因工程制藥工藝

1、關(guān)于因工程制藥工藝第1頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四第六章 基因工程制藥工藝6.1 基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)6.2 基因工程大腸桿菌的構(gòu)建6.3 基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制第2頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四基因工程技術(shù)基因重組示意圖DNA片段經(jīng)酶切、連接，形成重組DNA分子導(dǎo)入宿主細胞系統(tǒng)中擴增目標基因表達，生成新產(chǎn)物，出現(xiàn)新性狀第3頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四6.2 基因工程大腸桿菌的構(gòu)建技術(shù)6.2.1 構(gòu)建流程6.2.2 目標基因的克隆6.2.3 表達載體構(gòu)建6.2.4 工程菌構(gòu)建第4頁，共61頁，2022年

2、，5月20日，7點45分，星期四6.2.1 工程菌構(gòu)建流程目標基因克隆PCR、文庫，化學(xué)合成表達載體構(gòu)建酶切、連接遺傳轉(zhuǎn)化與篩選外源基因?qū)肱c培養(yǎng)工程菌新性狀、功能、物質(zhì)工作內(nèi)容方法第5頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四6.2.2 目標基因的克隆策略目標基因：編碼蛋白質(zhì)或多肽的DNA序列正確克隆的重要性： 只要有一個堿基發(fā)生（錯義、無義、移碼）突變，就導(dǎo)致編碼氨基酸的變化，影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的功能和生物學(xué)活性。 只要一個堿基發(fā)生同義突變，就可能導(dǎo)致生產(chǎn)過程和效率變化。第6頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四基因克隆方法的選擇方法優(yōu)點缺點PCR擴增簡便快速，

3、高效，數(shù)kb，單基因克隆DNA聚合酶活性和保真性限制文庫篩選長片段，無堿基錯誤，未知序列基因克隆繁瑣，過程復(fù)雜，耗時，昂貴化學(xué)合成簡便，準確，已知序列，引物合成受合成儀器性能限制，長度很短第7頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四PCR技術(shù)PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應(yīng)）：由DNA聚合酶催化下，對特定DNA序列進行的復(fù)制反應(yīng)。本質(zhì)：生物體的DNA復(fù)制原理在體外合成基因。發(fā)明者：Mullis，生物技術(shù)革命性象征，1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎。第8頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四在引物指導(dǎo)下，以DNA為模板，由DN

4、A聚合酶催化的擴增特定DNA序列聚合延伸形成互補序列的反應(yīng)。3AGCGAGGCATCG55TCGCTCCGTAGC3第9頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四PCR單反應(yīng)原理與過程(1)變性（94）(2)退火（55）(4)完成一個循環(huán)(3)延伸（72）第10頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四PCR擴增的反應(yīng)體系組成成分濃度用量作用緩沖液10 x5 ul提供反應(yīng)環(huán)境dNTPs20 mmol/L1 ul反應(yīng)的底物正向引物20 umol/L2.5 ul擴增的起始點反向引物20 umol/L2.5 ul擴增的終止點DNA聚合酶1-5 U/ul1-2 U催化，熱穩(wěn)

5、定性MgCl21.5-5.0 mmol/L1 ulMg2+是輔酶模板DNA5-10 ul含目標基因序列H2O27-33 ul稀釋總體積50 ul第11頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四PCR擴增產(chǎn)物電泳PCR儀水平電泳槽凝膠電泳第12頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四6.2.2 RT-PCR克隆目的基因流程提取RNA轉(zhuǎn) cDNA設(shè)計合成引物基因片段的3/5末端擴增RT-PCR擴增全長基因基因片段擴增第13頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四6.2.2 RT-PCR克隆目的基因流程第14頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45

6、分，星期四1 提取RNA從表達基因的組織中提取總RNA，或mRNA可以用RNA提取kit, Unizol, Trizol大量提取時可以用傳統(tǒng)的一步法提取-Unizol 或 Trizol 是總RNA提取試劑，在配制過程中加入了異硫氫酸胍，能夠在組織勻漿過程中迅速滅活RNA酶，保持RNA的完整性。第15頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四總RNA提取操作步驟 ：1、細胞或組織加Trizol后，室溫放置5 min，使其充分裂解。注：此時可放入-70長期保持。 2、12,000 rpm 離心5 min，棄沉淀。 3、按200 l氯仿/ml Trizol加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置1

