江南大學4-糖代謝與控制 - 副本課件

1、第四章 糖代謝與控制生命科學學院胡慶森3.1 糖代謝與調(diào)節(jié)3.2 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖3.3 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸糖代謝的途徑 糖代謝的主要途徑有： 1.糖的酵解途徑EMP途徑2.TCA循環(huán) 3.HMP途徑（磷酸戊糖途徑） 4.ED與PK 途徑（不作為重點，自學） 4.1 糖代謝與調(diào)節(jié)2022/10/15 糖酵解(glycolysis)一詞來自希臘語 (glykys meaning “sweet,” and lysis, meaning “splitting”)，該途徑的全過程已于1940年完全弄清楚。 糖酵解途徑是葡萄糖經(jīng)1,6-2磷酸果糖降解為丙酮酸的過程，又稱為EMP途徑(Embd

2、en-Meyerhof Pathway）或HDP途徑（雙磷酸己糖途徑）。 從葡萄糖開始降解到生成為丙酮酸，包括10個獨立但連續(xù)的反應。4.1.1 糖酵解(glycolysis)途徑的特點及調(diào)節(jié)機制2022/10/15P3PPOOHOHCH2CH2OO12546P磷酸二羥丙酮123+P異構6-磷酸果糖P564磷酸甘油醛PP1，3-二磷酸甘油酸PCOHCOHH2COOH3-磷酸甘油酸P2-磷酸甘油酸P磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸6-磷酸葡萄糖PG葡萄糖活化裂解脫氫異構PP1，6-二磷酸果糖活化產(chǎn)能脫水異構產(chǎn)能HHOH2022/10/15 糖原（或淀粉）1-磷酸葡萄糖6-磷酸葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷

3、酸果糖3-磷酸甘油醛磷酸二羥丙酮21，3-二磷酸甘油酸23-磷酸甘油酸22-磷酸甘油酸2磷酸烯醇丙酮酸2丙酮酸耗能階段產(chǎn)能階段葡萄糖EMP途徑+2ATP+2ATP-1ATP-1ATPCH2ICOOH 不可逆抑制3-磷酸甘油醛脫氫酶氟化物是烯醇化酶的不可逆抑制劑。無氧條件下即可反應2022/10/15 糖原（或淀粉）1-磷酸葡萄糖6-磷酸葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖3-磷酸甘油醛磷酸二羥丙酮21，3-二磷酸甘油酸23-磷酸甘油酸22-磷酸甘油酸2磷酸烯醇丙酮酸2丙酮酸葡萄糖+2ATP+2ATP-1ATP-1ATP2022/10/15 EMP途徑總的反應式如下所示。 C6H12O6+2AD

4、P+2Pi+2NAD+2CH3COCOOH+2ATP+2NADH 所生成的丙酮酸，在不同微生物體內(nèi)，不同條件下，生成不同的代謝產(chǎn)物。2022/10/15糖酵解調(diào)節(jié)機制-能荷調(diào)節(jié) 糖酵解調(diào)節(jié)點主要是三個激酶：己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶，所催化的三個反應是不可逆的，只參與糖酵解，不參與糖的新生。而激酶的活性是受細胞能荷調(diào)節(jié)的。為從數(shù)量上表示細胞內(nèi)三種腺嘌呤核苷酸的能量情況，1968年Atkinson和Walton提出了能荷概念：能荷是細胞中高能磷酸狀態(tài)一種數(shù)量上的衡量，它的大小可用下式表示： 能荷=(ATP)+1/2(ADP)/(ATP)+(ADP)+(AMP)2022/10/15(ATP

5、)+1/2(ADP)/(ATP)+(ADP)+(AMP) 當體系中ATP含量高時，ATP抑制磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶的活性，使糖酵解減少。 當需要能量時，ATP分解為ADP、AMP，這樣ATP減少，ADP增加、AMP增加能荷降低激酶活性增大； 無機磷也是調(diào)節(jié)者，它能解除6-磷酸葡萄糖對己糖激酶的抑制，加快糖酵解。 檸檬酸、脂肪酸和乙酰-CoA對糖酵解系統(tǒng)也有制動作用。2022/10/154.1.3在無氧條件下丙酮酸的去路在乳酸菌中，受乳酸脫氫酶作用，丙酮酸作為受氫體而被還原為乳酸，即為同型乳酸發(fā)酵；在酵母中，丙酮酸脫羧生成乙醛，后者在乙醇脫氫酶作用下，乙醛為受氫體被還原成乙醇，即酒精發(fā)酵；在梭

