免疫熒光技術(shù)概要課件

1、免疫熒光技術(shù)概要免疫熒光技術(shù)概要免疫熒光技術(shù)概要 Coons和Coworkers（1941）通過熒光素標(biāo)記抗體，并借助熒光顯微鏡觀察熒光的發(fā)光物質(zhì)，而建立了該項技術(shù)，人們在Coons等的基礎(chǔ)上發(fā)展完善了這一技術(shù)。尤其是近年來，與激光技術(shù)、電子計算機、掃描電鏡和雙光子顯微鏡等技術(shù)結(jié)合發(fā)展為定量免疫熒光技術(shù)；熒光激活細(xì)胞分類器（FACS）的應(yīng)用，激光共聚焦顯微鏡的問世，使這門技術(shù)發(fā)展到更高的階段，開創(chuàng)了免疫熒光技術(shù)的新領(lǐng)域。 2020/11/32 Coons和Coworkers（1941）通過熒光素標(biāo)記抗體，并借助熒光顯微鏡觀察熒光的發(fā)光物質(zhì)，而建立了該項技術(shù)，人們在Coons等的基礎(chǔ)上發(fā)展完善了

2、這一技術(shù)。尤其是近年來，與激光技術(shù)、電子計算機、掃描電鏡和雙光子顯微鏡等技術(shù)結(jié)合發(fā)展為定量免疫熒光技術(shù)；熒光激活細(xì)胞分類器（FACS）的應(yīng)用，激光共聚焦顯微鏡的問世，使這門技術(shù)發(fā)展到更高的階段，開創(chuàng)了免疫熒光技術(shù)的新領(lǐng)域。 2020/11/32第一節(jié) 免疫熒光技術(shù)的原理 2020/11/33 一、免疫熒光技術(shù)的基本原理 免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（

3、黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。 2020/11/34 用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分直接法、間接法和補體法以及與親和化學(xué)物質(zhì)標(biāo)記熒光素的方法，例如：SPA熒光素標(biāo)記物，生物素與卵白素、植物血凝素?zé)晒馑貥?biāo)記物等。 2020/11/35二、熒光產(chǎn)生的原理 分子都含有電子，電子在不斷地運動著

4、。根據(jù)量子理論，運動著的電子可以處于一系列不連續(xù)的能量狀態(tài)（即能級）中，電子遵守一定的規(guī)則，可以從一個能級向另一個能級躍遷，并伴隨著與能級差相對應(yīng)的特定能量的吸收或釋放。一般情況下，電子總是處于能量最低的能級（即基態(tài)）。 2020/11/36 在一定的條件下，電子可吸收能量（如光能，熱能，電能，機械能等）躍遷到較高能量級（即激發(fā)態(tài)），這個過程叫激發(fā)。處于激發(fā)態(tài)的電子是不穩(wěn)定的，它總是要躍遷回到基態(tài)，并將多余的能量釋放出來。躍遷方式可能是輻射躍遷，也可能是非輻射躍遷。以非輻射躍遷時，能量大多轉(zhuǎn)化為熱能，而以輻射方式躍遷時，能量轉(zhuǎn)化成相應(yīng)波長的光，這個過程叫發(fā)射。 2020/11/37 躍遷到激發(fā)

5、態(tài)的電子，大多處于單重激發(fā)態(tài)。如果電子直接從單重激發(fā)態(tài)以輻射方式躍遷到基態(tài)，由于單重激發(fā)態(tài)很不穩(wěn)定，半衰期很短，發(fā)射持續(xù)的時間也很短，這種發(fā)射光叫熒光，其壽命較短。 1838年Brewster首先描述了熒光現(xiàn)象，但熒光一詞，是由 Stokesl852年提出的。 2020/11/38第二節(jié) 熒 光 素 2020/11/39一、熒光色素 能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為熒光色素，熒光色素必須具備吸收激發(fā)光的光能并發(fā)射熒光，具有吸收一定頻率光能的生色團和能產(chǎn)生一定光亮子的熒光團。吸收的光能轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒獾陌俜謹(jǐn)?shù)稱為“熒光效率”。熒光效率與發(fā)射熒光量子的數(shù)值成正比。熒光效率（%）= （發(fā)射熒光的光量子