7、5 min。注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。 4、4 12,000 g離心15 min。 5、吸取上層水相，至另一離心管中。注：千萬不要吸取中間界面；若同時提取DNA和蛋白質(zhì)，則保留下層酚相存于4冰箱，若只提RNA，則棄下層酚相。 第16頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四6、按0.5 ml異丙醇/ml Trizol 加入異丙醇混勻，室溫放置510 min。 7、4 12,000 g離心10 min，棄上清，RNA沉于管底。 8、按1 ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。 9、 4 8,000g離心5 min，盡量棄上清。

8、 10、室溫晾干或真空干燥510 min。 注：RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。 11、可用50 l H2O，TE buffer溶解RNA樣品，5560,510min。注：H2O、TE須用DEPC處理并高壓。 第17頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四RNA提取注意事項嚴格防止RNA酶污染1. 佩戴一次性手套 2. 玻璃器皿可以在250烘箱中烘烤3小時 3. 槍頭、Eppendorf管用0.1%DEPC（攪拌攪勻）水中浸泡。通風櫥中室溫過夜，扣去液體，高壓滅菌30分鐘。 DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)為劇毒物，活性很強，小心在通風柜中

9、使用。4. DEPC處理的水：0.1%DEPC處理，高壓滅菌30分鐘脫毒5. 防止環(huán)境中RNA酶污染第18頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四2. 轉(zhuǎn)cDNA（防RNA酶）逆轉(zhuǎn)錄: 將mRNA轉(zhuǎn)錄成為cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA 的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶) 禽類成髓細胞病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶 鼠白血病病毒(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶, 降解RNA DNA雜交體中的RNA 的能力較弱, 對熱的穩(wěn)定性較AMV反轉(zhuǎn)錄酶差cDNA合成: 1. 總RNA 2. 底物，dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP 3. 引物,起始DNA的合成, oligo(dT) 4. 逆轉(zhuǎn)錄酶

10、5. DEPC處理水 溫浴 ，按試劑盒說明書。 第19頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四3. 引物設(shè)計特異性引物設(shè)計Specific primer簡并引物設(shè)計Degenerated primer嵌套引物Nested Primer第20頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四1）長度1530 bp2）AT:GC 約50%， 兩引物Tm值接近，5588之間。退火溫度 Tm (4GC2AT)53）引物3末端以G/C結(jié)尾較好4）不形成引物二聚體5）特異性, 作BLAST搜索6）簡并引物：保守序列；簡并度低；具單一密碼子 的氨基酸放在3 端7）逆向引物要用互補序列引

11、物設(shè)計原則第21頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四 1）特異性引物設(shè)計基因序列已知時, 可以設(shè)計特異性引物特異性引物：有準確的堿基序列第22頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四第23頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四第24頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四 F：XXXF，5- XXXXXX atggccgcttcgcgtgcaacg-3 atggccgctt cgcgtgcaac gtttgttgcg ctcgtgtgcg ctctcgcgct cgccgccgcc gatgtgcaga atccgctcag

12、 tgacgatttc atcaatctca tcaacacaaa gcaaaactct aacgaagtca gggaccaggg atcttgtggt agctgctggg gttcggtgc tgtggaggcc atgaccgacc ggtactgtac atactccaat ggaactcaac acttccattt ctccgctga tcagcggagaaatggaagtgt-3R：XXXR，5- XXXXXX第25頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四2） 根據(jù)蛋白質(zhì)同源序列設(shè)計簡并引物DNAMAN當基因序列未知時,利用軟件進行同源比對,設(shè)計間并引物第26頁，

13、共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四第27頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四用DNAMAN進行同源比對,設(shè)計引物將蛋白質(zhì)序列保存為seq文件格式比對、系統(tǒng)樹拷貝、保存第28頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四4. RT-PCR 擴增目的基因cDNA模板RNA/mRNAPCR擴增目的基因cDNAPrimer FPrimer R第29頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四PCR循環(huán)94 C 294 C 3055 C 4572 C 172 C 10 25 l volume10 X buffer(含MgCl2)，2.5 l 2