6、狀芽孢桿菌中，丙酮酸脫羧生成乙酰-CoA。然后經(jīng)一系列變化生成丁酰-CoA、丁醛，兩者作為客觀存在氫體被還原為丁醇，生成物還有丙酮、乙醇、乙醇，稱為丙酮丁醇發(fā)酵。2022/10/15過程5-磷酸核糖5-磷酸木酮糖6-磷酸葡萄糖糖酵解6-磷酸葡萄糖酸 NADP+NADPH+H+5-磷酸核酮糖 NADP+NADPH+H+CO27-磷酸景天酮糖3-磷酸甘油醛6-磷酸果糖4-磷酸赤蘚糖3-磷酸甘油醛 氧化階段非氧化階段2NADPH生物氧化O26ATP + 2H2O6(6-磷酸葡萄糖)+6O2 6(5-磷酸核酮糖)+6CO2+6H2O+36ATP葡萄糖+O2 6CO2+6H2O+30ATP(66-6(活

7、化)3-磷酸甘油醛6-磷酸果糖2022/10/15 HMP途徑總的反應式如下所示。 一份子葡萄糖經(jīng)過HMP途徑產(chǎn)生123-6=30 分子ATP 有氧條件下即可發(fā)生HMP反應6-磷酸葡萄糖 + 12 NADP+ + 12 H2O 6CO2 +12 NADPH+12 H+ Pi2022/10/15原核細胞細胞質(zhì)真核生物線粒體基質(zhì)（線粒體）4.1.6 糖的有氧氧化2022/10/15 三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic acid Cycle, TCA)也稱為檸檬酸循環(huán)，這是因為循環(huán)反應中的第一個中間產(chǎn)物是一個含三個羧基的檸檬酸。由于Krebs在1937年正式提出了三羧酸循環(huán)的學說，故此循環(huán)又稱為

8、Krebs循環(huán)。所有的相關反應均在線粒體中進行。 三羧酸循環(huán) 在好氧真核生物線粒體基質(zhì)中或好氧原核生物細胞質(zhì)中，酵解產(chǎn)物丙酮酸脫羧、脫氫，徹底氧化為CO2、H2O并產(chǎn)生ATP的過程。2022/10/15CoASHNADH+H+NAD+CO2NAD+NADH+H+CO2GTPGDP+PiFADFADH2NADH+H+NAD+H2OH2OH2OCoASHCoASHH2O檸檬酸合酶順烏頭酸酶異檸檬酸脫氫酶-酮戊二酸脫氫酶復合體琥珀酰CoA合成酶琥珀酸脫氫酶延胡索酸酶蘋果酸脫氫酶GTPGDPATPADP核苷二磷酸激酶TCA循環(huán)2022/10/15 a、總反應式: CH3COSCoA+3NAD+FAD+

9、GDP+Pi+2H2O 2CO2+CoASH+3NADH+3H+ +FADH2+GTP能量“現(xiàn)金” : 1 GTP 能量“支票”: 3 NADH 1 FADH2兌換率 1：39ATP兌換率 1：22ATP1ATP12ATPb、三羧酸循環(huán)的能量計量4.1.7 TCA反應階段的反應方程式和化學計量關系注意：現(xiàn)在有新的理論，計算結(jié)果差別較大。2022/10/15酵解階段： 2 ATP 2 1 NADH兌換率 1：3 (或2)2 ATP2 (3ATP或2 ATP )三羧酸循環(huán)：2 1 GTP 2 3 NADH 2 1 FADH22 1 ATP2 9 ATP2 4 ATP兌換率 1：3兌換率 1：3丙酮

10、酸氧化：2 1NADH兌換率 1：32 3 ATP總計：38 ATP或36 ATP1摩爾葡萄糖完全氧化產(chǎn)生的ATP數(shù)量2022/10/15是三大營養(yǎng)物質(zhì)氧化分解的共同途徑；是三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝聯(lián)系的樞紐；為其它物質(zhì)代謝提供小分子前體；為呼吸鏈提供H+ + e。4.1.8 三羧酸循環(huán)的生理意義2022/10/15乙酰CoA 檸檬酸 草酰乙酸 琥珀酰CoA -酮戊二酸 異檸檬酸 蘋果酸 NADH FADH2 GTP ATP 異檸檬酸 脫氫酶檸檬酸合酶 -酮戊二酸脫氫酶復合體 ATP +ADP ADP +ATP 檸檬酸 琥珀酰CoA NADH 琥珀酰CoA NADH +Ca2+ Ca2+ ATP、AD

