標(biāo)記技術(shù)的原理與應(yīng)用(概論)-10(1)課件

1、標(biāo)記免疫技術(shù)的原理與應(yīng)用臨床免疫學(xué)教研室李會(huì)強(qiáng) 1醫(yī)學(xué)免疫學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)免疫預(yù)防與免疫治療免疫診斷（實(shí)驗(yàn)室診斷）2免疫技術(shù)與臨床醫(yī)學(xué)肥達(dá)氏反應(yīng)用于檢測(cè)傷寒患者血清中抗體，最早血清學(xué)實(shí)驗(yàn)方法；放射免疫分析技術(shù)測(cè)定體內(nèi)微量物質(zhì)含量，推動(dòng)內(nèi)分泌學(xué)科發(fā)展；3標(biāo)記免疫技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)可視為用不同的示蹤物質(zhì)與抗原抗體反應(yīng)結(jié)合的微量檢測(cè)技術(shù)的總稱，它具有較高靈敏度和較高特異性。不僅應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，同時(shí)也為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的發(fā)展作出了巨大的貢獻(xiàn)。5課程安排36學(xué)時(shí)（全部理論課）分析原理臨床應(yīng)用6參考教材臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)（第二版）呂世靜 主編醫(yī)藥科技出版社7本章內(nèi)容基本概念和基礎(chǔ)知識(shí)標(biāo)記免疫技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史標(biāo)記免疫技術(shù)的基

2、本理論標(biāo)記免疫技術(shù)的特點(diǎn)及局限性標(biāo)記免疫技術(shù)的應(yīng)用8基本概念和基礎(chǔ)知識(shí)抗原分子10基本概念和基礎(chǔ)知識(shí)抗原抗體反應(yīng)抗原表位與抗體超變區(qū)空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)奠定分子間的特異性結(jié)合;抗原與抗體間的作用力,使之形成穩(wěn)定免疫復(fù)合物,并呈現(xiàn)一定現(xiàn)象;12基本概念和基礎(chǔ)知識(shí)抗原抗體反應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)抗原分子表面的抗原表位與抗體分子的抗原結(jié)合部位之的空間互補(bǔ)性。14基本概念和基礎(chǔ)知識(shí)抗原抗體反應(yīng)相互作用力氫鍵范德華力靜電引力疏水鍵Fig：抗原抗體間相互作用力15基本概念和基礎(chǔ)知識(shí)抗原抗體反應(yīng)反應(yīng)特點(diǎn)特異性可逆性比例性16基本概念和基礎(chǔ)知識(shí)抗原抗體反應(yīng)反應(yīng)特點(diǎn)特異性可逆性比例性17免疫親和層析純化蛋白質(zhì)18基本概念和基礎(chǔ)知識(shí)

3、標(biāo)記免疫技術(shù)將抗原或抗體用示蹤物質(zhì)（同位素、熒光素）進(jìn)行標(biāo)記，形成標(biāo)記抗原或標(biāo)記抗體。用已知的標(biāo)記物與待測(cè)的抗原或抗體反應(yīng)，反應(yīng)形成的復(fù)合物后，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中的標(biāo)記物，對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。20基本概念和基礎(chǔ)知識(shí)標(biāo)記免疫技術(shù)熒光標(biāo)記免疫技術(shù)同位素標(biāo)記免疫技術(shù)酶標(biāo)記免疫技術(shù)膠體金標(biāo)記免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)21基本概念和基礎(chǔ)知識(shí)標(biāo)記免疫技術(shù)的地位標(biāo)記免疫技術(shù)應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)，已廣泛的應(yīng)用于生物活性物質(zhì)、激素、維生素、藥物、微生物檢測(cè)的主要方法。其在免疫學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、病原體檢測(cè)、腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)等方面占有重要的地位。 23本章內(nèi)容基本概念和基礎(chǔ)知識(shí)標(biāo)記免疫技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史標(biāo)記免疫技術(shù)的基本理論標(biāo)

