抗菌肽及抗菌分子機理課件

1、抗菌肽及抗菌分子機理07202 張琳琪 馮瑤概述抗菌肽(antimicrobial peptides)是具有抗菌活性短肽的總稱,這些短肽分子量在20007000左右,由2060個氨基酸殘基組成。這類活性肽多數(shù)具有強堿性、熱穩(wěn)定性及廣譜抗菌等特點。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展,抗菌肽已成為近年來分子免疫學和分子生物學的研究熱點。研究的內(nèi)容包括:抗菌肽的分離與提純,氨基酸序列的分析,蛋白質(zhì)構(gòu)型與功能的關(guān)系;抗菌肽的作用機理；應(yīng)用基因工程克隆和表達抗菌肽基因,改造合成抗菌肽基因以及動植物的轉(zhuǎn)抗菌肽基因工程等,其中昆蟲抗菌肽基因工程研究最受重視。這種內(nèi)源性的抗菌肽經(jīng)誘導而合成,在機體抵抗病原體的入侵方面起

2、著重要的作用,被認為是生物非特異性免疫功能的重要防御成分?？咕木哂袕V譜殺菌作用,對某些真菌、原生動物,耐藥性細菌都有殺滅作用,并可選擇性的殺傷腫瘤細胞,抑制乙型肝炎病毒等的復制?？咕牡姆诸惼駷橹箯牟煌矬w內(nèi)誘導獲得的抗菌肽已有200多種,僅從昆蟲體內(nèi)分離得到的就有170余種。根據(jù)結(jié)構(gòu)不同可把抗菌肽分為5類:單鏈無半胱氨酸(Cys)的抗菌肽,或由無規(guī)則卷曲連接的兩段-螺旋組成的肽。該類包括天蠶素Cecropins, Ma-gainins等。Magainins最初是從非洲爪蟾的皮膚中發(fā)現(xiàn)的,它是爪蟾的皮膚在一定的環(huán)境壓力下分泌出的抗感染和促進傷口愈合的成分,由兩個緊密相連的肽鏈組成,每一個

3、肽鏈有23個氨基酸,低濃度便可抑制許多細菌和真菌生長。富含某些氨基酸殘基但不含Cys的抗菌肽。如富含脯氨酸(Pro)或甘氨酸(Gly)殘基的抗菌肽。如從豬腸內(nèi)分離的抗菌肽PR39中Pro含量占49%。鞘翅肽Coleoptericin和半翅肽Hemiptericin的全序中富含Gly。含一個二硫鍵的抗菌肽,該二硫鍵的位置通常在肽鏈C端。如爪蟾皮膚細胞中產(chǎn)生的Brevinins。有兩個或兩個以上二硫鍵,具有-折疊結(jié)構(gòu)的抗菌肽。如綠蠅防御素(Phormindefensin),分子內(nèi)有6個Cys形成3個分子內(nèi)二硫鍵,肽鏈C末段是帶有擬-轉(zhuǎn)角的反向平行的片層。實驗證明,分子中的二硫鍵在其抗菌作用中至關(guān)重

4、要。由其他已知功能較大的多肽衍生而來的具有抗菌活力的肽。31胞膜攻擊作用大多數(shù)抗菌肽基本的作用機制是破壞腫瘤細胞或細菌質(zhì)膜結(jié)構(gòu),引起細胞內(nèi)容物大量滲出,最終導致腫瘤細胞和細菌的死亡,而抗菌肽分子的結(jié)構(gòu)特征是保證上述機制發(fā)揮作用的重要基礎(chǔ)。昆蟲天蠶素的抗菌肽分子是通過其兩親性-2螺旋上的正電荷與細菌細胞膜磷脂分子上負電荷之間的靜電吸引而結(jié)合聚集在質(zhì)膜上,然后抗菌肽分子中的疏水段C端(酰胺基)-2螺旋插入到疏水的細菌細胞膜中央,雙親的-2螺旋留在質(zhì)膜表面,打亂了質(zhì)膜上蛋白質(zhì)和脂質(zhì)原有的排列秩序,使得膜外正電荷增多,超過閾值導致膜去極化。由于抗菌肽分子的-2螺旋是親、疏水兩親性的,所以當抗菌肽分子相