11、P的影響 產(chǎn)物堆積引起抑制循環(huán)中后續(xù)反應中間產(chǎn)物變構反饋抑制前面反應中的酶 其他，如Ca2+可激活許多酶NAD+ Ca2+ 4.1.9 TCA循環(huán)的調(diào)控2022/10/15乙酰CoA 檸檬酸 草酰乙酸 琥珀酸 -酮戊二酸 異檸檬酸 蘋果酸 乙醛酸 4.1.10 乙醛酸循環(huán)延胡索酸 異檸檬酸裂解酶蘋果酸合成酶乙酸 乙酰輔酶A合成酶2022/10/15 1860年，巴斯德發(fā)現(xiàn)，在厭氧條件下高速糖酵解的酵母若通入氧氣，則葡萄糖消耗的速率急劇下降，厭氧酵解所積累的乳酸迅速消失，在這種缺氧的同時，葡萄糖消耗減，乳酸堆積終止的現(xiàn)象，稱為巴斯德效應。 原因：在氧存在的情況下，氧化磷酸化使NADH的H+不再轉(zhuǎn)

12、給丙酮酸生成乳酸而是轉(zhuǎn)給氧，并產(chǎn)生大量ATP。丙酮酸進入TCA循環(huán)使檸檬酸濃度增加，由于高含量的ATP和檸檬酸變構抑制磷酸果糖激酶的活性，從而減緩了糖酵解速度和TCA循環(huán)的速度。4.1.11 巴斯德效應(Pastuer effect)2022/10/154.2.1 D- 核糖的主要用途 D- 核糖多用于合成VB2, VB2 廣泛用于食品、飼料、制藥和化妝品等行業(yè); D-核糖還可用于合成IMP和GMP等食品香味促進劑 在醫(yī)藥工業(yè)中D- 核糖是合成類固醇、前列腺素類、維生素 的結(jié)構類似物、萜類化合物的初始原料4.2 D-核糖發(fā)酵2022/10/154.2.2 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖的歷史與現(xiàn)狀1

13、951 年Simonart 和 Godin首次報道了發(fā)酵法生產(chǎn) D-核糖1966 年, Saito 和 Sugiyama報道了食爬蟲假單胞菌( Pseud monas reptilivora ) 在30 oC通氣培養(yǎng)72 h 發(fā)酵液中能積累D-核糖 0.72 g/L。1971 年, Sasajima 和 Yoneda報道了芽胞桿菌屬細菌的轉(zhuǎn)酮酶缺陷株在最適的發(fā)酵條件下, 發(fā)酵液中可積累D-核糖35 40 g/L。1976 年，Sasajima 等人，不產(chǎn)芽孢的突變株, 70 g/ L1990 年, 星野達雄等人， 枯草芽孢桿菌突變株，118. 8 g/ L主要生產(chǎn)廠家：德國BASF，Merk;

14、瑞士Hoffmann-La Roche; 美國Pfizer;日本Takeda化學工業(yè)株式會社80 g/L2022/10/155-磷酸核糖5-磷酸木酮糖6-磷酸葡萄糖6-磷酸葡萄糖酸5-磷酸核酮糖7-磷酸景天酮糖3-磷酸甘油醛6-磷酸果糖4-磷酸赤蘚糖3-磷酸甘油醛(6-磷酸果糖)核糖3-磷酸甘油醛磷酸烯醇式丙酮酸莽草醛VK,COQ,phen-AA4.2.3 D-核糖的生物合成路徑和育種思路核苷酸、輔酶2022/10/15 1、出發(fā)菌株選擇 芽孢桿菌屬的細菌轉(zhuǎn)酮酶缺陷突變株積累D-核糖具有普遍性。而E.coli、鼠傷寒沙門氏等細菌的轉(zhuǎn)酮酸缺陷突變株并不積累核糖，因此多采用芽孢桿菌屬細菌。4.2.

15、4 D-核糖發(fā)酵的代謝育種技術2022/10/152、轉(zhuǎn)酮酶缺陷突變株的分離（選育） 選育不利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖的突變株，因為D-葡萄糖酸和L-阿拉伯糖必須通過磷酸戌糖途徑進行代謝，若轉(zhuǎn)酮酶發(fā)生缺陷，那樣菌體自然也就不能利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖。 選育莽草酸缺陷突變株 選育L-Trp-、L-Tyr-、L-Phe-、CoQ-、Vk-或Vm-、 4-磷酸赤蘚糖營養(yǎng)缺陷型、 轉(zhuǎn)酮酶缺陷型、轉(zhuǎn)醛酶缺陷型。2022/10/15 1989年,Kishimoto 選育到的短小芽孢桿菌產(chǎn)量達到92 g/L 1997 年鄧崇亮等通過紫外線和甲基磺酸乙酯誘變選育莽草酸營養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵 72 h

