原核基因表達調(diào)控(2)-08課件

1、第六章 基因的表達與調(diào)控(上) 原核基因表達調(diào)控模式石曉衛(wèi)細胞工程教研室E-mail:第四節(jié) 色氨酸操縱子（trp operon）內(nèi)容提要：色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)色氨酸操縱子的阻遏系統(tǒng)色氨酸操縱子的弱化機制 調(diào)控基因 結(jié)構(gòu)基因 催化分枝酸轉(zhuǎn)變?yōu)樯彼岬拿竧rpRtrp一、色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)trpR, 阻遏蛋白P，-40 +18 O, -21 +1 L, +1 +162結(jié)構(gòu)基因t, A下游36bp, t, t下游250bp，基因組成磷二、trp 操縱子的阻遏系統(tǒng)低Trp時：阻遏物不結(jié)合操縱基因；高Trp時：阻遏物+Trp 結(jié)合操縱基因1、Trp R 四聚體2、阻遏蛋白的結(jié)合位點 trpO -21 +

2、1，反向重復(fù)序列trpP -40 +18活性阻遏物與trpO 的結(jié)合與RNA pol與啟動子的結(jié)合發(fā)生競爭。操縱子3、阻遏系統(tǒng)主管轉(zhuǎn)錄是否啟動 粗調(diào)開關(guān)三、trp 操縱子的弱化機制衰減子（attenuator）/弱化子前導(dǎo)序列（leader sequence）1.弱化子： DNA中可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過早終止的一段核甘酸序列（123-150bp區(qū)）。 研究引起終止的mRNA堿基序列，發(fā)現(xiàn)該區(qū)mRNA通過自我配對可以形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，有典型的終止子特點。POE4321LDNARNAATGTGA2 trp codons14322.前導(dǎo)肽3.前導(dǎo)序列：在trp mRNA5端trpE基因的起始密碼前一個長162b

3、p的mRNA片段。4、弱化機制 研究發(fā)現(xiàn)，在高濃度Trp和低濃度Trp時，Trp操縱子的表達水平相差600倍，然而阻遏作用僅使轉(zhuǎn)錄降低70倍。另外使阻遏物失活突變不能完全消除Trp對 Trp操縱子表達的影響。說明Trp操縱子的這種調(diào)控與阻遏物的控制無關(guān)。這就是弱化作用。 阻遏系統(tǒng)是一個粗調(diào)開關(guān)，主管轉(zhuǎn)錄是否啟動；Trp操縱子對應(yīng)于Trp的生物合成還有另一個系統(tǒng)進行細微調(diào)控，并決定已經(jīng)啟動的轉(zhuǎn)錄是否進行下去。在這個系統(tǒng)中酶的濃度根據(jù)氨基酸濃度的變化而受到調(diào)節(jié)。這個細微調(diào)控是通過轉(zhuǎn)錄達到第一個結(jié)構(gòu)基因之前的過早終止來實現(xiàn)的，細胞中色氨酸的濃度是實現(xiàn)過早終止的根本原因。 UUUU34UUUU 334

4、核糖體 前導(dǎo)肽 前導(dǎo)mRNA1.當(dāng)色氨酸濃度高時 轉(zhuǎn)錄衰減機制 125 trp 密碼子 衰減子結(jié)構(gòu)就是終止子可使轉(zhuǎn)錄前導(dǎo)DNA UUUU 3 RNA聚合酶 終止為什么需要阻遏體系？ 當(dāng)大量Trp存在時，阻遏系統(tǒng)起作用，阻遏物與之結(jié)合，阻止非必需的先導(dǎo)mRNA合成，使這個合成系統(tǒng)更加經(jīng)濟。trp操縱子具有雙重調(diào)節(jié)體系？阻遏作用與弱化作用的協(xié)調(diào)為什么需要弱化系統(tǒng)？ 當(dāng)trp濃度低時，阻遏物從有活性變?yōu)闊o活性，速度極慢，不能很快引發(fā)trp合成。因此需要一個能快速作出反應(yīng)的系統(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)腡rp水平。 弱化子能較快地通過抗終子的方法來增加Trp基因表達，迅速提高內(nèi)源色氨酸的濃度。 細菌通過弱