6、數(shù)） 100 （吸收光的光量子數(shù)）2020/11/310 熒光強度（即發(fā)射熒光的光量子數(shù)）和激發(fā)光（吸收的光量子數(shù)）的強度有關(guān)，激發(fā)光越強，熒光也越強。熒光素可以發(fā)射紅、橙紅、黃、綠及藍(lán)色等熒光。光的強弱也與溶解熒光素的pH值、濃度、染色時間和溫度等條件有關(guān)。 2020/11/311 熒光素的種類很多，但用于標(biāo)記抗體的熒光素，不同于一般熒光色素，它必須具備以下條件： 應(yīng)具有與蛋白質(zhì)分子形成共價鍵的化學(xué)基因，結(jié)合后不易理解，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物容易排除。 熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合熒光效率下降不多。 2020/11/312 結(jié)合抗體蛋白后對抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化性質(zhì)無影響，用于活體內(nèi)標(biāo)記，結(jié)

7、合應(yīng)無毒性，附加抗原性小。 與蛋白質(zhì)結(jié)合的方法簡便而快速，結(jié)合物在一般條件下穩(wěn)定。 熒光素容易溶解，溶解后不會和其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色對比鮮明，能清晰判斷結(jié)果。 2020/11/313二、可用于標(biāo)記抗體的熒光素 用于標(biāo)記抗體和蛋白質(zhì)的熒光色素到目前為止有以下幾種。2020/11/314 1. 異硫氰酸熒光黃（fluorescien isothiocyanate，F(xiàn)ITC） 純品為黃色粉末，有兩種異構(gòu)體，易溶于水和乙醇等溶劑，在溶解狀態(tài)下呈黃綠色熒光。性質(zhì)穩(wěn)定，低溫干燥下可保存多年，室溫下也可保存兩年以上。FITC分子質(zhì)量為390u，最大吸收光譜為490495n

8、m，最大發(fā)射光譜為520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。其中異構(gòu)體I型熒光效率更高，與蛋白質(zhì)結(jié)合更穩(wěn)定。其結(jié)構(gòu)式，在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵，結(jié)合成為標(biāo)記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。1個IgG分子上最多能標(biāo)記1520個FITC分子。 2020/11/315 2. 四甲基異硫氰酸羅達(dá)明(tetramethyl rhodamine isothcyanate，TRITC) 是一種紫紅色粉末，較穩(wěn)定，是羅達(dá)明(Rhodamine)的衍生物，易溶于水。最大吸收光譜為 550nm，最大發(fā)射光譜為620nm，呈橙紅色熒光，與FITC發(fā)射的黃

9、綠色熒光對比鮮明。經(jīng)常用于雙標(biāo)記染色，使用較多。 2020/11/316 3. 四乙基羅達(dá)明（tetraethyl rhodamineB200，RB200) RB200是褐紅色粉末狀，溶于乙醇和丙酮，不溶于水。最大吸收光譜為570nm，最大發(fā)射光譜為596600nm，呈橙紅色熒光。因為RB200比較低廉，廣泛用于染色和雙標(biāo)記示蹤或染色。RB200不能直接和蛋白質(zhì)結(jié)合，要先經(jīng)五氯化磷（PCI5）作用下轉(zhuǎn)變成黃酰氯（S02C1），在堿性條件下易與賴氨酸s氨基反應(yīng)而結(jié)合在蛋白分子上。其分子質(zhì)量為580u。 2020/11/317 4.其他熒光素 如4-乙酰胺-4-異硫氰酸-2-硫酸（SITS）呈藍(lán)色

10、熒光；得克薩斯紅（Texas red）、藻紅素R（phycoerythrin-R）、花青（cyanine，Cy2，Cy3，Cy5）等。 2020/11/318第三節(jié) 熒光素標(biāo)記抗體的方法 2020/11/319一、標(biāo)記方法： 采用FITC標(biāo)記抗體的方法 常用Marsshall（1958）法標(biāo)記熒光抗體，也可以根據(jù)條件用Chadwick等（1960）標(biāo)記法或Clark等（1963）的透析標(biāo)記法。 2020/11/320 1、Marsshall法： （1）材料：抗體球蛋白溶液、0.5molLpH9.0的碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1硫柳汞水溶液、三角燒瓶（2550m1）、冰及冰槽（

11、或1000ml燒杯）、電磁攪拌器、滅菌吸管、透析袋、玻棒、棉線及燒杯（500m1）、pH7.2或8.0的0.01molLPBS等。 2020/11/321 熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克蛋白加0.01mg熒光色素，用天平準(zhǔn)確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。 結(jié)合（或標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶或攪拌玻棒上（大約在510min內(nèi)加完），加完后，繼續(xù)攪拌12h左右。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液與4左右。結(jié)合完畢后，將標(biāo)記的球蛋白溶液離心（2 500rmin）20min，除去其中少量的沉淀物。 2020/11/322 透析：裝入透析袋中再置于

