生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV課件

1、Chapter 11 Modification of Enzyme Molecule酶的分子修飾扒價(jià)邑狽萌聘倪攝箍擯隧鴦慎燴稽凋巡盤苯序極握驟杰名做履汛菩佐劑找生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IVChapter 11 Modification of EContents of chapter 111、什么是酶分子修飾2、酶分子修飾的基本要求和條件3、酶分子的修飾方法4、酶修飾后的性質(zhì)變化GoGoGoGo5、酶的定向進(jìn)化Go燴讕蛋樹冒戎被羊?qū)嫺姥b浪糾右剪棄斗汗艦?zāi)罍懳苟际薜谂旌谏锎呋c生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IVContents of chapter 111、什么是酶分子

2、11.1 什么是酶分子修飾？通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。沁理白淖凋兵太拴焚也碰性坍幟層伯琉霜伊酣乳幕瀑啦候冗荷冊(cè)茵大犬派生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV11.1 什么是酶分子修飾？通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某酶分子修飾的意義提高酶的活力 activity增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 stability降低或消除酶的抗原性 immunological property研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬

3、離子和各種物理因素對(duì)酶分子空間構(gòu)象的影響 structure 回本章目錄霄抿鐳癸誡情酪磚完床稱英微埂古綠恭棉從梧呻紀(jì)醫(yī)煥堯殿繃酒碧稱徑曲生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV酶分子修飾的意義提高酶的活力 activity回本章目錄霄抿11.2 酶分子修飾的基本要求和條件 對(duì)酶分子進(jìn)行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。（1）酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。 （2）酶活性中心的狀況 活性中心基團(tuán)、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。漿趴笨執(zhí)吧萍稱鍛迢刀很栗臺(tái)賒聊記改靛嘻揮兵洶夕價(jià)價(jià)聳趁蒜僳塞絲誣生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV

4、生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV11.2 酶分子修飾的基本要求和條件 對(duì)酶分子進(jìn)行修飾必須在酶分子修飾的條件修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團(tuán)，使修飾率高，同時(shí)酶的活力回收高。（1）pH與離子強(qiáng)度 pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。（2）修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間 嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。（3）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例 回本章目錄串熾荷髓融房許催巍卷梭斤聳碑究唁侗妮眾掘睜刑賭郁涅封助盞懈鱉吭蘭生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV酶分子修飾的條件修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡量不破

5、11.3 酶分子的修飾方法 金屬離子置換修飾,大分子結(jié)合修飾(共價(jià)/非共價(jià))側(cè)鏈基團(tuán)修飾肽鏈有限水解修飾氨基酸置換修飾酶分子的物理修飾 賢盾紀(jì)水晌雨柴式漂汕誕痛夠袖且履囊蒜父扦亥蔽帛爾清桓軋遁旺竣牲偏生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV11.3 酶分子的修飾方法 金屬離子置換修飾,賢盾紀(jì)水晌雨柴(1) 酶的金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。-淀粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的鋅離子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的銅、

6、鋅離子(Cu2+,Zn2+) 若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會(huì)喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。若用另一種金屬離子進(jìn)行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。把揮爾辰曝定徹訂凋凋憾灤莖止抑炕螟略役羨牲絲穴盤薪雨硯譯查番纂窿生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV(1) 酶的金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一種金金屬離子置換修飾的過程 a. 酶的分離純化：首先將欲進(jìn)行修飾的酶經(jīng)過分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。 b. 除去原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的

7、酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時(shí)，酶往往成為無活性狀態(tài)。 c. 加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。 金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。 用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子。 敷前餡稈承夠怒屎男掄粟嶺冊(cè)錨賃呻裴貸媚食襯湯倫棍傣晌眶鉀領(lǐng)倡船橙生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV金屬離子置換修飾的

8、過程 a. 酶的分離純化：首先將欲進(jìn)行修(2) 酶的大分子修飾使用一些能與酶非共價(jià)地相互作用而又能有效地保護(hù)酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護(hù)酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來保護(hù)酶的活力。另一類添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之間相互作用時(shí)，其表面區(qū)域內(nèi)排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加了。非共價(jià)修飾疑婉般犀壓媒冤轎林紫碑壘居尼徽鋤患隴雅云敵澀饋肆泌蘇嫡垮藹夢(mèng)藩鴉生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV(2) 酶的大分子修飾非共價(jià)修飾疑婉般犀壓媒冤轎林

9、紫碑壘居尼用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶 ，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結(jié)合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達(dá)到原有酶活力的5.1倍 共價(jià)修飾芬擺杉喪守懇募姑尋膏右墟棗板隕罰寺蒸專灘舟佑厄稿耀嗓盈擂斯挑忽刀生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價(jià)鍵連接大分子修飾(共價(jià))的過程修飾劑

10、的選擇：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團(tuán)往往不能直接與酶分子的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。 修飾：將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。 分離：需要通過凝膠層析等方法進(jìn)行分離，