5、化作用彌補阻遏作用的不足，因為阻遏作用只能使轉(zhuǎn)錄不起始，對于已經(jīng)起始的轉(zhuǎn)錄，只能通過弱化作用使之中途停下來。阻遏作用的信號是細胞內(nèi)色氨酸的多少；弱化作用的信號則是細胞內(nèi)載有色氨酸的tRNA的多少。它通過前導(dǎo)肽的翻譯來控制轉(zhuǎn)錄的進行，在細菌細胞內(nèi)這兩種作用相輔相成，體現(xiàn)著生物體內(nèi)周密的調(diào)控作用。細菌演化出弱化系統(tǒng)的生物學(xué)意義 通過tRNA荷載與否進行調(diào)控，更為靈敏；氨基酸的主要用途是合成蛋白質(zhì)，因而以tRNA荷載為標(biāo)準(zhǔn)進行調(diào)控更為恰當(dāng)；兩個調(diào)控系統(tǒng)，避免浪費提高效率： 阻遏系統(tǒng) 高水平trp時，不轉(zhuǎn)錄 低水平trp時，轉(zhuǎn)錄 弱化系統(tǒng) 細調(diào) 原核生物細致的精細調(diào)控機制增強原核生物對環(huán)境的適應(yīng)性 經(jīng)

6、濟Contents基因表達調(diào)控的基本概念原核基因調(diào)控機制乳糖操縱子色氨酸操縱子其他操縱子轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控第五節(jié) 其他操縱子一、半乳糖操縱子(galactose operon)異構(gòu)酶(galE)乳糖-磷酸尿嘧啶核苷轉(zhuǎn)移酶(galT)半乳糖激酶(galk)gal操縱子的特點： 它有兩個啟動子，其mRNA可從兩個不同的起始點開始轉(zhuǎn)錄； 它有兩個O區(qū)，一個在P區(qū)上游，另一個在結(jié)構(gòu)基因galE內(nèi)部。因為半乳糖的利用效率比葡萄糖低，人們猜想葡萄糖存在時半乳糖操縱子不被誘導(dǎo)，但實際上有葡萄糖存在時，gal操縱子仍可被誘導(dǎo)?，F(xiàn)已分離到一些突變株，其中一類突變株能在不含葡萄糖的培養(yǎng)基中高水平合成半乳糖代謝酶類

7、（gal結(jié)構(gòu)基因高效表達）；而另一類突變株中g(shù)al基因的表達完全依賴于葡萄糖，培養(yǎng)基中如無葡萄糖存在，這些細菌的gal基因不表達，不合成半乳糖代謝酶類。分析gal操縱子P-O區(qū)的DNA序列發(fā)現(xiàn)，該操縱子確實存在兩個相距僅5bp的啟動子，可以分別起始mRNA的合成。每個啟動子擁有各自的RNA聚合酶結(jié)合位點S1和S2。從S1起始的轉(zhuǎn)錄只有在培養(yǎng)基中無葡萄糖時，才能順利進行，RNA聚合酶與S1的結(jié)合需要半乳糖、CAP和較高濃度的cAMP。從S2起始的轉(zhuǎn)錄則完全依賴于葡萄糖，高水平的cAMP-CAP能抑制由這個啟動子起始的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)有cAMP-CAP時，轉(zhuǎn)錄從S1開始，當(dāng)無cAMP-CAP時，轉(zhuǎn)錄從S2

