4-D對木豆幼苗葉片外植體誘導(dǎo)和原胚細(xì)胞形成的影響2,4-D(μM)Callusinduction(%)Proembryoniccell*(%)0.000.00.02.263.2d3.4d4.527.4c10.2c6.7838.6a37.4a9.0418.2b12.8b11.303.6c2.2c第30頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五表在具有不同濃度2,4-D的MS液體培養(yǎng)基上木豆不同時期體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率2,4-D(μM)收集細(xì)胞的體積(10thday)體細(xì)胞胚發(fā)育時期球形胚(%)心形胚(%)魚雷胚(%)0.0000001.122.8e2.4e1.8e1.2e2.263.2d7.6d2.4d1.6d3.384.6c20.2b8.2b5.2b4.525.2b36.2a20.4a16.4a5.645.6b18.6c6.6c3.6c6.786.2a7.4d1.6e1.2e第31頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五Originofembryoidsinembryo-derivedcallusculture.(a)Singlecells(arrow)andtwo-celledstage(doublearrows).x137.(b)Four-celledstage(arrowhead).x137.(c)Multicelledproembryocontainingeighttotencells.x137(d)Epidermizedlobularstage.x34.(e)Heartshapeembryoidthatremaininthecallus.X34.(f)Severalcompactembryoidsindifferentstagesofformation.x14.第32頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五A,C,E為離體培養(yǎng)6周后的體細(xì)胞胚；B,D,F為離體培養(yǎng)5個月后形成的體細(xì)胞胚A:品種GK7，在添加83.0mMcentrophenoxine培養(yǎng)基上;B:品種AT120，在添加124.4mMcentrophenoxine培養(yǎng)基上;C:品種59-4144，在添加12.4mM

dicamba培養(yǎng)基上;D:品種AT120，在添加83.0mMdicamba培養(yǎng)基上;E:品種VC1，在添加83.0mM

picloram培養(yǎng)基上;andF:品種VC1，在添加124.4mMpicloram培養(yǎng)基上.圖含不同種類和不同濃度生長素固體培養(yǎng)基上成熟花生胚軸體細(xì)胞胚誘導(dǎo)第33頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五②其它生長激素與體細(xì)胞胚發(fā)生除2,4-D外，ABA對植物體細(xì)胞胚的發(fā)生也起到重要的調(diào)控作用。研究表明，ABA具有促進藶蒿體細(xì)胞胚結(jié)構(gòu)正常化的顯著效應(yīng)。在濃度適宜時，ABA能抑制多種異常體細(xì)胞胚的發(fā)生，而且ABA加入培養(yǎng)基的時間愈早其效應(yīng)也越明顯。較低濃度的ABA對保持秈稻愈傷組織的胚性結(jié)構(gòu)具有重要意義，可明顯提高這種胚性愈傷組織分化出苗率。在拐芹中ABA與NAA共同作用可誘導(dǎo)一些游離氨基酸含量的變化和特異蛋白的形成。ABA和PEG對胡蘿卜(DaucuscarotaL.)體細(xì)胞胚發(fā)生具有調(diào)控作用大量的研究表明，ABA對某些植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生特異性基因的表達(dá)起調(diào)控作用，激活相關(guān)基因的表達(dá)，合成貯藏蛋白、晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白和胚胎發(fā)生的特異性蛋白。第34頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五3多胺（腐胺、尸胺、亞精胺、高亞精胺、精胺等）和乙烯與體細(xì)胞胚發(fā)生**外源多胺對體胚發(fā)生的作用除了取決于植物種類及其內(nèi)源多胺的狀況之外，還關(guān)系到它們?nèi)绾伪晃?、運輸及降解等問題。多胺與體細(xì)胞胚發(fā)生的關(guān)系在胡蘿卜的研究中較多。第35頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五舉例說明：**已發(fā)現(xiàn)胡蘿卜的胚性細(xì)胞中腐胺、精胺含量比非胚性的高，在胡蘿卜體細(xì)胞胚發(fā)生的前胚時期多胺含量一般較低，從球形胚、心形胚到魚雷胚時期，精胺和亞精胺逐漸升高，心形胚時期以腐胺為主，魚雷胚時期則富含亞精胺。**在胡蘿卜愈傷組織的體細(xì)胞胚發(fā)生中發(fā)現(xiàn)乙烯抑制體細(xì)胞胚的發(fā)生，而乙烯形成酶抑制劑Ni2+、Co2+可以促進其體細(xì)胞胚發(fā)生。**有研究表明，只在胚細(xì)胞分化早期才與多胺生物合成關(guān)系較密切。第36頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五4糖類和金屬離子與體細(xì)胞胚發(fā)生①

糖類**糖類對誘導(dǎo)植物體細(xì)胞胚發(fā)生也是不可缺少的重要成分。**研究表明，小麥的愈傷組織一旦分化為胚性細(xì)胞后就有淀粉粒的積累，在胚性細(xì)胞分化與發(fā)育的整個過程中，淀粉的兩次合成高峰均在發(fā)育的重要轉(zhuǎn)折期，為體細(xì)胞胚的進一步發(fā)育和分化提供必要物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。淀粉的積累與胚性細(xì)胞分化能力和體細(xì)胞胚發(fā)育時期的轉(zhuǎn)折密切有關(guān)。**在茴香的胚性細(xì)胞中也富含淀粉粒，在體細(xì)胞胚發(fā)育中同樣出現(xiàn)兩次峰值，同時認(rèn)為淀粉出現(xiàn)的峰值與核酸和蛋白質(zhì)合成密切相關(guān)，因此，表明淀粉為蛋白質(zhì)和核酸的合成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。第37頁，共43頁，2022年，5月20日，3點44分，星期五碳水化合物濃度（mM）胚胎發(fā)育時期球形胚（％）心形胚（％）魚雷胚（％）

葡萄糖Glucose55.492.4f1.2h1.2g110.996.8f2.6h2.4f166.4810.2e5.0f4.2e221.9813.6c7.2d6.4d

果糖Fructose55.496.2f2.8g2.4f110.9912.4c5.2f4.6c166.486.4f5.0f4.2e221.982.4h1.2h1.2g

蔗糖Sucrose29.2112.4c6.8c6.2d58.4320.2b16.2b14.6b87.6436.2a20.4a16.4a116.86