轉(zhuǎn)思路迪博客：慢病毒載體發(fā)展

1、轉(zhuǎn)思路迪博客：慢病毒載體發(fā)展和“簡(jiǎn)單型”逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的設(shè)計(jì)類似，對(duì)慢病毒載體的改造也是基于將其病毒基因組分成三個(gè)載體分別表達(dá)包膜蛋白，病毒包裝蛋白和外源表達(dá)載體。當(dāng)使用慢病毒載體用于臨床基因治療時(shí)，有些系統(tǒng)甚至使用4或者5質(zhì)粒系統(tǒng)以降低產(chǎn)生復(fù)制性病毒（RCR,replicative-competentretrovirus）的可能性從而增加體內(nèi)使用的安全性。與“簡(jiǎn)單型”逆轉(zhuǎn)錄病毒不同的是，慢病毒由于存在輔助蛋白和調(diào)控蛋白，其載體改造涉及更多的對(duì)這些反式作用因子的去除以及相應(yīng)的順式作用元件的改造。第一代慢病毒載體使用三質(zhì)粒系統(tǒng)，將包膜蛋白單獨(dú)置于一個(gè)質(zhì)粒中表達(dá)，包裝載體含有除包膜蛋白編碼基因的全

2、病毒基因組，使用CMV啟動(dòng)基因表達(dá)，并用人胰島素基因的polyA替代3LTR作為加尾信號(hào)，同時(shí)將外源插入片段以及所有相關(guān)順式作用元件（包裝信號(hào)y，LTRs，RRE和引發(fā)結(jié)合位點(diǎn)小8$,primerbindingsite）置于外源表達(dá)載體中。第二代慢病毒載體去除了輔助蛋白編碼基因Vif，Vpr，Vpu和Nef，以減少產(chǎn)生RCR的風(fēng)險(xiǎn)。第三代慢病毒載體則去除了對(duì)Tat和Rev蛋白因子的依賴作用。通過將5LTR中的U3區(qū)替換成CMV，可以消除對(duì)Tat的依賴；通過對(duì)gag-pol編碼基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，可以解除對(duì)Rev的依賴。許多順式作用元件（DNA序歹列）對(duì)病毒的包裝效率影響也很大，比如cPPT和

3、來源于Igk的MAR（matrixattachmentregion）,以及WPRE（土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件），其可以有效幫助mRNA的polyA加尾效率。同時(shí)通過失活3LTR區(qū)的U3區(qū)，可以減少病毒載體整合后對(duì)宿主整合位點(diǎn)附近基因的表達(dá)干擾，而且還可以有助于引入誘導(dǎo)表達(dá)或者組織特異性表達(dá)系統(tǒng)。包膜蛋白表達(dá)載體：慢病毒載體改造中一個(gè)重大突破是將慢病毒自身的包膜蛋白替換成其它病毒的包膜蛋白，尤其是VSV-G。VSV-G包膜蛋白賦予慢病毒載體三個(gè)非常重要的特性：1），穩(wěn)定慢病毒載體顆粒，使得其可以承受超離心的剪切力，因此可以進(jìn)行濃縮，從而可以獲得超高滴度（1011IU/ml）以用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（動(dòng)

4、物實(shí)驗(yàn)和基因治療）；2），其受體為細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸分子，因此極大拓展慢病毒載體的侵染譜系；3），介導(dǎo)慢病毒載體進(jìn)入胞吞途徑，從而使得整個(gè)侵染整合過程減少了對(duì)慢病毒自身輔助蛋白的依賴。當(dāng)然，VSV-G蛋白也有一些缺點(diǎn)：1），用于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，有報(bào)道出現(xiàn)針對(duì)VSV-G蛋白的補(bǔ)體和抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)從而阻礙慢病毒載體的功能發(fā)揮；2），體內(nèi)少數(shù)組織，比如氣管上皮細(xì)胞的頂端面缺乏VSV-G受體，因此攜有VSV-G的慢病毒載體在體內(nèi)對(duì)其侵染性極低。通過使用埃博拉病毒的包膜蛋白可以解決這個(gè)問題，從而使得囊性纖維化疾病的基因治療（其主要靶底是氣管組織）成為可能。因此，顯然為了進(jìn)一步拓展慢病毒載體的侵染