8、開始。S1S2S1起始的轉(zhuǎn)錄不依賴于葡萄糖S2起始的轉(zhuǎn)錄則完全依賴于葡萄糖為什么gal操縱子需要兩個轉(zhuǎn)錄起始位點？半乳糖不僅可以作為唯一碳源供細胞生長，而且與之相關(guān)的物質(zhì)-尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大腸桿菌細胞壁合成的前體。在沒有外源半乳糖的情況下，UDP-gal是通過半乳糖差向異構(gòu)酶（來源？）的作用由UDP-葡萄糖合成的，該酶是galE基因的產(chǎn)物。生長過程中的所有時間里細胞必須能夠合成差向異構(gòu)酶?，F(xiàn)在設(shè)想只有S1一個啟動子，那么由于這個啟動子的活性依賴于cAMP-CRP，當(dāng)培養(yǎng)基中有葡萄糖存在時就不能合成異構(gòu)酶。S1S2半乳糖存在、葡萄糖不存在時， S1啟動S1S2 假如唯一的啟動子

9、是S2，那么，即使在葡萄糖存在的情況下，半乳糖也將使操縱子處于充分誘導(dǎo)狀態(tài)，這無疑是一種浪費。無論從必要性或經(jīng)濟性考慮，都需要一個不依賴于cAMP-CAP的啟動子（S2）進行本底水平的組成型合成，以及一個依賴于cAMP-CAP的啟動子（S1）對高水平合成進行調(diào)節(jié)。即只有在S2活性完全被cAMP-CAP抑制時，調(diào)控作用才是有效的。半乳糖、葡萄糖存在時， S2啟動，浪費半乳糖不存在、葡萄糖存在時， S2啟動，組成型合成二、阿拉伯糖操縱子（arabinose operon)araB基因、araA基因和araD, 形成一個基因簇，簡寫為araBAD。 三個基因的表達受到ara操縱子中araC基因產(chǎn)物A

10、raC蛋白的調(diào)控。ara操縱子的調(diào)控特點：第一，araC表達受到AraC的自身調(diào)控。第二，AraC既是ara操縱子的正調(diào)節(jié)蛋白，又是其負調(diào)節(jié)蛋白。這種雙重功能是通過AraC蛋白的兩種異構(gòu)體來實現(xiàn)的（Pi和Pr)。第三，AraC與CAP結(jié)合可充分誘導(dǎo)ara操縱子。 與araBAD相鄰的是一個復(fù)合的啟動子區(qū)域和一個調(diào)節(jié)基因araC，這個AraC蛋白同時顯示正、負調(diào)節(jié)因子的功能。AraBAD和araC基因的轉(zhuǎn)錄是分別在兩條鏈上以相反的方向進行的。在標(biāo)準(zhǔn)的遺傳學(xué)圖譜上，araBAD基因簇從啟動子PBAD開始向左進行轉(zhuǎn)錄，而araC基因則是從Pc向右轉(zhuǎn)錄。高葡萄糖，低阿拉伯糖有阿拉伯糖，無葡萄糖無ara

11、C蛋白時AraC蛋白作為PBAD活性正、負調(diào)節(jié)因子的雙重功能是通過該蛋白的兩種異構(gòu)體來實現(xiàn)的。Pr是起阻遏作用的形式，可以與現(xiàn)在尚未鑒定的類操縱區(qū)位點相結(jié)合，而Pi是起誘導(dǎo)作用的形式，它通過與PBAD啟動子結(jié)合進行調(diào)節(jié)。 在沒有阿拉伯糖時，Pr形式占優(yōu)勢；一旦有阿拉伯糖存在，它就能夠與AraC蛋白結(jié)合，使平衡趨向于Pi形式。這樣，阿拉伯糖的誘導(dǎo)作用就可以解釋為阿拉伯糖與Pr的結(jié)合，使Pr離開它的結(jié)合位點，然后，產(chǎn)生大量的Pi，并與啟動子結(jié)合。培養(yǎng)基中含有葡萄糖，沒有阿拉伯糖：cAMP-CAP沒有與操縱區(qū)位點相結(jié)合，AraC蛋白處于Pr形式并與A位點結(jié)合，RNA聚合酶很少再與Pc結(jié)合，araC基