12、燒杯中用 pH8.0的緩沖鹽水透析（04）過夜。 過柱：取透析過夜的標(biāo)記物，通過葡聚糖凝膠G-25（SephadexG-25）或G-50柱，分離游離熒光素，收集標(biāo)記的熒光抗體進行鑒定。洗脫液：0.01molL磷酸鹽緩沖液（pH7.2）；過濾量：12ml標(biāo)記全球蛋白液（過濾前未透析）；收集量：20ml（解析1.7倍）。 2020/11/323 分別以1mgFITC溶于2份lml 0.5molL。碳酸鹽緩沖液（分別為pH9.5和 pH9.0），于2下攪拌將其各加入100mg家兔IgG生理鹽水溶液中，攪勻后立即將每份分為兩半。一半保留于2下，另一半置25下。間隔一定時間后各取出0.5ml通過Seph

13、adex G-25去游離FITC，由此計算出 5mg家兔IgG結(jié)合的FITC量。 2020/11/324 2、改良法 （1）試劑配制： 0.01molLpH7.2的PBS配法：NaCl 18g、Na2HPO4 1.15g、KH2PO4+0.2g溶于2000ml蒸餾水中，校定pH值至9.0。 0.5molLpH9.0碳酸鹽緩沖液配法：取0.5molLNa2CO3（5.3）10ml加入0.5molL NaHCO3（4.2）90ml，混合后，校定pH值至9.0。 3重碳酸鈉水溶液配法：稱1.5g無水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水即成。 2020/11/325 （1）試劑配制： 0.01molLp

14、H7.2的PBS配法：NaCl 18g、Na2HPO4 1.15g、KH2PO4+0.2g溶于2000ml蒸餾水中，校定pH值至9.0。 0.5molLpH9.0碳酸鹽緩沖液配法：取0.5molLNa2CO3（5.3）10ml加入0.5molL NaHCO3（4.2）90ml，混合后，校定pH值至9.0。 3重碳酸鈉水溶液配法：稱1.5g無水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水即成。 2020/11/326 藻紅蛋白及標(biāo)記方法 藻紅蛋白或稱藻膽色素蛋白，他存在被稱為藻紅的多聚微粒中，位于葉綠素的反應(yīng)中心，在自然結(jié)構(gòu)中，藻紅蛋白吸收光能，吸收后轉(zhuǎn)化成能量，供其發(fā)育、生長。當(dāng)藻紅蛋白被分離和純化后，

15、其蛋白質(zhì)變得具有很強的熒光，能吸收不同波長的光，發(fā)出亮紅色的熒光，此時不再接受任何外來的光，也不能轉(zhuǎn)移光能。 2020/11/327 藻紅蛋白利用共價鍵結(jié)合的形式與免疫球蛋白結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。應(yīng)用其復(fù)合物進行免疫熒光組化染色，進行定量和定性分析；也可以應(yīng)用藻紅蛋白抗體結(jié)合物進行免疫熒光的雙重或多重染色。尤其是藻紅蛋白的亞型可以發(fā)射不同波長的熒光，例如 PE的發(fā)射波長為520570nm，吸收光譜為490510nm，正好與FITC處于同一的吸收和發(fā)射波長上，利用這一特點進行雙重標(biāo)記，在熒光顯微鏡下，可同時觀察到代表2種抗原成分的不同顏色（亮綠色和橘紅色），大大簡化了免疫熒光的雙標(biāo)。當(dāng)然還可以

16、和其他熒光素，膠體金結(jié)合進行免疫熒光或流式儀的三重以上標(biāo)記。 2020/11/328 標(biāo)記方法如下： 1. 巰基化藻紅蛋白（phycoerthrin，PE）的制備 6001的15.5mgm1鹽酸巰醇亞胺 （iminothiolane hydrochloride）加到1.2ml的 3.6mgm1的PE中，和1.2ml PB（pH6.8）混合，裝入透析袋置人50mmolL pH6.8 PB中透析，4過夜，再換用pH7.5 PB透析6h。每個PE分子中可結(jié)合8個巰基。 2020/11/329 2. PE-IgG制備 異雙功能試劑SPDPN-succinimdyl 3-（2-pyridyldlthio