16、產(chǎn)核糖 55 g/L。 1999 年謝紅等用紫外線照射篩選到一株草莽酸缺陷型枯草芽孢桿菌, 產(chǎn)D- 核糖42 g/L 以上 46.6 g/L2022/10/153、其它標記 在維持轉(zhuǎn)酮酶缺陷的情況下，進一步誘變使菌體帶上具有高葡萄糖脫氫酶活性、高葡萄糖酸激酶和喪失孢子形成能力，可使D-核糖大量積累。2022/10/15 小林等人將葡萄糖脫氫酶基因克隆到載體質(zhì)粒PHY300PLK中，然后轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中去。構建擴增葡萄糖脫氫酶的D-核糖工程菌，350C發(fā)酵80 h可積累D-核糖49 g/L 。 4、利用基因工程技術構建D-核糖工程菌株2022/10/15發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源：葡萄糖、D-甘露糖、

17、山梨醇、D-甘露醇、麥芽糖、 乳糖、甘油、 糊精、可溶性淀粉等。氮源：干酵母、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨 、玉米漿 、(NH4)2SO4其他：磷酸鹽，碳酸鹽，適量微量元素。 要在好氧條件下，pH中性，溫度37 0C 。 5、發(fā)酵控制2022/10/15D-核糖典型發(fā)酵過程曲線2022/10/15 The comparation of the perform of B. subtilis SPK1 under different conditions (at the late-exponential phase). Dry cell mass, glucose, xylose, D-ribose,

18、DO, pH, feed rate 46.6 g/L23 g/L2022/10/15Optimized fed-batch fermentation of B. subtilis SPK1were 2.0 and 1.2-fold higher than the corresponding values in a simple batch fermentation.2022/10/154.3 檸檬酸發(fā)酵 檸檬酸化學名稱2-羥基丙三羧酸，英文名citric acid，分子式C6H8O7。無色或白色晶體，無臭，味極酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反應。2022/10/154.3.1 檸

19、檬酸合成途徑的發(fā)現(xiàn)1893年，C. Wehmer發(fā)現(xiàn)Penicillium能積累檸檬酸 1913年，Currie發(fā)現(xiàn)黑曲霉能在高濃度糖上合成檸檬酸 1940年，Krebs發(fā)現(xiàn) TCA過程；1953年，Jagnnathan證實黑曲霉中存在EMP途徑所有酶； 1954年，Shu提出葡萄糖分解代謝中經(jīng)80% 走EMP途徑；1954-1955年，Ramakrishman和Martin發(fā)現(xiàn)黑曲霉中存在 TCA循環(huán)。1958年,Medomough發(fā)現(xiàn)黑曲霉還存在著HMP途徑的酶， 但HMP途徑主要存在與孢子形成階段。 2022/10/15 大多數(shù)微生物在代謝過程中都能合成檸檬酸，正常生理狀況下很少積累檸檬

20、酸。 工業(yè)生產(chǎn)幾乎都是用黑曲 霉作為生產(chǎn)菌，黑曲霉產(chǎn)酸量高，轉(zhuǎn)化率也高。且能利用多種碳源，因而是檸檬酸生產(chǎn)的最好菌種。 用石油副產(chǎn)品為原料生產(chǎn)檸檬酸，主要以假絲酵母屬為生產(chǎn)菌種，其次是畢赤酵母、球擬酵母、漢遜氏酵母和紅酵母屬的一些種。2022/10/154.3.2 行業(yè)簡介 目前，我國檸檬酸行業(yè)從產(chǎn)量上位居世界第一，從技術上，在國際上也是處于世界領先水平，并領先于其他國家. 2022/10/152022/10/15乙酰CoA 檸檬酸 草酰乙酸 琥珀酸 -酮戊二酸 異檸檬酸 蘋果酸 乙醛酸 4.3.3檸檬酸生物合成途徑延胡索酸 乙酰CoA 丙酮酸 葡萄糖 EMP2022/10/15 葡萄糖經(jīng)由E

21、MP途徑生物合成檸檬酸時，葡萄糖分子經(jīng)過碳架斷裂及重組，但沒有碳原子損失，理論轉(zhuǎn)化率106.7%。2C6H12O6+3O2-2C6H8O7+4H2O 葡萄糖經(jīng)由HMP途徑生物合成檸檬酸時，葡萄糖損失1個碳原子，理論轉(zhuǎn)化率88.9 %。 2022/10/15乙酰CoA 檸檬酸 草酰乙酸 琥珀酸 -酮戊二酸 異檸檬酸 蘋果酸 乙醛酸 檸檬酸合成酶磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶烏頭酸酶異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸裂解酶 4.3.4檸檬酸 發(fā)酵機制延胡索酸 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸 乙酰CoA 葡萄糖 CO22022/10/154.3.9 檸檬酸發(fā)酵的代謝控制育種1、出發(fā)菌株的選擇2、選擇透明圈大的突變株。 如：平板：10%甘薯 + 2%的瓊脂 + 0.5