12、因雖然仍有轉(zhuǎn)錄，但受到抑制，只有少量 AraC蛋白形成，整個系統(tǒng)幾乎處于靜止?fàn)顟B(tài)。 沒有葡萄糖，也沒有阿拉伯糖：因為沒有誘導(dǎo)物，盡管有cAMP-CAP與操縱區(qū)位點相結(jié)合，AraC蛋白仍以Pr形式為主，無法與操縱區(qū)B位點相結(jié)合，無araBAD mRNA轉(zhuǎn)錄。無葡萄糖，有阿拉伯糖時：大量araC基因產(chǎn)物以Pi形式存在，并分別與操縱區(qū)B、A位點相結(jié)合，在cAMP-CAP的共同作用下，araC和araBAD基因大量表達，操縱子充分激活。A位點B位點araC的表達受到自身產(chǎn)物AraC的自動調(diào)控。當(dāng)沒有阿拉伯糖時，AraC起著一個轉(zhuǎn)錄阻遏物的作用。細胞中AraC蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)水平的測量表明，阻遏araC轉(zhuǎn)錄大

13、約需要40個AraC。因此當(dāng)AraC蛋白水平低時（就是說在細胞剛分裂之后），araC將表達直至存在足夠的AraC去阻遏它的轉(zhuǎn)錄。阿拉伯糖作為E.Coli的碳源，可以誘導(dǎo)ara操縱子的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)細胞中葡萄糖水平高（導(dǎo)致cAMP處于低濃度）和阿拉伯糖水平低時，AraC阻遏araB，araA，araD的轉(zhuǎn)錄。然而當(dāng)阿拉伯糖水平高，而葡萄糖水平低（cAMP高）時，CAP-cAMP復(fù)合物能夠與ara操縱子中的CAP結(jié)合部位結(jié)合，使DNA環(huán)打開。 阿拉伯糖的作用象AraC的一個調(diào)控器，可將AraC由一個阻遏物轉(zhuǎn)換為一個激活劑。阿拉伯糖與AraC結(jié)合似乎改變了AraC同源二聚體化特性和促進了AraC-CAP復(fù)

14、合物的形成。在這樣的條件下，AraC阿拉伯糖的作用象是一個轉(zhuǎn)錄激活劑，這正是CAP-cAMP誘導(dǎo)araB，araA，araD轉(zhuǎn)錄所需要的。當(dāng)由于araBAD編碼的蛋白質(zhì)的代謝使得阿拉伯糖水平下降時，AraC又轉(zhuǎn)換成一個阻遏物，同時araBAD轉(zhuǎn)錄減少，此時盡管CAP-cAMP復(fù)合物仍然存在于細胞中。有趣的是，當(dāng)葡萄糖和阿拉伯糖都很豐富時，ara操縱子被阻遏，但阻遏的道理現(xiàn)在還不完全清楚，但這個結(jié)果表明araBAD誘導(dǎo)與AraC-阿拉伯糖和CAP-cAMP復(fù)合物都有關(guān)。三、阻遏蛋白LexA的降解與細菌中的SOS應(yīng)答 SOS反應(yīng)的機理：由 RecA 蛋白和 LexA 阻遏物的相互作用引起的。Lex

15、A阻遏物：是SOS DNA修復(fù)系統(tǒng)所有基因的阻遏物RecA蛋白：是SOS反應(yīng)的最初的發(fā)動因子。在單鏈DNA和ATP存在時，RecA蛋白被激活，表現(xiàn)出水解酶活性，分解LexA阻遏物。當(dāng)RecA水解LexA阻遏物后，導(dǎo)致SOS體系（包括recA基因）高效表達，DNA得到修復(fù)。四、二組分調(diào)控系統(tǒng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)傳感激酶P環(huán)境信號P應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白P結(jié)構(gòu)基因 trpROPRNA聚合酶既可以誘導(dǎo)又可以阻礙Contents基因表達調(diào)控的基本概念原核基因調(diào)控機制乳糖操縱子色氨酸操縱子其他操縱子轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控一、翻譯起始的調(diào)控 RBS（核糖體結(jié)合位點）：mRNA鏈上起始密碼子AUG上游的一段非翻譯區(qū)。在RBS中有S