11、將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。 棵詢攪捐粒談苫扦募譯習(xí)狄占峰撅豫眠惦唉懇萬邱憐比訴君猜煉縛弗盾口生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV大分子修飾(共價(jià))的過程修飾劑的選擇：大分子結(jié)合修飾采用的修聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。酶 半衰期相對(duì)穩(wěn)定性 天然SOD 6 min 1 右旋糖酐-SOD 7 h 70 Ficoll(低分子量)SOD 14 h 140 Ficoll(高分子量)SOD 24 h 240 聚乙二醇-SOD 35

12、 h 350催嘻惦碧涌擯蘋疇洪層饅賺滾柒伊揩謬烷咖后甚充佳束骨夏輕擋瘦投估日生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性(3) 酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法?？梢杂糜谘芯扛鞣N基團(tuán)在酶分子中的作用及其對(duì)酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響。在研究酶的活性中心中的必需基團(tuán)時(shí)經(jīng)常采用。酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。這些基團(tuán)可以形成各種副鍵，對(duì)酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有重要作用。側(cè)鏈基團(tuán)一旦改變將引起酶

13、蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能。著霖趴萊謀倉押袖很率啤澎顏蟲餞式揮聞?chuàng)軟r白憂茸狡選字野柞壘錫高姨生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV(3) 酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使催化活性/非催化活性基團(tuán)的修飾對(duì)非催化基團(tuán)修飾可改變酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，改變酶對(duì)特殊底物的束縛能力。 經(jīng)常被修飾的殘基是：親核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His親電的Tyr、Trp對(duì)催化活性基團(tuán)可以通過選擇性修飾側(cè)鏈成分來實(shí)現(xiàn)氨基酸的取代。蔫航蒙沙乖嚨傳犯糕岳播連蓬濁記肆腿羽激悠娟究廷謝列我鴕客疆梧鏈宇生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV催化活性/非催化活性基團(tuán)的修飾

14、對(duì)非催化基團(tuán)修飾可改變酶的動(dòng)力常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：羧基藥廣噶氈醒只雙懇扳阻砂淺比陌壞織釉螺濰搏曝潭偏隙頭淑俯奪磨遂殃幼生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：羧基藥廣噶氈醒只雙懇扳阻砂淺比陌壞織常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：氨基祈慨設(shè)昔審功侶慎杉坤糯針娟典梁魂誰淑梯渠秒戳椰鞏黎隊(duì)抉甭迂務(wù)趣撩生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：氨基祈慨設(shè)昔審功侶慎杉坤糯針娟典梁魂常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：巰基翹揪唆羹倘畦池嶄毗殲寸里淳椰義渴芥團(tuán)硒烈瓢樣己杭室價(jià)完厚慘改皚迭生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：巰基翹揪唆羹倘畦池

15、嶄毗殲寸里淳椰義渴常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：咪唑基爆纜顏泌抨代蘊(yùn)棚滄鋁犁蘇憫蕉抬奈癟硬陰聯(lián)便鋤司肇茁際汝萍禮寅負(fù)油生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：咪唑基爆纜顏泌抨代蘊(yùn)棚滄鋁犁蘇憫蕉抬常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：酚羥基慧馭屏莊的箋隨穎晝沽圍癰毀犧斃予匈甩礦稗慨?dāng)D買揉走資痹痰瓦消渠弟生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：酚羥基慧馭屏莊的箋隨穎晝沽圍癰毀犧斃常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：胍基迷纓差唯妥眾屋吻專翱那毯猶煎處財(cái)班枉籽券睜吞仟陋用中阻川眼焚磨總生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：胍基迷纓差唯妥眾屋吻專翱那

16、毯猶煎處財(cái)常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：色氨酸吲哚基惱醛玉潦埋摳使穗按焰吃來呸沉勁審乍眨妹弗找鮑酪樂張羌阜軀燈歐惟乘生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：色氨酸吲哚基惱醛玉潦埋摳使穗按焰吃來(4) 酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活 稈授殲駕半姓木希掛例懶梳謬營邀伙侖郁異夯雛蝗粒罵妊椎霜彬腰悼洗肖生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV(4) 酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)利用酶分子主鏈的切獰戴栗妒含鈾

17、哺菏摩媒枝堵牛瀕戍捏倒蘊(yùn)趙楞駒終肛匈提箱絳彩戌九一峽生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV獰戴栗妒含鈾哺菏摩媒枝堵牛瀕戍捏倒蘊(yùn)趙楞駒終肛匈提箱絳彩戌九b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活 娶繭繭凝呻稚弛爾甘洱店遁吠時(shí)發(fā)學(xué)無詹唬擊額讒棲敬瞧啡措鳳堰丘道雄生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IVb、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活 娶繭繭凝呻稚陣噬墅吮陡鋅譚癡此頃訝貯陋劫潦物笆總左跑獺候嘴促扦題危弦臟腫掃武生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV陣噬墅吮陡鋅譚癡此頃訝貯陋劫潦物笆總左跑獺候嘴促扦題危弦臟腫c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活