17、）propi-nate 30g（1.1mgm1）的乙醇溶液，加入700ml的4.2mgml lgG PB溶液（50molLpH7.5），在室溫中反應(yīng)2.5h。再加入巰基化PE400ml（1.7mgm1）加到500l反應(yīng)混合液中，室溫反應(yīng)12h，加入100ml的50mmolL碘乙酸封閉殘余巰基，用PB透析4過夜。加入0.01NaN3分裝，4保存半年。 2020/11/330 3.PE-標(biāo)記蛋白A方法 取4.08mgPE溶于0.1molLpH7.4PB(含0.1molLNacl)lml中，溶解后，取出0.5ml，再加入10ml SPDP無水甲醇液(2.6mgml)，SPDP蛋白摩爾值為10，22反

18、應(yīng)5min，過SephadexG50(117cm)，用100mmolL pH7.4 PBS(含 0.1molL NaCl)平衡和洗脫。 2020/11/331 0.5ml蛋白(2mgm1)100mmolL PBS(含有100mmolL NaCl pH7.4)，加入2.6ml SPDP甲醇液，SPDP蛋白9.5，22 40min，加入25mmolL二硫蘇糖醇(DTT) pH7.4緩沖液，2225min，同上過sephadex G25，收集蛋白A峰。 取0.77mgm1的PE和0.27mgml蛋白A等量混合，22反應(yīng)6h，混合物4保存?zhèn)溆茫陨蟽煞NPE標(biāo)記制品，可最后溶于0.01molL pH7.

19、4PB(含有0.1molLECTA、lmolL碘乙胺、1BAS和0.1NaN3)，05保存。 2020/11/332 熒光素的種類不同，標(biāo)記方法也有所不同，但所有要求的條件和步驟大致相同.影響標(biāo)記的因素有溫度、pH及反應(yīng)液中熒光素和免疫球蛋白的比例。溫度低標(biāo)記時間長，溫度高標(biāo)記時間短。在04時，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗體攪拌612h，在79時攪拌4h為宜。pH以9.09.5最適于免疫球蛋白的標(biāo)記，一方面異硫氰酸熒光素在弱堿性條件下易于溶解，另一方面，在弱堿性環(huán)境下免疫球蛋白的羧基容易暴露，便于結(jié)合。pH偏低標(biāo)記慢，pH偏高(大于pHl0)抗體易變性。 2020/11/333二、熒光抗體的質(zhì)量控制 對制備

20、的熒光抗體必須進行質(zhì)量鑒定，主要進行特異性和敏感性兩個方面的鑒定。 2020/11/334 (一)染色特異性和敏感性的測定方法 1.特異性染色效價測定 直接染色效價以倍比稀釋熒光抗體溶液如1:2，1:4，1:8與相應(yīng)抗原標(biāo)本作一系列染色，熒光強度在“+”的最大稀釋度，為其染色滴度(效價)或單位。實際染色應(yīng)用時，可取低 1個或2個稀釋度(即24個單位)，如染色效價為1:64，實際應(yīng)用時可取1:32或1:16。間接染色效價可按核抗體熒光染色法步驟，先用不同稀釋度的熒光抗體染色，結(jié)果以抗核抗體熒光強度“+”為標(biāo)準(zhǔn)，染色用效價和直接法相同。 2020/11/335 2.非特異性染色測定 根據(jù)熒光抗體的

21、用途不同，可用相類似的抗原切片或涂片，倍比稀釋熒光抗體，按常規(guī)染色，如果在標(biāo)本上出現(xiàn)的非特異染色應(yīng)顯著低于特異染色滴度，否則應(yīng)采取消除非特異性染色的方法處理熒光抗體。 2020/11/336 3.吸收試驗 在熒光抗體中加入過量相應(yīng)抗原，于室溫中攪拌2h后，移人4中過夜，3 000rmin離心30min，收集上清液，再用相應(yīng)抗原陽性標(biāo)本染色，結(jié)果應(yīng)不出現(xiàn)明顯陽性熒光。 2020/11/337 (二)FP值的測定方法 F(熒光素)和P(抗體蛋白)的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量，一般要求FP的克分子比值為12。過高時，非特異性染色增強；過低時，熒光很弱，降低敏感性。 2020/11/338