16、D序列，長度一般為5bp，核糖體16S rRNA與SD序列互補配對，促使核糖體結(jié)合到mRNA上，有利于翻譯的起始。RBS的結(jié)合強度取決于SD序列的結(jié)構(gòu)及其與起始密碼子AUG之間的距離。 SD- 4-10（9）-AUG第六節(jié) 轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控 mRNA的二級結(jié)構(gòu)也是翻譯起始調(diào)控的重要因素：核糖體30S 亞基必須與mRNA結(jié)合，要求mRNA 5端有一定的空間結(jié)構(gòu)。SD序列的微小變化，往往會導(dǎo)致表達效率上百倍甚至上千倍的差異。這是因為核苷酸的變化影響了核糖體30S 亞基與mRNA結(jié)合，從而造成了蛋白質(zhì)合成效率上的差異。二、稀有密碼子對翻譯的影響 dnaG、rpoD和rpsU屬于大腸桿菌基因組上的同

17、一個操縱子； 50個拷貝的dnaG蛋白、2800個拷貝的rpoD和40000個拷貝的rpsU。幾種蛋白質(zhì)中異亮氨酸密碼子使用頻率比較蛋白質(zhì)AUU/%AUC%AUA%結(jié)構(gòu)蛋白37621亞基26740DnaG蛋白363232 細胞內(nèi)對應(yīng)于稀有密碼子的tRNA較少，高頻率使用這些密碼子的基因翻譯過程容易受阻，影響了蛋白質(zhì)合成的總量。TrpB 谷氨酸- 異亮氨酸-終止 GAA - AUC - UGA - UGG AA AUG GAA 甲硫氨酸 谷氨酸t(yī)rpAtrpE蘇氨酸苯丙氨酸終止 ACU - UUC - UGA - UGG - CU AUG GCU 甲硫氨酸 - 丙氨酸- trpD 翻譯終止時核糖

18、體立即處在起始環(huán)境中，這種重疊的密碼子保證了同一核糖體對兩個連續(xù)基因進行翻譯的機制。這樣可以保證2個基因的產(chǎn)物數(shù)量上相等。三、重疊基因?qū)Ψg的影響四、poly(A)對翻譯的影響 研究發(fā)現(xiàn)：細胞中蛋白質(zhì)合成旺盛時，mRNA鏈上核糖體數(shù)量多，mRNA鏈上的poly(A)較長；當(dāng)某些mRNA不再翻譯時，核糖體就被釋放出來，poly(A)也相應(yīng)縮短。 一個操縱子（元）通常含有 (A) 數(shù)個啟動序列和一個編碼基因 (B) 一個啟動序列和數(shù)個編碼基因 (C) 一個啟動序列和一個編碼基因 (D) 兩個啟動序列和數(shù)個編碼基因 (E) 數(shù)個啟動序列和數(shù)個編碼基因 B 乳糖操縱子（元）的直接誘導(dǎo)劑是 (A) 葡萄

19、糖 (B) 乳糖 (C) 一半乳糖苷酶 (D) 透酶(E)異構(gòu)乳糖 E Lac阻遏蛋白結(jié)合乳糖操縱子（元）的 (A) CAP結(jié)合位點 (B) O序列 (C) P序列 (D) Z基因 (E) I基因B cAMP與CAP結(jié)合、CAP介導(dǎo)正性調(diào)節(jié)發(fā)生在 (A) 葡萄糖及cAMP濃度極高時 (B) 沒有葡萄糖及cAMP較低時 (C) 沒有葡萄糖及cAMP較高時 (D) 有葡萄糖及cAMP較低時 (E) 有葡萄糖及CAMP較高時 C Lac阻遏蛋白由 (A) Z基因編碼 (B) Y基因編碼 (C) A基因編碼 (D) I基因編碼 (E) 以上都不是 D 色氨酸操縱子（元）調(diào)節(jié)過程涉及 (A) 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié) (B