4、記免疫技術(shù)的特點(diǎn)及局限性標(biāo)記免疫技術(shù)的應(yīng)用24發(fā)展簡(jiǎn)史1959年Yalow和Berson完成胰島素的放射免疫分析，并創(chuàng)立放射免疫分析方法；Rosalyn YalowThe Nobel Prize in Physiology or Medicine 26發(fā)展簡(jiǎn)史1960年Ekins創(chuàng)立甲狀腺素競(jìng)爭(zhēng)性蛋白結(jié)合分析法。其后，Ekins對(duì)標(biāo)記免疫分析的諸多理論，如標(biāo)記免疫分析的劑量反應(yīng)曲線的數(shù)學(xué)模型、數(shù)據(jù)處理、靈敏度以及試驗(yàn)設(shè)計(jì)等均有重要的貢獻(xiàn)；27發(fā)展簡(jiǎn)史1963年Hunter和Green Wood建立了氯氨T碘標(biāo)記法；1967年Catt建立固相放射免疫分析法；1968年Mile和Hale創(chuàng)立免疫放

5、射分析法 ( immunoradiometric assay，IRMA )；28發(fā)展簡(jiǎn)史1971年Engvall和van Weeman建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）；1973年Rubenstein建立均相酶免疫分析法；1974年Rodbard建立RIA和IRMA數(shù)據(jù)處理的數(shù)學(xué)模型；30發(fā)展簡(jiǎn)史1975年Kohler和Milstein建立了用雜交瘤制備單克隆抗體的方法。1980年單克隆抗體正式引入放射免疫分析和酶免疫分析中，為非競(jìng)爭(zhēng)性標(biāo)記免疫分析的發(fā)展提供了必要的條件。31發(fā)展簡(jiǎn)史1976年Schroeder建立生物發(fā)光免疫分析法；1977年Greenwood建立Digoxin的RIA全自

6、動(dòng)分析方法，其中用磁顆粒分離方法為以后全自動(dòng)化的時(shí)間分辨熒光免疫分析和化學(xué)發(fā)光免疫分析所引用；32發(fā)展簡(jiǎn)史 1978年Halman建立化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay,CLIA）； 1981年Ngot建立均相底物標(biāo)記熒光免疫分析法； 33發(fā)展簡(jiǎn)史1982年Meurman建立時(shí)間分辨熒光免疫分析法（time-resolved fluorescence immunoassay,TR-FIA）；1986年Octell將親和素-生物素系統(tǒng)（ABS）引入IRMA技術(shù)中； 34發(fā)展簡(jiǎn)史1991年Ekins建立抗體微點(diǎn)免疫分析（micro-point immun

7、oassay），現(xiàn)稱為微陣列免疫分析（micro-array immunoassay）； 35本章內(nèi)容基本概念和基礎(chǔ)知識(shí)標(biāo)記免疫技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史標(biāo)記免疫技術(shù)的基本理論標(biāo)記免疫技術(shù)的特點(diǎn)及局限性標(biāo)記免疫技術(shù)的應(yīng)用36基本理論抗體占位原則當(dāng)探測(cè)抗體（又稱傳感器抗體），進(jìn)入含分析物的溶液時(shí)，被分析物占據(jù)結(jié)合位點(diǎn)，其結(jié)合反應(yīng)在某種意義上受平衡常數(shù)的控制。最終游離分析物的濃度取決于總抗體濃度和總分析物濃度。 37基本理論抗體占位原則質(zhì)量作用定律： AgAb / fAb = K fAg 如按抗體結(jié)合位點(diǎn)的部分占有率，則表示為: AgAb / Ab = K f Ag / （1 + K fAg ）38基本理論競(jìng)爭(zhēng)