22、 1.蛋白質(zhì)定量 測定熒光抗體的蛋白質(zhì)毫克毫升量。 2.結(jié)合熒光素定量 先制作熒光素定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，即準(zhǔn)確稱取FITC 1mg，溶于l0ml 0.5mmolL pH9.0的碳酸鹽緩沖液中，再用0.01mmolL pH7.2 PBS稀釋到l00ml，此時熒光素含量為l0Mgml，再倍比稀釋9個不同濃度的溶液，用分光光度計在490nm波長測定光密度值(OD)，以光密度為縱坐標(biāo)，熒光素含量為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)圖。熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其吸收光譜峰值向長波方向位移5nm，F(xiàn)ITC和蛋白質(zhì)結(jié)合后由490nm變?yōu)?93495nm，RB200和蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)?95nm。 2020/11/339FP比值的計算

23、：可按以下公式計算。F/P克分子比值=2020/11/340 式中160 000為抗體蛋白質(zhì)的分子量，390為FITC的分子量。蛋白質(zhì)從克換算為毫克需再乘以103，而熒光素從克換算為微克需要再乘以106。 2020/11/341測定RB200熒光抗體的克分子比值公式如下：TMRITC熒光抗體克分子量比值=A515nmOD A280nmOD 或=重量比（g/g) 160000 5802020/11/342 即先用276nm波長測得蛋白質(zhì)的OD值，再用493nm波長測得FITCOD值，將這兩個OD連成一直線，直線與縱線交叉處，即可查處標(biāo)記抗體的下數(shù)值：FITCgml，F(xiàn)P的gml，F(xiàn)P的克分子比值

24、，蛋白mgml等。 2020/11/343(三)熒光抗體的保存 以0-4或-20低溫保存，防止抗體活性降低和蛋白變性。最好加入濃度為：500010000的硫柳汞或者1:10005000的疊氮鈉防腐，小量分裝如0.1lml，真空干燥后更易長期保存。 2020/11/344第四節(jié) 免疫熒光染色方法 2020/11/345一、直接法 這是最簡便、快速的方法，用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成特異性熒光抗體。直接用于細(xì)胞或組織抗原的檢查，此法特異性高，其缺點是一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差，但非常實用，應(yīng)用也廣泛，例如：穿刺IgA、IgM、IgG的檢測，其效果要優(yōu)于免疫酶標(biāo)，還有轉(zhuǎn)基因的示蹤

25、蛋白，病原體等的檢測?？捎糜谑炃衅?，冷凍切片和細(xì)胞涂片等檢測。 2020/11/346 其操作流程如下： (1)染色：切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價如1：8或1：16的熒光抗體(如兔抗-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等)，在室溫或37染色30min，切片置人能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。 2020/11/347 (2)洗片：傾去存留的熒光抗體，將切片浸入pH7.4或pH7.2 PBS中洗2次，電磁振動，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結(jié)晶。 (3)用50緩沖(0.5molL pH9.09.5碳酸鹽緩沖液)甘油封固、鏡檢。 (4)對照染色：正常兔熒光血清染色。 2

26、020/11/348 如上法處理切片，結(jié)果應(yīng)為陽性。染色抑制試驗(一步法)：將熒光抗體和未標(biāo)記的抗體球蛋白或血清(相同)等量混合，如上法處理已知陽性抗原的切片。結(jié)果應(yīng)為陰性。為證明此種染色抑制不是由于熒光抗體被稀釋所致，可用鹽水代替未標(biāo)記抗血清，染色結(jié)果應(yīng)為陽性。此法結(jié)果較穩(wěn)定。 2020/11/349二、間接琺 此法是直接法的重要改進，先用特異性 (對細(xì)胞或組織內(nèi)抗原)抗體(或稱第一抗體)與細(xì)胞標(biāo)本反應(yīng)，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體(也稱第二抗體)與結(jié)合在抗原上的抗體(是第二抗體的抗原)結(jié)合，形成抗原一抗體一熒光抗體的復(fù)合物。2020/11/350 由于結(jié)合在抗原抗

27、體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了敏感性。如細(xì)胞抗原上每個分子結(jié)合35個分子抗體，當(dāng)此抗體作為抗原時又可結(jié)合35個分子的熒光抗體，所以和直接法相比熒光亮度可增強34倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種第一抗體的標(biāo)記顯示，這是現(xiàn)在最廣泛應(yīng)用的技術(shù)。2020/11/351 (1)標(biāo)本：腎穿刺標(biāo)本冷凍切片，厚 5m。 (2)試劑 第一抗體：羊抗人IgG抗血清(1:40)、羊抗人IgA抗血清(1:30)、羊抗人 IgM抗血清(1:30)，購自上海生物制品研究所； 兔抗羊IgMFITC(1:30)，本實驗室自制； 0.01molLpH7.4的PBS； 緩沖甘

