微生物第6章微生物的遺傳變異和育種 (1)課件

1、第 六 章 微生物的遺傳變異和育種遺傳：親代與子代相似變異：親代與子代、子代間不同個(gè)體不完全相同遺傳和變異variation是生命的最本質(zhì)特性之一遺傳型：表型：生物的全部遺傳因子所攜帶的遺傳信息具有一定遺傳型的個(gè)體，在特定環(huán)境條件下通過生長(zhǎng)發(fā)育所表現(xiàn)出來的外表特征和內(nèi)在特征的總和。表型是由遺傳型所決定，但也和環(huán)境有關(guān)。微生物的遺傳變異和育種幾個(gè)相關(guān)概念表型飾變：表型的差異只與環(huán)境有關(guān)特點(diǎn)：暫時(shí)性、不可遺傳性、表現(xiàn)為全部個(gè)體的行為遺傳型變異（基因變異、基因突變）：遺傳物質(zhì)改變，導(dǎo)致表型改變特點(diǎn)：遺傳性、群體中極少數(shù)個(gè)體的行為（自發(fā)突變頻率通常為10-6-10-9）Production of a

2、red pigment (prodigiosin) by Serratia marcescens. From left to right: slant culture grown at 25C, slant culture grown at 37C, broth culture grown at 25C, broth culture grown at 37C.微生物的遺傳變異和育種幾個(gè)相關(guān)概念第一節(jié) 遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)一、三個(gè)證明DNA是遺傳物質(zhì)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)1、經(jīng)典轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)肺炎鏈球菌：S型（菌體具莢膜，菌落表面光滑，有致病能力） R型（菌體無莢膜，菌落表面粗糙，無致病能力）微生物的遺傳變異和育種

3、1928年，F(xiàn).Griffth作了3組實(shí)驗(yàn):微生物的遺傳變異和育種2、噬菌體感染實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)證明，進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)是DNA。DNA包含有產(chǎn)生完整噬菌體的全部信息。微生物的遺傳變異和育種3、植物病毒重建實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)證明，遺傳信息的流向與DNA的傳遞是一致的。微生物的遺傳變異和育種真核微生物：細(xì)胞核原核微生物：核區(qū)細(xì)胞核或核區(qū)的數(shù)目在不同的微生物中是不同的微生物的遺傳變異和育種1、細(xì)胞水平真核生物 細(xì)胞核 核染色體原核生物 核區(qū) DNA鏈核基因組在核基因組之外，還存在各種形式的核外遺傳物質(zhì)微生物的遺傳變異和育種2、細(xì)胞核水平染色體是由組蛋白與DNA構(gòu)成的線狀結(jié)構(gòu)染色體的數(shù)目在不同的生物中是不同的染色

4、體的倍數(shù)在同一生物的不同生活時(shí)期是不同的微生物的遺傳變異和育種3、染色體水平5、基因水平微生物的遺傳變異和育種6、密碼子水平微生物的遺傳變異和育種（二）原核生物的質(zhì)粒1、定義質(zhì)粒（plasmid）：一種獨(dú)立于染色體外，能進(jìn)行自主復(fù)制的細(xì)胞質(zhì)遺傳因子，主要存在于各種微生物細(xì)胞中。質(zhì)粒所含的基因?qū)λ拗骷?xì)胞一般是非必需的；在某些特殊條件下，質(zhì)粒有時(shí)能賦予宿主細(xì)胞以特殊的機(jī)能，從而使宿主得到生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。微生物的遺傳變異和育種通常以共價(jià)閉合環(huán)狀(covalently closed circle，簡(jiǎn)稱CCC)的超螺旋雙鏈DNA分子存在于細(xì)胞中；也發(fā)現(xiàn)有線型雙鏈DNA質(zhì)粒和RNA質(zhì)粒；質(zhì)粒分子的大小范圍從1k