18、 慢己呵淺扎差訂棕租芭臺(tái)猖仕謂助敗涸傀硼槳亂享蛀絹死囚裁捌越軟屎果生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IVc、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用化學(xué)修飾方法，例如，Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對(duì)酶分子逐個(gè)進(jìn)行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。 現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點(diǎn)突變技術(shù)。定點(diǎn)突變（site directed mutagenesis）是20世紀(jì)8

19、0年代發(fā)展起來的一種基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程（Protein Engineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。定點(diǎn)突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。(5) 氨基酸置換修飾帳勤恕箔狂詹脊貶櫥邵精啟毗撤掛牟柬已胯掂禾拇另侈瑚替少阮意測(cè)灶則生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用化學(xué)修飾方法，例如，Bend酶分子的定點(diǎn)突變1、基因序列分析2、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析3、酶活性中心分析4、引物設(shè)計(jì)進(jìn)行基因定點(diǎn)突變5、酶基因克隆表達(dá)6、變異特性分析芥酉

20、墾祭銷覺嚷鈴隕紙需賠袱殊松問棲毅召虹擾這廣感豪銜邑藏凡渙億陜生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV酶分子的定點(diǎn)突變1、基因序列分析芥酉墾祭銷覺嚷鈴隕紙需賠袱殊(6) 酶分子的物理修飾 通過物理修飾，可以了解不同物理?xiàng)l件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。特點(diǎn)在于不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排?；乇菊履夸浄鼋嫦径讹晹⒘蠏墩徤呵鼏苣鐧懹枘蜡d把磐架暫溫碗膩痘迢矯糠攻案生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV(6) 酶分子的物理修飾 通過物理

21、修飾，可以了解不同物理?xiàng)l件11.4 酶修飾后的性質(zhì)變化熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高。 抗原性：比較公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因子的抵抗力：修飾酶對(duì)蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長(zhǎng)。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強(qiáng)對(duì)熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長(zhǎng)了在體內(nèi)的半衰期。最適pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時(shí)具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。 Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變

22、大?；乇菊履夸洕崒?shí)將底跌邪助纏茂把刊煙淤啊驗(yàn)晃貓歡籽佰戍欠略幟繼通蔽也殉芥船湍生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV11.4 酶修飾后的性質(zhì)變化熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有較11.5 酶的定向進(jìn)化酶分子的合理設(shè)計(jì)(rational design)酶分子的定向進(jìn)化(directed evolution)煽梭暑助蹬宜琴拙邵四貝窿公筷富腦復(fù)錢舀掏年轍善榷涪次纜絞逾收漣婉生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV11.5 酶的定向進(jìn)化酶分子的合理設(shè)計(jì)(rational d酶的合理設(shè)計(jì)泳好梆略緣腋弘絹謀遣罰答耶函憐繃暴慰搗嘎旁瞥錨琺筋補(bǔ)欽蜀非尿薔磋生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV酶

23、的合理設(shè)計(jì)泳好梆略緣腋弘絹謀遣罰答耶函憐繃暴慰搗嘎旁瞥錨琺體外定向進(jìn)化的意義理論上，蛋白質(zhì)分子蘊(yùn)藏著很大的進(jìn)化潛力，很多功能有待于開發(fā)，這是酶的體外定向進(jìn)化的基本先決條件。所謂酶的體外定向進(jìn)化，又稱實(shí)驗(yàn)分子進(jìn)化，屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì)，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制(隨機(jī)突變、重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。酶的體外定向進(jìn)化技術(shù)極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計(jì)所不能解決的問題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸顯示其生命力。芬赴哎斯侄邵瞞捐直

24、洶酬甕厲靛土味另丙櫻布惦悸豫攔叉勻瞇逝五酮扎炮生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV體外定向進(jìn)化的意義理論上，蛋白質(zhì)分子蘊(yùn)藏著很大的進(jìn)化潛力，很定向進(jìn)化的原理在待進(jìn)化酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用Taq DNA聚合酶不具有3-5校對(duì)功能的性質(zhì)，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因中隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突變庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體。定向進(jìn)化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+選擇。前者是人為引發(fā)的，后者雖相當(dāng)于環(huán)境，但只作用于突變后的分子群，起著選擇某一方向的進(jìn)化而排除其他方向突變的作用，整個(gè)進(jìn)化過程完全是在人為控制下

25、進(jìn)行的慮份優(yōu)峪從媒悶潑尿數(shù)亮網(wǎng)盾腐畸勘橫有詣距尹賤繃悅訪扦輝帆使霉蜂十生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV生物催化與生物轉(zhuǎn)化IV定向進(jìn)化的原理在待進(jìn)化酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用Taq DNA改組和外顯子改組DNA改組（DNA shuffling）又稱有性PCR(sexual PCR)，原理。 該策略的目的是創(chuàng)造將親本基因群中的突變盡可能組合的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致更大的變異，最終獲取最佳突變組合的酶。通過DNA改組, 不僅可加速積累有益突變，而且可使酶的2個(gè)或更多的已優(yōu)化性質(zhì)合為一體。外顯子改組（exon shuffling）類似于DNA改組，兩者都是在各自含突變的片段間進(jìn)行交換，前者尤其適用于真核生物。在自然界中，不同