28、油(配法同直接法)。 2020/11/352 (3)染色步驟 腎穿刺標(biāo)本冷凍切片室溫下丙酮固定 10s，PBS洗3次，每次5s； 置切片于濕盒內(nèi)分別滴加羊抗人 IgG、羊抗人IgA及羊抗人IgM抗血清，37 30s； 以PBS洗切片3次，每次5s； 滴加兔抗羊IgG-FITC，37，30s； 以PBS洗切片3次，每次5s； 緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。 (4)結(jié)果：腎小球特異性熒光染色呈翠綠色。 2020/11/353三、補體法 (一)直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物方法 用抗補體C3等熒光抗體直接作用組織切片，與其中結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的補體反應(yīng)，而形成抗原一抗體一補體復(fù)合物與抗補體熒光抗

29、體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部位就是免疫復(fù)合物上補體存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢診斷等。 2020/11/354 (二)間接檢查組織內(nèi)抗原方法 常將新鮮補體與第一抗體混合同時加在抗原標(biāo)本切片上，經(jīng)37孵育后，如發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，補體就結(jié)合在次復(fù)合物上，再用抗補體熒光抗體與結(jié)合的補體反應(yīng)，形成抗原一抗體一熒光抗體的復(fù)合物，此法優(yōu)點是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的第一抗體的檢查。 2020/11/355 1.材料和試劑 免疫血清60滅活20min，用Kolmers鹽水作2倍稀釋成l:2，1:4，1:8。補體用1:10稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補體熒光抗體等，按下述的補體法染色

30、。免疫血清補體結(jié)合的效價如為1:32則免疫血清應(yīng)用1:8稀釋。 2020/11/356 補體用新鮮豚鼠血清一般作1:10稀釋或按補體結(jié)合反應(yīng)試管法所測定的結(jié)果，按2U的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用。 Kolmers鹽水配法：即在pH7.4的0.1mol LPBS中溶解0.01MgS04。 抗補體熒光抗體：在免疫血清效價為1:4，補體為2U的條件下，用補體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價，然后按染色效價1:4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。 2020/11/357 2.方法步驟 涂片或冷凍切片固定和PBS洗1次，3min，吹至組織表面無水分。 吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清及補體的

31、等量混合液(此時的免疫血清及補體又都各稀釋1倍)低于切片上，37作用30min，置于保持一定濕度的染色盒內(nèi)。 2020/11/358 用緩沖鹽水洗2次，攪拌或振動，每次 5min，吸干標(biāo)本周圍水液。 滴加經(jīng)過適當(dāng)稀釋的抗補體熒光抗體，37反應(yīng)30min水洗同。 蒸餾水洗lmin，緩沖甘油封固。 2020/11/359 3.對照染色 按間接方法對照進行。 抗原對照。陽性對照應(yīng)為+。 抗血清對照。用正常兔血清代替免疫血清結(jié)果陰性。 滅活補體對照。將補體經(jīng)56 30min處理后，按補體同樣比例稀釋，與免疫血清等混合后，進行補體法染色結(jié)果陰性。 2020/11/360 本法所用熒光抗體不受免疫血清的動

32、物種屬的限制，因而一種熒光抗體可作更廣泛的應(yīng)用，敏感性亦較間接法高，效價低的免疫血清亦可應(yīng)用，節(jié)省免疫血清，尤其是對檢查形態(tài)小的如立克體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質(zhì)時甚為理想。 2020/11/361四、雙重免疫熒光細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記方法 在同一細(xì)胞組織標(biāo)本上需要同時檢查兩種抗原時要進行雙重?zé)晒馊旧?，一般均采用直接法，將兩種熒光抗體(如抗A和抗B)以適當(dāng)比例混合，加在標(biāo)本上孵育后，按直接法用TMRITC或RB200標(biāo)記或PE標(biāo)記，發(fā)紅色熒光，可以明確顯示兩種抗原的定位。2020/11/362 在同一標(biāo)本上有兩種抗原需要同時顯示(如A抗原和B抗原)，A抗原的抗體用FITC標(biāo)記，B抗原的抗體用羅達(dá)明