5、b左右到1000kb； 細(xì)菌質(zhì)粒多 在10kb以內(nèi)）微生物的遺傳變異和育種2、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（二）原核生物的質(zhì)粒3、質(zhì)粒的類型嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒(stringent plasmid)：復(fù)制行為與核染色體的復(fù)制同步，低拷貝數(shù)松弛型質(zhì)粒(relaxed plasmid)：復(fù)制行為與核染色體的復(fù)制不同步，高拷貝數(shù)窄宿主范圍質(zhì)粒(narrow host range plasmid)（只能在一種特定的宿主細(xì)胞中復(fù)制）廣宿主范圍質(zhì)粒(broad host range plasmid)（可以在許多種細(xì)菌中復(fù)制）微生物的遺傳變異和育種（二）原核生物的質(zhì)粒質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)：（1）體積小，易分離和操作（2）環(huán)狀，穩(wěn)定（3）獨(dú)立復(fù)制（

6、4）拷貝數(shù)多（5）存在標(biāo)記位點(diǎn)，易篩選微生物的遺傳變異和育種4、質(zhì)粒在基因工程中的應(yīng)用（二）原核生物的質(zhì)粒5、質(zhì)粒的檢測(cè) 提取所有胞內(nèi)DNA后電鏡觀察； 超速離心或瓊脂糖凝膠電泳后觀察； 對(duì)于實(shí)驗(yàn)室常用菌，可用質(zhì)粒所帶的某些特點(diǎn)， 如抗藥性初步判斷。微生物的遺傳變異和育種（二）原核生物的質(zhì)粒6、質(zhì)粒的主要種類按照質(zhì)粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應(yīng)分致育因子（Fertility factor，F(xiàn)因子）抗性因子（Resistance factor，R因子）產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒（Bacteriocin production plasmid）毒性質(zhì)粒（virulence plasmid）代謝質(zhì)粒（Meta

7、bolic plasmid）隱秘質(zhì)粒（cryptic plasmid）微生物的遺傳變異和育種（二）原核生物的質(zhì)粒（2）抗性因子（Resistance factor，R因子）包括抗藥性和抗重金屬二大類，簡(jiǎn)稱R質(zhì)粒?？剐再|(zhì)粒在細(xì)菌間的傳遞是細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。R質(zhì)?？剐赞D(zhuǎn)移因子（RTF）：轉(zhuǎn)移和復(fù)制基因抗性決定因子：抗性基因微生物的遺傳變異和育種（3）產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒（Bacteriocin production plasmid）微生物的遺傳變異和育種細(xì)菌素抗生素抑制或殺死近緣，甚至同種不同株的細(xì)菌較廣的抗菌譜通過核糖體直接合成的多肽類物質(zhì)一般是次級(jí)代謝產(chǎn)物編碼細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)基因及相關(guān)的基因

8、一般位于質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子上一般無直接的結(jié)構(gòu)基因，相關(guān)酶的基因多在染色體上（5）代謝質(zhì)粒（Metabolic plasmid）質(zhì)粒上攜帶有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基質(zhì)的酶，進(jìn)行共生固氮，或產(chǎn)生抗生素（某些放線菌）等。將復(fù)雜的有機(jī)化合物降解成能被其作為碳源和能源利用的簡(jiǎn)單形式，環(huán)境保護(hù)方面具有重要的意義。降解質(zhì)粒：微生物的遺傳變異和育種假單胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、農(nóng)藥(2,4dichlorophenoxyacetic acid)、辛烷和樟腦等的能力。微生物的遺傳變異和育種（6）隱秘質(zhì)粒（cryptic plasmid） 隱秘質(zhì)粒不顯示任何表型效應(yīng)，它們的存在只有

9、通過物理的方法，例如用凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞抽提液等方法才能發(fā)現(xiàn)。 它們存在的生物學(xué)意義，目前幾乎不了解。在應(yīng)用上，很多隱秘質(zhì)粒被加以改造作為基因工程的載體（一般加上抗性基因）微生物的遺傳變異和育種第二節(jié) 基因突變和誘變育種一、基因突變 遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳變化，可自發(fā)或誘導(dǎo)產(chǎn)生?；蛲蛔儶M義：點(diǎn)突變（基因突變）廣義：基因突變和染色體畸變野生型（原始性狀）基因突變突變型（新性狀）（一）突變類型微生物的遺傳變異和育種（二）突變率 每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率（三）基因突變的特點(diǎn) 1、自發(fā)性 2、不對(duì)應(yīng)性 3、稀有性 4、獨(dú)立性 5、可誘變性 6、穩(wěn)定性 7、可逆性微生物的遺傳變

