流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)課件

1、流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)流式細(xì)胞術(shù)的基本概念流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀(guān)，能夠同時(shí)檢測(cè)快速直線(xiàn)流動(dòng)狀態(tài)中的單個(gè)細(xì)胞的多項(xiàng)物理及生物學(xué)特性，加以分析定量的技術(shù)，并且可以對(duì)特定群體加以分選。其中用到的流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer）是集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。在國(guó)外又把流式細(xì)胞儀稱(chēng)為熒光激活細(xì)胞分選器（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS），所以目前大多數(shù)流式細(xì)胞儀機(jī)型都以FACS命名。2流式

2、細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)流式細(xì)胞術(shù)的基本概念流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry分流式細(xì)胞術(shù)的基本特點(diǎn)分析對(duì)象：?jiǎn)渭?xì)胞懸液或生物微粒；分析速度：快速，可高達(dá)104個(gè)細(xì)胞/秒；檢測(cè)參數(shù)：多參數(shù)（散射光參數(shù)、熒光參數(shù)）；可同時(shí)檢測(cè)多種可溶性成分：流式微球芯片技術(shù)（Cytometric Beads Array, CBA）強(qiáng)大的細(xì)胞分選功能：在分析的同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選。3流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)分流式細(xì)胞術(shù)的基本特點(diǎn)3流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)：包括細(xì)胞的大小、顆粒度、表面積、DNA含量及細(xì)胞周期和RNA的含量等。細(xì)胞功能：細(xì)胞表面或胞漿、核內(nèi)的特異性抗原、細(xì)胞因子、受體；蛋白磷酸化、pH值及細(xì)胞鈣例子濃

3、度等。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)范圍4流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)：包括細(xì)胞的大小、顆粒度、表面積、DNA含量及細(xì)胞周流式細(xì)胞術(shù)的優(yōu)勢(shì)目前有多種方法能夠檢測(cè)蛋白的表達(dá)，如免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、免疫組織化學(xué)以及免疫熒光等。它們與流式細(xì)胞術(shù)相比各有側(cè)重。流式細(xì)胞術(shù)：能快速（可達(dá)104細(xì)胞/秒）、定位（胞膜或胞漿）、定量（細(xì)胞的相對(duì)或絕對(duì)計(jì)數(shù)、蛋白的表達(dá)水平）并且高靈敏度和高特異性地檢測(cè)多種活性蛋白的共表達(dá)情況，同時(shí)也是一項(xiàng)可以把具有相同熒光信號(hào)特性的某些細(xì)胞亞群從多細(xì)胞群體中分離和富集出來(lái)的細(xì)胞分析技術(shù)。因此與上述多種生物檢測(cè)方法相比有明顯的優(yōu)勢(shì)。5流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)流式細(xì)胞術(shù)的優(yōu)勢(shì)目前有多種方法能夠檢

4、測(cè)蛋白的表達(dá)，如免疫印酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定：定量檢測(cè)細(xì)胞或組織液中蛋白的表達(dá)，不能體現(xiàn)細(xì)胞或組織定位以及多種蛋白的共表達(dá)情況。靈敏度高，特異性低。免疫組織化學(xué)：能直觀(guān)的定位蛋白在組織中的分布，不能定量。操作步驟多，靈敏度低，假陽(yáng)性率高。免疫熒光：能直觀(guān)體現(xiàn)蛋白的亞細(xì)胞定位，相對(duì)定量，不能同時(shí)大量檢測(cè)多種不同蛋白的共表達(dá)。免疫印跡：定性、相對(duì)定量檢測(cè)細(xì)胞或組織液中蛋白的表達(dá)，不能代表蛋白的天然狀態(tài)、細(xì)胞或組織定位以及兩種以上蛋白的共表達(dá)情況。操作繁瑣，靈敏度低。6流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定：定量檢測(cè)細(xì)胞或組織液中蛋白的表達(dá)，不能體現(xiàn)流式細(xì)胞檢測(cè)樣本的制備：細(xì)胞樣本的處理：組織樣本的處理流式細(xì)