33、標(biāo)記，可采用以下染色方法： 1.一步法雙染色方法 先將兩種標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例混合(A+B)，按直接方法進行染色。 2.二步法雙染色方法 先用RB200標(biāo)記的B抗體染色，不必洗去，再用FITC標(biāo)記的A抗體染色，按間接法進行。 結(jié)果：A抗原陽性熒光呈現(xiàn)綠色，B抗原陽性呈現(xiàn)橘紅色熒光。 2020/11/363 五、對照試驗 為了保證免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色的準(zhǔn)確性，排除某些非特異性染色，必須在初次試驗時進行以下對照試驗： (一)直接方法(需設(shè)對照試驗) 1.標(biāo)本自發(fā)熒光對照 標(biāo)本只加PBS或不加PBS，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察應(yīng)呈陰性熒光(無與特異性熒光相似的熒光)。 2020/11/364 2.抑

34、制試驗 可分為二步法和一步方法。 二步抑制方法：標(biāo)本先加未標(biāo)記的特異性抗體，水洗后再加標(biāo)記熒光抗體，結(jié)果應(yīng)呈陰性或明顯減弱的熒光。 一步抑制方法：先將熒光抗體與未標(biāo)記特異性抗體等量混合，再加在標(biāo)本上染色，結(jié)果應(yīng)為陰性，此法效果較二步法好，并且簡便。 3.陽性對照 將已知陽性標(biāo)本用直接法免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果應(yīng)呈陽性熒光。 2020/11/365 (二)間接方法 1.自發(fā)熒光對照 同上。 2.熒光抗體對照 標(biāo)本只加間接熒光抗體染色，結(jié)果陰性。 3.抑制試驗 同上。 4.陽性對照 同上。 結(jié)果：如對照l和2無熒光或弱熒光，3待檢查標(biāo)本呈強熒光即為特異性陽性熒光。 2020/11/366 (三)

35、補體方法 1.自發(fā)熒光對照。 2.熒光抗體對照。 3.抑制試驗。 乙補體對照 取新鮮豚鼠血清1:10稀釋先作用標(biāo)本，洗后再用抗補體熒光抗體染色，結(jié)果陰性。 5.抑制試驗 標(biāo)本加滅活的第一抗體，再加1:10稀釋的新鮮豚鼠血清孵育后，再加未標(biāo)記的抗補體血清與抗補體熒光抗體等量混合稀釋液，結(jié)果應(yīng)為陰性。 6.陽性對照。 15結(jié)果陰性，6和待檢標(biāo)本陽性時，則為特異性熒光。 2020/11/367第五節(jié) 非特異性染色 的消除方法 2020/11/368一、非特異性染色的重要因素 組織的非特異性染色的機制很復(fù)雜，其產(chǎn)生的原因主要可分以下幾點： (1)一部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不能

36、被透析除去引起非特異性染色。 (2)抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分非特異性結(jié)合。 2020/11/369 (3)除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原(如Forssman抗原)，可與組織中特異性抗原以外的相應(yīng)抗體結(jié)合。 (4)從組織中難以提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。 (5)抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多，這種過量標(biāo)記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。 2020/11/370 (6)熒光素不純，標(biāo)本固定不當(dāng)?shù)取?(7)組織或細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)的自發(fā)熒光。 (8)染色時間過長，溫度

37、過高，沖洗不夠甚至在染色過程中標(biāo)本干燥等原因，都會引起非特異性熒光染色。 2020/11/371二、消除非特異性染色的方法 應(yīng)根據(jù)產(chǎn)生非特異性熒光的因素，采取相應(yīng)的處理方法，常用有以下幾種： l.襯染法 最常用0.10.05伊文斯藍(lán)在熒光抗體染色后再染25s或用0.05伊文斯藍(lán)稀釋抗體來抑制自發(fā)熒光。 將背景的細(xì)胞和組織染成紅色，與黃綠色熒光形成鮮明對比。 2020/11/372 2.熒光抗體 在染色前用SephadexG25或G-50(用微柱型)以除去游離或聚合的熒光素及未標(biāo)記的蛋白。 3.胰蛋白酶消化 經(jīng)常用0.10.05胰蛋白酶消化，對于石蠟切片不僅可以提高陽性率和陽性強度，而且可抑制非

38、特異性免疫熒光染色。消化時間要根據(jù)組織類型，固定液的不同而選擇消化時間，如腎穿標(biāo)本0.05胰蛋白酶消化2h最佳，而肝癌切片且消化2030min最佳。 2020/11/373 4.吸收 用小鼠肝粉或組織干粉吸收熒光抗體之后，再將熒光抗體作適當(dāng)高倍稀釋，常用于消除組織中非特異性熒光染色效果較好。 5.用正常(非免疫)血清 如110牛或羊血清先處理切片之后，再染色有明顯地清除自發(fā)熒光和非特異性熒光染色的效果。 6.雙重標(biāo)記 用羅達(dá)明類熒光素標(biāo)記抗體與用FITC標(biāo)記的熒光抗體相混合進行雙重標(biāo)記染色可消除背景FITC的非特異性染色，同時可證實兩種抗原的成分。 2020/11/374 7.提高抗體和標(biāo)記熒