10、異和育種（四）基因突變自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性的實(shí)驗(yàn)證明三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)變量實(shí)驗(yàn)涂布實(shí)驗(yàn)影印實(shí)驗(yàn)證明突變是自發(fā)產(chǎn)生的，并且突變的性狀與引起突變的原因間無直接對(duì)應(yīng)關(guān)系。微生物的遺傳變異和育種變量實(shí)驗(yàn)（fluctuation analysis）Salvador Luria and Max Delbruck（1943）Salvador LuriaMax DelbruckThe Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969微生物的遺傳變異和育種（四）基因突變自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性的實(shí)驗(yàn)證明變量實(shí)驗(yàn)（fluctuation analysis）微生物的遺傳變異和育種Newcombe的

11、涂布實(shí)驗(yàn)（1949）微生物的遺傳變異和育種影印實(shí)驗(yàn)Joshua Lederberg微生物的遺傳變異和育種Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）微生物的遺傳變異和育種（五）基因突變及其機(jī)制微生物的遺傳變異和育種1、誘發(fā)突變：物理、化學(xué)和生物的因素，提高突 變率的人為的作法（1）堿基的置換 （2）移碼突變：添加或缺失核苷酸，引起閱讀錯(cuò)誤 （3）染色體畸變：缺失、重復(fù)、插入、易位、倒位2、自發(fā)突變：無人為因素下的低頻率突變?cè)颍?）背景輻射（2）有害產(chǎn)物積累（3）堿基錯(cuò)配（六）紫外線對(duì)DNA的損傷及其修復(fù)嘧啶嘧啶二聚體UV1、光復(fù)活作用嘧啶二聚體嘧啶光

12、解酶微生物的遺傳變異和育種2、切除修復(fù)（一）自發(fā)突變與育種： 選育 定向培育（二）誘變育種1、誘變育種的基本環(huán)節(jié)微生物的遺傳變異和育種二、突變與育種2、誘變育種的原則誘變劑物理因素化學(xué)因素紫外線激光離子束X射線r射線快中子烷化劑堿基類似物吖啶化合物微生物的遺傳變異和育種（1）使用簡(jiǎn)便有效的誘變劑利用細(xì)菌模型了解潛在化學(xué)致癌物誘變作用的方法“生物化學(xué)統(tǒng)一性”法則：人和細(xì)菌在DNA的結(jié)構(gòu)及特性方面是一致的，能使微生物發(fā)生突變的誘變劑必然也會(huì)作用于人的DNA，使其發(fā)生突變，最后造成癌變或其他不良的后果。誘變劑的共性原則：化學(xué)藥劑對(duì)細(xì)菌的誘變率與其對(duì)動(dòng)物的致癌性成正比超過95%的致癌物質(zhì)對(duì)微生物有誘變

13、作用90%以上的非致癌物質(zhì)對(duì)微生物沒有誘變作用 微生物的遺傳變異和育種Ames試驗(yàn)介紹美國(guó)加利福尼亞大學(xué)的Bruce Ames教授于1966年發(fā)明，因此稱為Ames試驗(yàn)具體操作：檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhmurium)組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株(his-)的回復(fù)突變率。微生物的遺傳變異和育種Ames試驗(yàn)介紹微生物的遺傳變異和育種Ames試驗(yàn)介紹證明Ames試驗(yàn)重要性的應(yīng)用實(shí)例：國(guó)外曾開發(fā)了一種降低婦女妊娠反應(yīng)的藥物“反應(yīng)?！保捎谄渌幮э@著，在60-70年代十分流行，但隨后人們就發(fā)現(xiàn)畸形兒的出生率明顯增高，而且生產(chǎn)畸形兒的婦女大多曾服用“反應(yīng)?！?，后來采用Ames試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種

