sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量_第1頁
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文檔簡介

1、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量一、試劑1分離膠緩沖液(1.5 mol/L pH8.8 Tris-HCl):Tris稱取36.3g,SDS200 mg,用150mL水溶解,再加入濃HCI調(diào)節(jié)pH值至8.8,然后加水定容至200 mL2濃縮膠緩沖液(1.0 mol/L pH6.8Tris-HCl):Tris稱取6.04g,SDS100 mg,加40mL水溶解,再量取1 mol/L的HCI 48.0m加入,調(diào)節(jié)pH值至6.8,然后加水定容至100 mL,4330%單體交膠劑(30%Acr-Bis):丙烯酰胺30.0g,甲叉雙丙烯酰胺0.8g,加蒸餾水到100mL,44催化劑:10

2、%過硫酸胺(Ammonium persulfate,簡寫為AP),一般臨用前配制。5加速劑:四甲基乙二胺(TEMED)。6電極緩沖液(pH8.3 Tris-Gly 母液):甘氨酸144g ,Tris 30.3g 和SDS 10.0g,溶解,測定pH值,調(diào)節(jié)至pH8.3,加蒸餾水至1000 mL,4避光保存?zhèn)溆门R用前按1:107樣品處理液(2):Tris稱取12.08 g, 00000000000000000000000000000004g,加60mL水溶解,調(diào)節(jié)pH值至6.8,再量取甘油(丙三醇) 20 mL,吸取-巰基乙醇2 mL,以及稱取溴酚藍(lán)約2 mg加入,然后加水定容至100 mL8染

3、色液:1.25克考馬斯亮藍(lán)R250加甲醇200 mL放置過夜,過濾,再加入300mL甲醇和100mL冰醋酸,定容至1000 mL9脫色液:(1)冰醋酸100ml,甲醇350mL,加水至1000m;(2)0.5% 氯化鈉。五、操作方法1裝板:垂直板電泳槽形式較多,具體的操作不完全相同,可根據(jù)說明書進(jìn)行操作安裝。以小型垂直板電泳槽為例,一般按如下步驟安裝兩塊玻璃板:將兩塊高度相異的電泳玻璃板洗凈,干燥;將兩塊玻璃邊延對(duì)齊平疊,將膠條嵌入玻板之間的空隙;然后插入槽中,用模具嵌緊。2制備凝膠:14%分離膠試劑5%濃縮膠4.1水3.5730%Acr(含Bis0.8%)0.833.81.5M Tris(p

4、H8.8)-1.0M Tris(pH6.8)0.630.02TEMED0.010.0410%AP0.0215ml制2塊膠5ml制2塊膠3樣品處理:在等待濃縮膠聚合時(shí),可對(duì)樣品進(jìn)行處理。取1 mL 待測樣品(注意:樣品蛋白質(zhì)含量適中,不可太濃或太稀,1 mg/mL左右較好)和1 mL樣品處理液混勻,在沸水浴加熱35分鐘。4加樣:將配制好的電極緩沖液母液10倍稀釋,倒入內(nèi)、外槽,并使其漫過內(nèi)槽。將上述處理好的樣品以及標(biāo)準(zhǔn)品蛋白質(zhì)(一般已經(jīng)商家用樣品處理液處理好)用微量進(jìn)樣器或微量注射器分別取10 L的待測樣品和10 L的標(biāo)準(zhǔn)品蛋白(按廠家說明書指示量加入),注入濃縮膠的不同梳孔中。其他梳孔中加入10 L5電泳:將電泳槽與電泳儀相連,接通電源,調(diào)節(jié)電壓,在濃縮膠時(shí)控制電壓為90V,待樣品進(jìn)入分離膠后,將電壓調(diào)為120V。電泳進(jìn)行至樣品中前沿指示劑(溴酚藍(lán))至凝膠底端時(shí),切斷電源。6染色:將電泳完畢后的兩塊玻璃板輕輕分開,取下凝膠,水洗,然后置于染色液中進(jìn)行染色。60染色20min ,7脫色:將染色好的凝膠置于脫色液中進(jìn)行脫色處理,60脫色0.51小時(shí),或室溫過夜,或用0.5% 8凝膠保存:將脫色好的凝膠可置于7%乙酸中進(jìn)行較長時(shí)間的保存。六、注意事項(xiàng)1制膠時(shí)試劑中含有SDS,很容易起泡,應(yīng)謹(jǐn)慎輕輕混勻。2制膠時(shí)避免出現(xiàn)氣泡形成,否則不利于導(dǎo)電,影響電泳和

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