8、性分析與非競(jìng)爭(zhēng)性分析所有的標(biāo)記免疫分析都依賴于測(cè)量抗原-抗體反應(yīng)后，分析物與抗體結(jié)合的部分占有率（fractional occupancy）。根據(jù)測(cè)量的部分不同，可將標(biāo)記免疫分析分為競(jìng)爭(zhēng)性分析和非競(jìng)爭(zhēng)性分析兩大類。 39基本理論競(jìng)爭(zhēng)性分析與非競(jìng)爭(zhēng)性分析凡基于測(cè)量非分析物占有的抗體結(jié)合位點(diǎn)的技術(shù)（測(cè)量游離的標(biāo)記物，主要是標(biāo)記抗原），稱為競(jìng)爭(zhēng)性分析。凡基于直接測(cè)量由分析物占有的抗體結(jié)合位點(diǎn)的技術(shù)，稱為非競(jìng)爭(zhēng)性分析。 40基本理論競(jìng)爭(zhēng)性分析如果標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原對(duì)同一抗體有相同的親和力，則二者在同一反應(yīng)系統(tǒng)中就會(huì)與特異性抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。41基本理論競(jìng)爭(zhēng)性分析將標(biāo)記抗原和待測(cè)抗原置于同一反應(yīng)體系

9、中與定量抗體發(fā)生反應(yīng)，則二者會(huì)與特異性抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。42基本理論競(jìng)爭(zhēng)性分析 43基本理論競(jìng)爭(zhēng)性分析 44基本理論競(jìng)爭(zhēng)性分析劑量反應(yīng)曲線45基本理論非競(jìng)爭(zhēng)性分析通常將抗體進(jìn)行標(biāo)記，制備成標(biāo)記抗體；過(guò)量的標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原反應(yīng)。46基本理論非競(jìng)爭(zhēng)性分析 47免疫分析技術(shù)均相免疫分析非均相免疫分析48均相免疫分析ANALYTE“AcceptorbeadANALYTE“AcceptorbeadDonorbeadAcceptorbeadAcceptorbeadDonorbead PROTOCOLDay 1 Coat Beads with ab (o/n)Day 2Add SamplesAdd Ac

10、ceptor BeadsIncubate Add Donor Beads Incubate Read49均相免疫分析50非均相免疫分析51本章內(nèi)容基本概念和基礎(chǔ)知識(shí)標(biāo)記免疫技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史標(biāo)記免疫技術(shù)的基本理論標(biāo)記免疫技術(shù)的特點(diǎn)及局限性標(biāo)記免疫技術(shù)的應(yīng)用52特點(diǎn)及局限性特點(diǎn)高特異性：標(biāo)記免疫分析是利用抗原抗體反應(yīng)測(cè)定樣品中待測(cè)物質(zhì)的濃度，因而具有較高的特異性。標(biāo)記免疫分析方法的特異性取決于抗體的特異性。因此，抗體質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)測(cè)定結(jié)果有很大的影響。 53特點(diǎn)及局限性特點(diǎn)高特異性54特點(diǎn)及局限性特點(diǎn)高敏感性標(biāo)記物質(zhì)的高敏感性賦予標(biāo)記免疫分析的高度敏感性，放光免疫分析已達(dá)皮克(pg)水平。55特點(diǎn)及局限

11、性特點(diǎn)操作簡(jiǎn)便、快速；自動(dòng)化分析；56特點(diǎn)及局限性局限性不能檢測(cè)分析物的生物活性標(biāo)記免疫分析所測(cè)定的是被測(cè)物質(zhì)的免疫學(xué)活性，而不是其生物學(xué)活性。雖然在一般情況下被測(cè)物質(zhì)的免疫活性與生物活性是相關(guān)的，但在某些生理或病理的情況下二者并不一定相關(guān)，對(duì)此應(yīng)有充分的理解。57特點(diǎn)及局限性局限性只能分析一定濃度范圍的分析物抗原抗體發(fā)應(yīng)具有比例性，二者在一定濃度范圍內(nèi)才出現(xiàn)最強(qiáng)反應(yīng)，檢測(cè)信號(hào)與分析物存在一定計(jì)量關(guān)系。因此，標(biāo)記免疫分析只適用于測(cè)定一定濃度范圍的物質(zhì)。58特點(diǎn)及局限性局限性難于標(biāo)準(zhǔn)化，一定程度上影響它的應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)室之間的質(zhì)量控制；抗原的純化與標(biāo)準(zhǔn)化；抗體的異質(zhì)性與標(biāo)準(zhǔn)化；反應(yīng)體系中的基質(zhì)效應(yīng)59本章內(nèi)容基