14、物質(zhì)的確具有很強(qiáng)的致突變作用，因此這種藥物被禁止使用但如果能在這種藥物上市之前就進(jìn)行Ames試驗(yàn)檢測(cè)，那么這種大量出生畸形兒的悲劇完全可以避免，微生物的遺傳變異和育種Ames試驗(yàn)介紹（2）選用優(yōu)良的出發(fā)菌株（3）處理單細(xì)胞或單孢子懸浮液（4）使用最佳誘變劑量 劑量 = 強(qiáng)度（濃度） 作用時(shí)間 相對(duì)劑量 = 殺菌率（5）利用協(xié)同效應(yīng)（6）尋找和利用形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)（7）設(shè)計(jì)高效率篩選方案（8）根據(jù)具體情況創(chuàng)造新型篩選方案微生物的遺傳變異和育種3、突變株的篩選：（1）產(chǎn)量突變株的篩選 （2）抗藥性突變株的篩選 （3）營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選突變株的篩選方法誘變檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型淘汰野生型鑒定

15、營(yíng)養(yǎng)缺陷型富集培養(yǎng)（抗生素法）（菌絲過濾法）夾層培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法逐個(gè)檢出法影印平板法生長(zhǎng)譜法微生物的遺傳變異和育種第三節(jié) 基因重組和雜交育種一、原核生物的基因重組（一）轉(zhuǎn)化供體菌受體菌DNA片段1928年，Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象,目前已知有二十多個(gè)種的細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，需要二方面必要的條件微生物的遺傳變異和育種感受態(tài)細(xì)胞：具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞 自然感受態(tài)的出現(xiàn)是細(xì)胞一定生長(zhǎng)階段的生理特性，受細(xì)菌自身的基因控制； 人工感受態(tài)則是通過人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有攝取DNA的能力，或人為地將DNA導(dǎo)入細(xì)

16、胞內(nèi)微生物的遺傳變異和育種1、建立了感受態(tài)的受體細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化2、外源游離DNA分子（轉(zhuǎn)化因子）轉(zhuǎn)化過程（革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化模型）微生物的遺傳變異和育種噬菌體DNA被感受態(tài)細(xì)胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆粒轉(zhuǎn)染(transfection)：轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)：提純的噬菌體DNA以轉(zhuǎn)化的（而非感染）途徑進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)后產(chǎn)生完整的病毒顆粒。轉(zhuǎn)化過程的特點(diǎn)：a）對(duì)核酸酶敏感；b）不需要活的DNA供體細(xì)胞；c）轉(zhuǎn)化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的高低主要取決于轉(zhuǎn)化供體菌株和轉(zhuǎn)化受體菌株之間的親源關(guān)系； d）通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率要低得多微生物的遺傳變異和育種（一）轉(zhuǎn)化人工轉(zhuǎn)化用CaCl2處理細(xì)胞，電穿孔等是常用的人工轉(zhuǎn)

17、化手段。在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項(xiàng)細(xì)菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。不是由細(xì)菌自身的基因所控制；用多種不同的技術(shù)處理受體細(xì)胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”。微生物的遺傳變異和育種（二）細(xì)菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）由噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行遺傳交換的一種方式 一個(gè)細(xì)胞的DNA通過病毒載體的感染轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞中細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的類型：普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)與普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要區(qū)別溶源轉(zhuǎn)變微生物的遺傳變異和育種（三）接合(conjugation)通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程1946年

18、，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm細(xì)菌的多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型雜交實(shí)驗(yàn)中間平板上長(zhǎng)出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致。微生物的遺傳變異和育種F因子的四種細(xì)胞形式 a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收F因子而變成F+菌株；b）F+菌株(“雄性”菌株)， F因子獨(dú)立存在，細(xì)胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F(xiàn)因子插入到染色體DNA上，細(xì)胞表面有性菌毛。d）F菌株，Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F因 子。 細(xì)胞表面同樣有性菌毛。微生物的遺傳變異和育種1）