39、光抗體的質(zhì)量可采用高特異性和高效價的免疫血清。為了克服交叉免疫反應(yīng)，應(yīng)將抗原高度純化，作為免疫球蛋白的Fab或F(ab)：段標(biāo)記熒光素可避免Fc段交叉染色。制備人類5種免疫球蛋白的重鏈抗體和、輕鏈抗體尤其是使用單克隆抗體以保證抗體的高特異性。FP值一定保證12之間。另外可采用親和層析法來純化抗體。也可用DEAE纖維素層析法來純化標(biāo)記抗體。 2020/11/375 但經(jīng)DEAE處理后，其抗體量一般約損失50。因此某些要求不太高的抗體，如抗細(xì)菌熒光抗體，不一定要這樣處理，可用染色效價測定處理法，具體方法如下：先測定熒光抗體之特異性染色與非特異性染色效價，若兩者效價相差較大，則可將熒光抗體稀釋至臨界

40、濃度，使特異性染色呈陽性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法與染色效價測定方法相同。2020/11/376 肝粉的制作方法如下： 將若干只小白鼠或大白鼠放血殺死，取出肝臟，用生理鹽水洗23次，除去血液，剝掉表面的結(jié)締組織或脂肪。 剪碎，用生理鹽水反復(fù)洗滌到無血色止，然后再加生理鹽水少許，用組織搗碎機或勻漿器作成勻漿。 2020/11/377 將肝勻漿裝入離心管內(nèi)(13左右)，交換的用23倍量生理鹽水和丙酮反復(fù)洗滌各3次，置上清無血色止；每次完畢先用 2 000rmin離心沉淀15min后，再除去上清液。 最后用丙酮洗滌肝勻漿，再用布氏漏斗過濾，或離心沉淀，將沉淀物平鋪在潔凈的玻璃板上，37烤干

41、(過夜)。 在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩過后，分裝，密封，低溫干燥保存。 2020/11/378第六節(jié) 使用熒光顯微鏡的 注意事項 1.嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。 2.應(yīng)在暗室中進行檢查，進入暗室后接通高壓穩(wěn)壓器電源，開啟35min后進行激發(fā)高壓汞燈，當(dāng)看到高壓汞燈完全亮后，停止激發(fā)，再開始觀察標(biāo)本。 2020/11/379 3.防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡。 4.檢查時間每次以1h為宜，超過 90min高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱，標(biāo)本經(jīng)激發(fā)15min后，熒光亦明顯減弱。 5.熒光顯微鏡的激發(fā)裝置及高壓汞燈壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集

42、中檢查，節(jié)省時間。 6.標(biāo)本染色后應(yīng)立即觀察，因存放時間太久，熒光會逐漸猝滅?？蓪⑷竞蒙臉?biāo)本用黑紙包好，存放在聚乙烯塑料袋中，4保存，可延緩熒光的猝滅時間。 2020/11/380 7.熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般為四級，即“”，無或可見微弱自發(fā)熒光?！?”，僅能見明確可見的熒光?！?”，可見有明亮的熒光?！?”，可見耀眼的熒光。 8.熒光顯微鏡的維護與保養(yǎng) (1)鏡頭的清潔：鏡頭上粘的灰塵，應(yīng)用柔軟的刷子輕輕刷掉，在有指紋和油污的地方宜用柔軟干凈的脫脂棉、紗布或擦鏡紙蘸上無水甲醇或乙醇輕輕擦拭，對物鏡表面上的油漬只能用汽油擦拭。 2020/11/381 (2)涂漆部分、塑料部分的清潔：涂漆部分

43、、塑料部分用中性去污劑擦拭，避免使用有機溶劑。 9.熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求 (1)載玻片：載玻片厚度應(yīng)在0.8 1.2mm之間，太厚的玻片光吸收多，也不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚焦。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時需用石英玻璃載玻片。 2020/11/382 (2)蓋玻片：蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如氟化鎂)的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光又可激發(fā)標(biāo)本。 (3)標(biāo)本：組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能充分激發(fā)。另外，細(xì)胞重疊或雜質(zhì)掩蓋，背景非特異性染色引起的熒光影響判斷。 2020/11/383 (4)封裱劑：封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度