5、范圍，需要開發(fā)和優(yōu)化更多的包膜蛋白。包裝因子表達(dá)載體：去除輔助蛋白因子包裝因子表達(dá)載體表達(dá)除包膜蛋白外的所有包裝和侵染必須的反式作用因子。為避免將此類序列包裝入假病毒顆粒（慢病毒載體），因此包裝因子表達(dá)載體上缺乏順式包裝信號(hào)y和LTR序列，然而仍然保留Rev響應(yīng)元件（RRE,Revresponseelement）序列和剪切供體位點(diǎn)。使用其它啟動(dòng)子，比如CMV或者RSV啟動(dòng)子，以及胰島素基因的polyA加尾信號(hào)序列替代LTR的對(duì)應(yīng)序列，可以使得轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物更加穩(wěn)定，表達(dá)效率更高。和“簡(jiǎn)單型”逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不同的是，除Gag，Pol和Env之外，慢病毒還表達(dá)有其它6個(gè)蛋白因子，包括Vpu、Vpr、Vi

6、f、Nef輔助蛋白和Tat、Rev調(diào)節(jié)蛋白。這些蛋白是HIV-1在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)高速?gòu)?fù)制所必須的因子，同時(shí)還決定了HIV的病原性。某些感染HIV的病人其存活期非常長(zhǎng)，是因?yàn)槠涓腥镜腍IV屬于缺乏這一類輔助蛋白的病毒株。而且，HIV的體外復(fù)制可以不需要Vpu、Vpr、Vif、Nef輔助蛋白的參與。因此，研究人員通過去除這些輔助蛋白，可以達(dá)到即提高安全性又不影響病毒體外輔助的目的。第一代慢病毒載體仍然含有這些輔助蛋白編碼基因。第二代慢病毒載體去除了所有4個(gè)輔助蛋白編碼基因，但仍然保留有Tat和Rev基因。第三代慢病毒載體去除了Tag基因，并將Gag-Pol和Rev分在兩個(gè)質(zhì)粒載體中表達(dá)。這些改造，極大降

7、低了重組產(chǎn)生復(fù)制性病毒（RCR,Replication-competentretroviruse)的概率。而且即使產(chǎn)生了復(fù)制性病毒，也不含有病原性的輔助蛋白因子，因此其致病性概率極大降低。同時(shí)，這些改造并不影響慢病毒載體的包裝滴度，也沒有干擾其侵染特性。極少數(shù)情況下，在使用非慢病毒自身包膜蛋白的情況下，去除輔助蛋白會(huì)降低其侵染效率，比如在缺乏輔助蛋白的情況下使用非VSV-G包膜蛋白會(huì)使得其侵染非活化人淋巴細(xì)胞的能力大大降低，通過使用VSV-G包膜蛋白可以解決這類問題。改造Gag-Pol密碼子偏好性HIV基因組中含有大量的AU序列，使得其密碼子使用有高度偏向性，且轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物極不穩(wěn)定，從而降低Gag

8、-Pol的翻譯效率，并使得其表達(dá)高度依賴Rev蛋白。同時(shí)對(duì)其gag-pol編碼基因的密碼子進(jìn)行人源化改造，可以使得其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)效率大大增加，而且使得其表達(dá)可以不依賴于Rev蛋白，因此可以去除RRE序列。因?yàn)槿嗽椿蟮膅ag-pol基因序列以及不含有RRE序列，這進(jìn)一步極大地降低了慢病毒載體重組產(chǎn)生RCR的可能性。同時(shí)還使得在慢病毒載體中表達(dá)抑制HIV自身基因(gag-pol)的shRNA成為可能，從而開啟了將某一類病毒載體用于針對(duì)同一病毒的基因治療的新途徑。分步表達(dá)Gag和Pol蛋白因子通過分別表達(dá)Gag和Vpr-Pol，可以幾乎完全阻止重組產(chǎn)生RCR。Vpr結(jié)合于Gag-Prot

9、ease的前體p6并介導(dǎo)Vpr-Pol融合蛋白高效包裝入慢病毒載體顆粒。因此理論上，通過將慢病毒基因組進(jìn)行改造，將其包裝，侵染必須蛋白分別置于5個(gè)質(zhì)粒載體上表達(dá)：外源插入片段表達(dá)載體，包膜蛋白（Envelope）,Gag-Protease,Vpr-Pol和Rev。同時(shí)，在對(duì)Gag-Protease和Vpr-Pol的密碼子偏好性進(jìn)行改造后，還可以去除Rev蛋白，使得這一類慢病毒載體在兼具最大的安全性的同時(shí)還能保持很高的滴度和廣泛的侵染率。外源表達(dá)載體：最早使用的外源表達(dá)載體含有慢病毒載體所有的順式作用元件（包裝信號(hào)、反轉(zhuǎn)錄和整合元件）,外源插入片段以及相關(guān)調(diào)控元件（啟動(dòng)子和插入片段）。具體來說，