19、F+F-雜交理化因子的處理可將F因子消除而使F+菌株變成F-菌株F+菌株的F因子向F-細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但含F(xiàn)因子的宿主細(xì)胞的染色體DNA一般不被轉(zhuǎn)移。a）F+細(xì)菌通過性毛與F-細(xì)菌接觸并發(fā)生相互作用；b）F+細(xì)菌的F因子出現(xiàn)缺口，雙鏈之一被切斷，從斷端轉(zhuǎn)移F因子的一條鏈到F-細(xì)菌中。 c）F因子的一條鏈一進(jìn)入F-細(xì)菌中，就在F-細(xì)菌中復(fù)制新的 F因子。d）復(fù)制完成后， F-細(xì)菌變成F+ ，同時(shí)原有F+細(xì)胞也完成F因子另一條鏈的復(fù)制，所以轉(zhuǎn)移是F+的拷貝。所以最終雜交的結(jié)果是F-細(xì)菌變成F+細(xì)菌，而原有的F+細(xì)菌則不變。微生物的遺傳變異和育種Hfr菌株的F因子插入到染色體DNA上，因此只要發(fā)生接合轉(zhuǎn)移

20、轉(zhuǎn)移過程，就可以把部分甚至全部細(xì)菌染色體傳遞給F-細(xì)胞并發(fā)生重組，由此而得名為高頻重組菌株。2）Hfr F-雜交Hfr菌株仍然保持著F+細(xì)胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一樣與F-細(xì)胞進(jìn)行接合。所不同的是，當(dāng)OriT序列被缺刻螺旋酶識(shí)別而產(chǎn)生缺口后，F(xiàn)因子的先導(dǎo)區(qū)(leading region)結(jié)合著染色體DNA向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移。F因子除先導(dǎo)區(qū)以外，其余絕大部分是處于轉(zhuǎn)移染色體的末端，由于轉(zhuǎn)移過程常被中斷，因此F因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中。HfrF-雜交后的受體細(xì)胞(或接合子)大多數(shù)仍然是F-。微生物的遺傳變異和育種3）FF-雜交Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)，形成游離的但攜帶一小段

21、染色體基因的F因子，特稱為F因子。FF-與F+F-的不同：供體的部分染色體基因隨F一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞a）與染色體發(fā)生重組；b）繼續(xù)存在于F因子上，形成一種部分二倍體；細(xì)胞基因的這種轉(zhuǎn)移過程又常稱為性導(dǎo)（sexduction）、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)（F-duction），或F因子媒介的轉(zhuǎn)導(dǎo)（F-mediated transduction）。微生物的遺傳變異和育種（四）原生質(zhì)體融合微生物的遺傳變異和育種二、真核微生物的基因重組細(xì)胞（ ）細(xì)胞（）有性接合 染色體重組 新遺傳型能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以進(jìn)行有性雜交微生物的遺傳變異和育種（一）有性雜交（二）準(zhǔn)性雜交細(xì)胞（ ）細(xì)胞（）準(zhǔn)性接合 基因重組 新遺傳型菌絲聯(lián)結(jié) 質(zhì)配 核配 有絲分裂交換 單倍體雜合子在半知菌類中最為常見半知菌的準(zhǔn)性生殖微生物的遺傳變異和育種第四節(jié) 基因工程特點(diǎn)：可設(shè)計(jì)性、穩(wěn)定性、遠(yuǎn)緣性、風(fēng)險(xiǎn)性一、基因工程定義：在基因水平上，改造遺傳物質(zhì)，從而使物種發(fā)生變異，創(chuàng)建出具有某種穩(wěn)定新性狀的生物新品系。微生物的遺傳變異和育種獲得目的基因選擇基因載體體外重組外源基因?qū)耄?xì)菌、植物、動(dòng)物）篩選和鑒定應(yīng)用二、基因工程的基本操作微生物的遺傳變異和育種第五節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯和保藏性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學(xué)工作最重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研都無法正常進(jìn)行。影響微生物菌種穩(wěn)定性的因素：a）變異；b）污染； c）死亡。微生物的遺