5、互聚集在一起時可形成離子通道,導致陽離子外流,最后細菌失去保護,不能保持正常的滲透壓而死亡。從豬小腸中分離得到的抗菌肽(Cecp) 也是通過膜攻擊來完成對細菌的殺傷,但其C端為羧基而非酰胺基,其抗菌譜也有所不同,其作用機制主要是通過堿性氨基酸與細菌外膜表面的磷脂酰頭部結(jié)合,由于分子的旋轉(zhuǎn)導致Cecp的疏水基與膜的疏水區(qū)結(jié)合,超過閾值時,則在質(zhì)膜上形成瞬時小孔,導致菌體內(nèi)容物溢出,菌體裂解死亡。防御素作用于細胞膜,可增加生物膜的通透性而發(fā)揮作用。在人工脂質(zhì)膜的實驗顯示,防御素作用于膜上形成穩(wěn)定的通道,且具有依賴電壓的傳導特性，因為防御素分子很小,不能以單聚體的形式造成膜穿孔,但防御素分子能以多聚

6、體的形式作用于胞膜。33線粒體攻擊作用Bobek等以人唾液中提取的抗菌肽MUC7作用于臨床常見的真菌、桿菌和球菌,發(fā)現(xiàn)MUC7對真菌和細菌都有很強的殺傷作用。在超微結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)線粒體出現(xiàn)腫脹、空泡化、嵴脫落和不規(guī)則排列,核膜界限不清,有的核破裂,內(nèi)容物溢出。這表明抗菌肽MUC7的作用機制可能與抑制腫瘤細胞呼吸有關(guān)。Chen等也發(fā)現(xiàn)抗菌肽Tachy-plesin的作用機制與抑制線粒體相關(guān)的caspase7和caspase6蛋白有關(guān)。Fehlaum等發(fā)現(xiàn)Thanatin在0. 3 0. 6mol/L時,就對大腸桿菌表現(xiàn)出強烈的殺菌作用。但當其濃度提高到70mol/L時,仍然檢測不到細胞內(nèi)K+的泄漏,

7、提示Thanatin不是通過形成離子通道來殺滅細菌。當利用40mol/L的Thanatin處理細菌時, 1h后可檢測到細胞的呼吸作用變?nèi)?6h后完全停止。因此認為Thanatin通過抑制細胞呼吸作用來殺菌的。34對細胞核染色體的影響以往的研究多集中于抗菌肽對細胞膜的破壞作用,但Hariton等用具有同源性的兩種抗菌肽dermaseptinS4,dermaseptinS4 (13)作用于HeLa腫瘤細胞株,熒光免疫染色發(fā)現(xiàn)S4不能進入到腫瘤細胞內(nèi)部;S4(13)M r較小,可以進入到細胞內(nèi)部,但不能結(jié)合到細胞核上。對其進行氨基酸序列加工改造后獲得的新型抗菌肽PVS4 (13)、RRS4(13)卻

8、具有更強的穿透性,同時也可以結(jié)合到腫瘤的細胞核上。結(jié)果表明,經(jīng)這兩種改造后的抗菌肽作用后的腫瘤細胞DNA出現(xiàn)斷裂,并最終導致死亡,由此推測抗菌肽可以通過直接作用于腫瘤細胞的染色質(zhì)發(fā)揮殺傷作用。35對癌細胞骨架的斷裂作用Chen等研究了天蠶素B、B1和B3的抗腫瘤作用機制,這3種抗菌肽在空間結(jié)構(gòu)和氨基酸序列上存在著一定差異,但又有一定的同源性。通過作用于體外培養(yǎng)的腫瘤細胞發(fā)現(xiàn),3種抗菌肽都可以使細胞的雙分子層發(fā)生溶解,微管崩解,腫瘤細胞皺縮、死亡。并且發(fā)現(xiàn)這種殺傷作用的效率與3種抗菌肽的空間結(jié)構(gòu)和成分密切相關(guān),證實了抗菌肽不僅可以使細胞膜發(fā)生穿孔,而且還可以破壞微管的正常功能,影響細胞骨架的完整性,阻止紡錘絲形成和有絲分裂,進而破壞細胞器,殺傷腫瘤細胞。雖然抗菌肽對腫瘤細胞和正常人體細胞的細胞骨架均有一定損傷,但后者骨架系統(tǒng)完整,修復快,不會造成不可逆損傷。而腫瘤細胞骨架不完整,經(jīng)抗菌肽作用后,得不到及時修復,最終導致死亡?？咕牡膽?yīng)用前景抗菌肽與上皮細胞、吞噬細胞、溶酶體等共同構(gòu)成了機體的非特異性防御系統(tǒng),在體內(nèi)具有直接的殺菌活性。