14、.5 mM dNTP， 2 lTemplate cDNA， 1 lForward Primer， 1 l Reverse Primer ， 1 lDistilled Water，17.375 l Taq 酶， 0.125 l 35第30頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四6.2.3 酶切、連接、轉(zhuǎn)化、篩選1.酶切反應(yīng)概念：在特異位點上催化雙鏈DNA分子的斷裂，產(chǎn)生相應(yīng)的限制性片段。5突出端3突出端平末端第31頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四分析基因的限制性內(nèi)切酶譜，確定插入質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶位點 atgaactgtgtttg ccgcctggtc c

15、tggtcgtgc tgagcctgtg gccagataca gctgtcgccc ctgggccacc acctggcccc cctcgagttt ccccagaccc tcgggccgag ctggacagca ccgtgctcct gacccgctct ctcctggcgg acacgcggca gctggctgca cagctgaggg acaaattccc agctgacggg gaccacaacc tggattccct gcccaccctg gccatgagtg cgggggcact gggagctcta cagctcccag gtgtgctgac aaggctgcga gcgg

16、acctac tgtcctacct gcggcacgtg cagtggctgc gccgggcagg tggctcttcc ctgaagaccc tggagcccga gctgggcacc ctgcaggccc gactggaccg gctgctgcgc cggctgcagc tcctgatgtc ccgcctggcc ctgccccagc cacccccgga cccgccggcg cccccgctgg cgcccccctc ctcagcctgg gggggcatca gggccgccca cgccatcctg ggggggctgc acctgacact tgactgggcc gtgaggg

17、gac tgctgctgct gaagactcgg第32頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四/第33頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四第34頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四酶切反應(yīng)操作酶切體系組成：DNA，緩沖液，限制性內(nèi)切酶反應(yīng)條件：適宜溫度（37），1小時以上終止反應(yīng)：加熱，加入EDTA，螯合鎂離子電泳檢查：酶切完全性超螺旋第35頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四3.連接反應(yīng)概念：在連接酶的催化下，將DNA雙鏈上相鄰的3羥基和5磷酸基團共價結(jié)合形成3-5磷酸二酯鍵，使兩條斷開的DNA鏈重新連接起來。 第

18、36頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四連接反應(yīng)操作連接體系：載體片段與基因片段，緩沖液，連接酶連接反應(yīng)：1626，數(shù)小時，或過夜終止反應(yīng)：在70加熱10分鐘第37頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四4. 轉(zhuǎn)化概念：把外源基因?qū)胨拗骷毎倪^程。第38頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四大腸桿菌轉(zhuǎn)化CaCl2法感受態(tài)細胞融化：置冰上，緩慢加入連接反應(yīng)產(chǎn)物：混勻，置冰上30min熱擊：42，90s置冰上，12min擴增培養(yǎng)：加入LB培養(yǎng)基，37，45min涂平板：含有抗生素的LB固體培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)：倒置平板，37，出現(xiàn)菌落。第39頁，

19、共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四5. 篩選與鑒定轉(zhuǎn)化后的細胞類型非轉(zhuǎn)化子：沒有導(dǎo)入外源DNA的非轉(zhuǎn)化宿主細胞轉(zhuǎn)化子：導(dǎo)入外源DNA的轉(zhuǎn)化細胞非重組子：僅含有空載體分子的轉(zhuǎn)化子重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子非目標重組子：連接不正確的重組子目標重組子：含有連接正確的重組子（目的）第40頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四（1）篩選策略與方法基于載體抗生素篩選法抗生素抗性基因氨芐青霉素被Bla基因編碼產(chǎn)物-內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基水解。衛(wèi)星菌落：大菌落具有抑制抗性，周圍產(chǎn)生了相對抗性區(qū)，允許一些沒有抗性的原菌生長。第41頁，共61頁，2022年，5月20日，7