5、胞儀檢測(cè)的信號(hào)：散射光信號(hào)：前向角散射光（Forward scatter， FSC) 與細(xì)胞大小有關(guān)；側(cè)向角散射(Side scatter ，SSC，又稱(chēng)90角散射光）與細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)有關(guān)，對(duì)胞膜、胞質(zhì)、核膜變化更敏感。熒光信號(hào)：特異性熒光信號(hào)是指將熒光素分子耦聯(lián)到特異性抗體或分子上，當(dāng)其與細(xì)胞表面或者胞漿中的抗原結(jié)合后，被特定波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)而產(chǎn)生的信號(hào)； 自發(fā)熒光：個(gè)別的細(xì)胞有著他們各自特異性水平的自發(fā) 熒光（熒光信號(hào)產(chǎn)生于他們自身）。7流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)流式細(xì)胞檢測(cè)樣本的制備：7流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)流式細(xì)胞術(shù)的常用試劑：熒光染料：熒光染料也稱(chēng)熒光素，根據(jù)其應(yīng)用的領(lǐng)域不同主要分為核酸染

6、料和蛋白染料。1.核酸染料：是指能與DNA或與RNA結(jié)合的染料，它們?cè)诩す馄骷ぐl(fā)的發(fā)射光能被檢測(cè)器收集，主要用于檢測(cè)核酸含量以及細(xì)胞周期，也可以與熒光染料兩河應(yīng)用，判斷細(xì)胞的生物學(xué)活性。常用的有碘化丙啶（Propidine Iodide, PI）、DAPI及7-氨基放線(xiàn)菌素D（7-Aminoactinomycin D ，7-AAD）等。2.蛋白染料：蛋白染料有多種，大多數(shù)是與蛋白中的某些氨基酸基團(tuán)形成穩(wěn)定的結(jié)合，如CFSE是最常用的活細(xì)胞染料，也稱(chēng)CFDA-SE或CFDA，它與胞內(nèi)蛋白賴(lài)氨酸側(cè)鏈及可利用的氨基發(fā)生不可逆結(jié)合，隨著細(xì)胞分裂而被減，廣泛用于細(xì)胞體外增殖或是體內(nèi)示蹤等。除此之外，蛋白

7、染料更為廣泛的用途在于標(biāo)記生物大分子，其中主要是抗體。這些抗體與染料結(jié)合以后，形成熒光抗體，與細(xì)胞表面或是胞漿中的抗原特異性結(jié)合后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，從而反映抗原的表達(dá)及分布情況。這類(lèi)染料主要有異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、藻紅蛋白（Phycoerythrin ，PE or R-PE）、別藻紅蛋白（Allophycocyanin ，APC）、多甲藻葉綠素蛋白（Peridinin chlorophyll protein ，PerCP）等等，目前世界上最大的熒光染料生產(chǎn)商當(dāng)屬I(mǎi)nvitrogen旗下Molecular Probes公司。8流式細(xì)胞

8、儀醫(yī)學(xué)知識(shí)流式細(xì)胞術(shù)的常用試劑：8流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)常用熒光染料的特性熒光染料 激發(fā)波長(zhǎng) (nm) 發(fā)射波長(zhǎng)(nm) 用途 顏色FITC 488 525 免疫熒光 綠色PE(RD1) 488 575 免疫熒光 橙色 ECD 488 620 免疫熒光 橙紅PeCy5 488 675 免疫熒光 紅PI 488 620 DNA染色 橙紅PECy7 488 755 免疫熒光 深紅PerCP 488 670APC 633 6709流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)常用熒光染料的特性熒光染料 激發(fā)波長(zhǎng) (nm) 發(fā)5 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5/PC710流式細(xì)胞儀

9、醫(yī)學(xué)知識(shí)5 Color Single Laser (488nm)F流式細(xì)胞儀的工作原理 采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率； 利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測(cè)的靈敏度和特異性； 用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)分析精確性。 11流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)流式細(xì)胞儀的工作原理 采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)（1） 液流系統(tǒng)（2） 光學(xué)系統(tǒng)（3） 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)12流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)（1） 液流系統(tǒng)12流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)液 流 系 統(tǒng)由樣本和鞘液組成待測(cè)細(xì)胞 單個(gè)細(xì)胞

10、的懸液 熒光染料標(biāo)記的單抗對(duì)其染色 受清潔氣體壓力 從樣品管進(jìn)入流動(dòng)室形成樣本流鞘液：輔助樣本流被正常檢測(cè)的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周?chē)３謽颖玖髦屑?xì)胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。13流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)液 流 系 統(tǒng)由樣本和鞘液組成13流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)光 學(xué) 系 統(tǒng) 由激光光源、分色反光鏡、光束成形器、透 鏡組、濾片和光電倍增管組成。數(shù) 據(jù) 處 理 系 統(tǒng)主要由計(jì)算機(jī)和及其軟件（flow cytometry cxp）組成。14流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)光 學(xué) 系 統(tǒng) 由激光光源、分色反光鏡、光束成形器、透 流式細(xì)胞術(shù)基本原理 1. 首先，機(jī)器吸取細(xì)胞混懸液，然后由鞘液包裹，由