10、載體N端含有復(fù)制引發(fā)結(jié)合位點(diǎn)，剪切供體位點(diǎn)，包裝信號(hào)，RRE序列和剪切受體位點(diǎn)；異源啟動(dòng)子和插入片段在中間；C端含有PolyA加尾信號(hào)和3端LTR。為了增加安全性，降低重組產(chǎn)生RCR的可能性以及增加表達(dá)效率和豐富調(diào)控表達(dá)方式,研究人員對(duì)外源表達(dá)載體進(jìn)行了一系列改造：1），構(gòu)建SIN載體：由于逆轉(zhuǎn)錄病毒的3端LTR的U3區(qū)在反轉(zhuǎn)錄和病毒DNA復(fù)制時(shí)時(shí)會(huì)被當(dāng)作模板最終生成5端LTR所對(duì)應(yīng)的U3區(qū)，因此如果要去除病毒自身的轉(zhuǎn)錄起始元件使得外源片段發(fā)生不依賴于Tat蛋白的轉(zhuǎn)錄，必須將5端LTR的U3區(qū)替換成異源啟動(dòng)子，同時(shí)去除3端LTR的U3區(qū)的133-400bp含丁人1人盒子和Sp1,NF-kB等轉(zhuǎn)

11、錄結(jié)合位點(diǎn)以及其它增強(qiáng)子的對(duì)應(yīng)序列。改造后的不含這段序列的U3區(qū)會(huì)被復(fù)制轉(zhuǎn)移形成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的5端LTR的新U3區(qū)，所以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中不再含有病毒自身轉(zhuǎn)錄起始元件，因此也就不再依賴于Tat蛋白因子轉(zhuǎn)錄，使得可以在其它質(zhì)粒載體中去除Tat編碼基因。同時(shí)，在整合入宿主細(xì)胞基因組后，還可以減少對(duì)整合位點(diǎn)附近基因的轉(zhuǎn)錄干擾，比如避免激活下游基因(在早期逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中常見，并且是運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行基因治療時(shí)誘發(fā)腫瘤發(fā)生的主要因素)。2)，土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序歹U(WPRE,woodchuckhepatitisvirusposttranscriptionalregulatoryelement)和cP

12、PT(centralpolypurinetract)序列可以極大增加外源片段表達(dá)效率，其機(jī)制仍不明了。3),將HIV-1基因組中的cPPT和cTS(centralterminationsequence)序列置于病毒載體異源啟動(dòng)子的5端可以極大增加對(duì)許多細(xì)胞的侵染效率，比如神經(jīng)元細(xì)胞、造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞和原代T細(xì)胞。這些序列最初認(rèn)為其對(duì)HIV-1的基因組復(fù)制非常重要，但重組慢病毒載體的DNA復(fù)制并不依賴于這些序列，現(xiàn)在認(rèn)為這些序列可以幫助前整合復(fù)合物入核，增加侵染效率。4)，引入誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控元件，比如四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)(Tetracycline-inducibleon/offsystem,TetOn

13、/Off)。其兩個(gè)主要成分：a),四環(huán)素調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活因子(tTA),是四環(huán)素抑制因子和HSV的蛋白因子VP16的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的一個(gè)融合蛋白；b),誘導(dǎo)啟動(dòng)子，含啟動(dòng)子和7個(gè)拷貝的Tet操縱子部分。缺少四環(huán)素時(shí)，tTA結(jié)合并激活誘導(dǎo)啟動(dòng)子。tTA結(jié)合四環(huán)素或者其類似物強(qiáng)力霉素(Doxycline)后，發(fā)生構(gòu)象變化，使得其不再能結(jié)合到Tet操縱子上因此不再能啟動(dòng)基因表達(dá)。在第一代誘導(dǎo)表達(dá)慢病毒載體中，tTA和誘導(dǎo)啟動(dòng)子位于同一個(gè)質(zhì)粒載體中，CMV啟動(dòng)子控制tTA的表達(dá)，3端的誘導(dǎo)啟動(dòng)子調(diào)控外源片段的表達(dá)。第一代誘導(dǎo)調(diào)控慢病毒載體有幾個(gè)問題：a），其包裝滴度比傳統(tǒng)慢病毒載體低5-10倍，但通過濃縮仍然可以