20、點45分，星期四藍白斑篩選-互補原理質(zhì)粒lacZ標記基因，編碼產(chǎn)物為 -半乳糖苷酶N端146aa，無活性，受體。大腸桿菌染色體DNA：編碼C端部分序列，無酶活性，供體。受體與供體結(jié)合，恢復(fù)-半乳糖苷酶的活性，從而將無色X-gal底物水解成藍色產(chǎn)物。有外源基因， 白色菌落；無外源基因， 藍色菌落.第42頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四（2）鑒定方法菌落PCR：含有目標基因載體大小：電泳檢測酶切鑒定：目標基因插入及插入方向測序驗證：目標基因的序列準確無誤，閱讀框通讀。第43頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四6.2.3 表達載體構(gòu)建表達載體設(shè)計目標基因的

21、定位克隆DNA重組篩選與鑒定 這里重點介紹表達載體的設(shè)計（構(gòu)建過程與技術(shù)與目標基因克隆相似）。第44頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四表達載體的設(shè)計表達載體概念：在質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，在多克隆位點處插入外源基因表達盒所構(gòu)成。外源基因表達盒（操縱子模型）：啟動子目標基因終止子第45頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四大腸桿菌lac啟動子受環(huán)腺苷酸（cAMP）激活蛋白（CAP）的正調(diào)控和lac 負調(diào)控。CAP-cAMP復(fù)合物與操縱子結(jié)合，促進了RNA聚合酶與啟動子結(jié)合，開啟基因轉(zhuǎn)錄。lac 形成四聚體，與操縱基因結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄起始。lac操縱子的誘導(dǎo)物：IP

22、TG（異丙基-D-硫代半乳糖苷）等乳糖類似物IPTG與lac 結(jié)合，解除了lac 的阻遏作用，激活基因轉(zhuǎn)錄。LacCAP-BSPromoterOperatorlacZlacYlacATerminatorRNA聚合酶lac糖苷酶，轉(zhuǎn)移酶，透過酶阻遏蛋白第46頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四啟動子功能：啟動子與RNA聚合酶結(jié)合，起始基因轉(zhuǎn)錄最關(guān)鍵的元件：決定著表達的類型和產(chǎn)量序列特點：-35位，TTGACA序列；-10位，TATAAT序列；強啟動子：UP元件第47頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四終止密碼設(shè)計UAA/TAA，UAG/TAG，UGA/TG

23、ATAA：真核和原核，廣泛使用，高效TGA：高效過量表達時，能被tRNAtrp通讀。TGAT可阻止通讀。為了防止通讀，在終止密碼子之后的加強序列，成為四聯(lián)終止密碼子：TAATTAAGTAAA和TAAC第48頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四6.2.4 基因工程菌的建立過程： 適宜宿主菌的轉(zhuǎn)化 篩選鑒定，遺傳穩(wěn)定性等目標： 獲得質(zhì)粒能穩(wěn)定遺傳、基因能高效和定向表達的載體，確保藥物的生物活性。第49頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四表達篩選與產(chǎn)物鑒定不同菌種的表達篩選誘導(dǎo)表達時間和誘導(dǎo)強度的篩選產(chǎn)物存在形式和存在場所的鑒定 -胞外，周質(zhì)，胞內(nèi)；包涵體，可

24、溶性蛋白表達產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與活性鑒定 -電泳，SDS，等電點電泳 -免疫雜交，末端測序，質(zhì)譜分析 -分析與目標產(chǎn)物的同一性第50頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四1、不同菌株的表達能力不同同一菌種的不同轉(zhuǎn)化細胞之間存在表達差異。對宿主菌必需進行篩選目的：獲得最大表達量的菌種對轉(zhuǎn)化細胞的對數(shù)期進行誘導(dǎo)，收集菌體，裂解，提取總蛋白質(zhì)，進行SDS電泳。第51頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四2、不同誘導(dǎo)時間下的表達在不同誘導(dǎo)時間，取樣，電泳隨著誘導(dǎo)時間的延長，表達量增加第52頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四3、蛋白質(zhì)存在形式分析大腸桿菌M109結(jié)果： 在上清，可溶性蛋白質(zhì)可溶性表達第53頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四大腸桿菌DH5結(jié)果：蛋白質(zhì)存在于沉淀中，以包涵體形式表達第54頁，共61頁，2022年，5月20日，7點45分，星期四6.2.5 工程菌構(gòu)建的質(zhì)量控制為了確保工程菌構(gòu)建的有效性，必須遵循GMP及其有關(guān)生物