11、于鞘液的流速大，所以細(xì)胞混懸液通過(guò)軸流的形式在中央，一般是單個(gè)細(xì)胞排隊(duì)的形式。2. 然后細(xì)胞通過(guò)檢測(cè)窗口。有激光束照射。一般細(xì)胞都經(jīng)過(guò)熒光染色，被激光照射后，會(huì)有不同波長(zhǎng)的激發(fā)光產(chǎn)生。機(jī)器設(shè)有檢測(cè)器來(lái)探測(cè)激發(fā)光的強(qiáng)弱。3. 根據(jù)激發(fā)光的強(qiáng)弱，來(lái)判斷細(xì)胞和染色物質(zhì)的結(jié)合情況，從而得到要檢測(cè)的結(jié)果（比如抗原量，DNA量，等等） 15流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)流式細(xì)胞術(shù)基本原理 1. 首先，機(jī)器吸取細(xì)胞混懸液，然散 射 光 的 測(cè) 量 細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周?chē)?60立體角方向散射的光線(xiàn)信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。16流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)散 射

12、光 的 測(cè) 量 細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周?chē)?向 散 射 光（FS） 前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小角度(0.510)向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比。17流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)前 向 散 射 光（FS） 前向散射光（forward s流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)課件光 散 射 測(cè) 量 的 用 途 測(cè)得的FS與SS信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，可得FS-SS圖，由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。 此為血細(xì)胞分類(lèi)的基本原理，但不能分析表面分子。19流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)光 散 射 測(cè) 量 的 用 途

13、 測(cè)得的FS與SS信號(hào)通過(guò)熒 光 的 測(cè) 量熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同。每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過(guò)波長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開(kāi)，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征。熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量。20流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)熒 光 的 測(cè) 量熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受參 數(shù) 說(shuō) 明FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少21流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)參 數(shù) 說(shuō) 明FS：反映顆粒的大小21流式

14、細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)1.單 參 數(shù) 直 方 圖 由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。22流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)1.單 參 數(shù) 直 方 圖 由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆單 參 數(shù) 直 方 圖細(xì)胞相對(duì)數(shù)量信道(channel )23流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)單 參 數(shù) 直 方 圖細(xì)胞相對(duì)數(shù)量信道(channel )22.雙 參 數(shù) 直 方 圖 雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。 雙參數(shù)信號(hào)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或

15、熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。24流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)2.雙 參 數(shù) 直 方 圖 雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代雙 參 數(shù) 直 方 圖 點(diǎn) 圖綠色熒光強(qiáng)度紅色熒光強(qiáng)度25流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)雙 參 數(shù) 直 方 圖 點(diǎn) 圖綠色熒光強(qiáng)度紅色熒光強(qiáng)度25流（三）設(shè) 門(mén) 分 析 技 術(shù) Gate設(shè)置：指根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群。 根據(jù)門(mén)的形狀又分為了線(xiàn)性門(mén)、矩形門(mén)、圓形門(mén)、多邊形門(mén)、任意形狀門(mén)和十字門(mén)。26流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)（三）設(shè) 門(mén) 分 析 技 術(shù) Gate設(shè)置：指根據(jù)該圖的細(xì)任意門(mén)A 淋巴細(xì)胞B 單核細(xì)胞C 中性粒細(xì)胞27流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)任意門(mén)A 淋巴細(xì)胞27流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)

16、線(xiàn)性門(mén)28流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)線(xiàn)性門(mén)28流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)十字門(mén)十字門(mén)分析時(shí)，由四個(gè)區(qū)閾構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。 D1：CD4+/CD3-D2：CD4+/CD3+D3：CD4- /CD3-D4：CD4- /CD3+29流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)十字門(mén)十字門(mén)分析時(shí)，由四個(gè)區(qū)閾構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+開(kāi)機(jī)注意事項(xiàng)1檢查鞘液桶（充滿(mǎn)3/4狀態(tài)）2檢查廢液桶（如需要，清空）3檢查清洗液4打開(kāi)電源箱門(mén)，檢查并確認(rèn)AIR FILTER和VAC FILTER 必須干燥無(wú)水WATER TRAP 液體不超過(guò)1/3VAC TRAP 液體不超過(guò)1/4SYS VAC 計(jì)量表 讀數(shù)在-17-30之間SYS PRE 計(jì)量表 讀數(shù)在 283230流式細(xì)胞儀醫(yī)學(xué)知識(shí)開(kāi)機(jī)注意事項(xiàng)1檢查鞘液